Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.
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Methodenartikel
Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Goldstandard-Definition einer hämatopoetischen Stammzelle (HSC) ist eine Zelle, die, wenn sie in einen bestrahlten Empfänger übertragen wird, die Fähigkeit hat, die Blutzellproduktion für die Lebensspanne des Empfängers wiederherzustellen. In diesem Protokoll wird erläutert, wie ein funktioneller Assay eingerichtet wird, um die HSC-Kapazitäten von zwei verschiedenen Zellpopulationen, wie z. B. Knochenmark von Mäusen mit zwei verschiedenen Genotypen, zu vergleichen, und wie die Empfängermäuse mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Protokoll verwendet zur Standardisierung HSC-Äquivalente anstelle von Zellsortierung und diskutiert die Vor- und Nachteile beider Ansätze. Darüber hinaus diskutieren wir verschiedene Variationen des Basisprotokolls, einschließlich serieller Transplantationen, limitierender Verdünnungsassays, Homing-Assays und nicht-kompetitiver Transplantationen, einschließlich der Vorteile und bevorzugten Anwendungen dieser verschiedenen Ansätze. Diese Assays sind von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der HSC-Funktion und könnten nicht nur für die Untersuchung grundlegender HSC-intrinsischer Aspekte der Biologie verwendet werden, sondern auch für die Entwicklung präklinischer Assays für die Knochenmarktransplantation und die HSC-Expansion in Kultur.
Einleitung
Hämatopoese ist ein regenerativer Prozess, der das Auffüllen von Blutzellen gewährleistet, dass durch Verletzungen, Strahlung und Zelltod verloren. Dieser Prozess wird von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) gewährleistet, die im erwachsenen Knochenmark weitgehend befinden. Zusätzlich können hämatopoetische Stammzellen für therapeutische Zwecke in Autoimmunerkrankungen, hämatologischen Malignitäten und Immundefizienz 1 verwendet werden. Es besteht somit ein Bedarf nach besser, die Mechanismen zu verstehen, die HSC-Funktion regulieren, einschließlich ihrer proliferative Expansion und ihre Fähigkeit, den Empfängerknochenmark nach der Transplantation zu erreic....
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Protokoll
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der institutionellen Tierethikkommission und folgen dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen.
Hinweis: Um steril / specific pathogen freien Gehäuse Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen alle Verfahren im Zusammenhang mit Direkt Umgang mit lebenden Mäusen in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einem Laminar-Flow-Haube. Reinigen oder sterilisieren Käfige, Haltevorrichtungen, Gehäusematerialien, Futter und Wasser zu den in geeigneter Tiere zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie nur sterile Einweg-Nadeln für die Injektionen und zur Blutentnahme. Aseptische Te....
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Ergebnisse
Eine allgemeine Beschreibung der Wettbewerbs Transplantation Einstellung, einschließlich der sekundären Transplantationen (weiter unten erörtert) in Abbildung 1 zu entnehmen. Eine repräsentative Analyse vor der Transplantation des Knochenmarks HSZ in 2 zu . Nähere Informationen über den Ausschluss von Dubletten zu finden und tote Zellen können an anderer Stelle 9.
Figuren 3<.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die relative Eignung der Spender (Test) HSZ gegen bekannte Wettbewerber HSZ zu bewerten. Die Konkurrenzsituation erhöht die relative Empfindlichkeit des Assays (eher moderate Abnahme der Stammzell Fitness zu erkennen), und stellt eine interne technischen Kontrolle für die Wirksamkeit der Bestrahlung und Injektion. Es sollte jedoch nicht als absolutes Maß für HSC Fitness verwendet werden; nicht gut in der Abwesenheit von Konkurrenz eine Abnahme der Wettbewerbs Rekonsti.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir sind dankbar, dass Roxann Hétu-Arbour für die Unterstützung bei der Abbildung Design und Demonstration der Verfahren. Die Forschung im Labor durch eine Transition Award von der Cole-Stiftung unterstützt wurde, gewähren Discovery-Nr. 419226-2012 aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) und der Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund nicht gewähren. 31377). KMH ist ein Chercheur-Boursier Junior für den Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Microtainer-Röhrchen mit K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G Nadel | BD Spritze | Zur Blutentnahme aus der Unterkiefervene | |
| LabQuake Shaker Drehspieß | Thermo Wissenschaftliche | C415110 | |
| Aufgereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 (Klon 2.4G2, Fc-Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μ g/ml |
| Pe-Cy7-konjugiertes Anti-Maus-CD3e (Klon 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0,25 μ g/ml |
| PE-konjugiertes Anti-Maus-CD19 (Klon 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0,25 μ g/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7-Äquivalent)-konjugiertes Anti-Maus-Produkt GR1 (Klon RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0,25 μ g/ml |
| FITC-Konjugat Anti-Maus CD45.1 (Klon A20) | eBioscience | 11-0453 | 2,50 μ g/ml |
| eFluor450-konjugiertes Anti-Maus-Produkt CD45.2 (Klon 104) | eBioscience | 48-0454 | 1,00 μ g/ml |
| Biotinyliertes Anti-Human-/Maus-CD45R (B220) (Klon RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinyliertes Anti-Maus-CD3e (Klon 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinyliertes Anti-Maus-CD11b (Klon M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinyliertes Anti-Maus-Produkt GR1 (Klon RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinyliertes Anti-Maus-Mittel TER119 (Klon TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0,625 μ g/ml |
| V500 Streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0,5 μ g/ml |
| PE-konjugiertes Anti-Maus-CD117 (Klon 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0,25 μ g/ml |
| PE-Cy7-konjugiertes Anti-Maus-Ly6A/E (Sca1) (Klon D7) | BD Biosciences | 558162 | 0,25 μ g/ml |
| PerCP-eFluor710-konjugiertes Anti-Maus-CD135 (Klon A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0,5 μ g/ml |
| Alexa Fluor 647-konjugiertes Anti-Maus-CD150 (Klon TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0,625 μm; g/ml BD Biosciences und eBioscience führen nicht den gleichen Klon |
| 1 ml Tuberkulinspritze mit 27 G Nadel | BD Spritze | 309623 | |
| 1 ml Tuberkulin Spritze mit 25 G Nadel | BD Spritze | 309626 | |
| 70 μmu; m Zellensieb | BD Falcon | 352350 |
Referenzen
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
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Nachdrucke und Genehmigungen
