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Methodenartikel

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

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DOI:

10.3791/54355

⸱

6. August 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Zusammenfassung

Thymic Auswahl erfolgt in einem einzigartigen und Thymus - Mikro hoch organisierte was zur Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerante T - Zell - Repertoires. In - vitro - Modellen T - Linie Engagement und Entwicklung zu studieren , haben wertvolle Einblicke in diesen Prozess. Jedoch fehlt es diesen Systemen die vollständige dreidimensionale thymic milieu notwendig T - Zell - Entwicklung und sind daher unvollständig Approximationen in vivo Thymus - Selektion. Einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit Modellierung T - Zell - Entwicklung kann durch die Verwendung in situ Modelle überwunden werden , die eine intakte Thymus - Mikroumgebung schaffen , die vollständig Thymus Auswahl der Entwicklung eines T - Zellen unterstützt. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen ergänzen in - situ - Techniken existieren. Thymus-Scheiben, die Integrität der Thymus kortikalen und medullären Regionen erhalten und eine Plattform Entwicklung von überlagerten Thymozyten einer definierten Entwicklungsstadium oder endogener T c zu studierenells innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Aufgrund der Fähigkeit, ~ 20 Scheiben zu erzeugen pro Maus, präsentieren Thymus-Scheiben einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Experimenten. die Vielseitigkeit dieses Verfahren weiter verbessert die relative Leichtigkeit thymic Scheiben und Potential bei der Erzeugung von verschiedenen Thymus Subsets oder andere Zellpopulationen aus verschiedenen genetischen Hintergründen zu überlagern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben, Isolierung und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die durchflusszytometrische Analyse. Dieses System kann auch als auch visualisieren Thymozyten Migration, Thymozyten-stromal Zell-Wechselwirkungen und TCR-Signale mit Thymus Auswahl durch Zwei-Photonen-Mikroskopie assoziiert zu studieren nicht-konventionellen T-Zell-Entwicklung angepasst werden.

Einleitung

T - Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T - Zell - Repertoire 1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T - Zell - Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex - Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) 2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC 2,4. Unreife CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T - Zell - Subpopulationen, die meisten davon sind MHC - Klasse - I-restringierte CD8 + zytotoxische passierenoder MHC - Klasse - II-restringierten CD4 + Helfer einzigen positiven (SP) T - Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor - Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen 1-3 auszuführen.

Zusätzlich zu der Komplexität der T - Zell - Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk 5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion 10 auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung 11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten 13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus - Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen 15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden.

Zur Ergänzung der ex vivo - Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T - Zellentwicklung wurden 17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co - Kultur von Stammzellpopulationen oder T - Zell - Vorläufer mit Stromazellen Notch - Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 - Zellen, hat die Fähigkeit , T - Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren in - vitro - Modell zu unterstützen, Studie T - Zell - Entwicklung 23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden.

Obwohl technisch umständlich, in situ und in - vivo - Modellen von Thymus - Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf in - vitro - Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus - Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus - Stroma - Zellen 18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus - Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T - Zell - Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 + und CD8 + T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur 18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T - Zell - Entwicklung in vivo. Diese in situ und in - vivo - Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden.

Thymus - Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus - Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion 11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus - Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische 34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus - Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus - Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.

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Protokoll

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - Protokolle für alle Tierstudien wurden von der Animal Care Committee am Centre de recherche genehmigt.

1. Die Ernte Maus Thymus für Herstellung von Thymus-Scheiben und Einzelzellsuspensionen

  1. Euthanize die Maus mit CO 2 durch Genickbruch folgte.
  2. In einer Laminar-Flow-Haube, Pin mit der Maus Bauchseite zu einer Dissektion Brett. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Entfernen überschüssigen Alkohols durch Abtupfen mit Gaze ethanol vom Eintritt in den Brusthöhle zu verhindern und um das Gewebe zu beschädigen.
  3. Heben Sie die Haut an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette und einen Schnitt durch die Haut. Erweitern Sie den Schnitt der Haut nach oben in jedem forelimb.
  4. Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt an der Basis des Brustbeins die Membran aus dem Brustkorb zu trennen. Dann schneiden Sie jede Seite des Brustkorbs in Richtung des Schlüsselbeins. Klappen Sie den Brustkorb über in Richtung des Kopfes der Brusthöhle ausgesetzt wird. Die beiden LappenThymus liegen auf der Oberseite des Herzens.
  5. Entfernen Sie das Bindegewebe um den Thymus Lappen mit einer Pinzette, Mikro-Dissektion Schere und / oder scharf gebogenen Schere. Verwenden Sie ein Paar feine Spitze gebogenen Pinzette die einzelnen Lappen zu heben von unten oder über Bindegewebe bleiben.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht den Thymus direkt erfassen.
  6. Legen Sie die Thymus Lappen in einem 15 ml konischen Röhrchen mit PBS und beiseite stellen auf Eis, bis sie benötigt.

2. Agarose Embedding und Vibratom Aufschneiden von Thymic Lobes

  1. Bereiten Sie 4% igen Lösung für die Einbettung durch Lösen von 2 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 50 ml sterilem PBS und microwaving auf eine niedrige Einstellung, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Decken Kolben mit Alufolie und in einem Wasserbad bei 55 ° C bis zur Verwendung.
  2. In einem Gewebekulturabzug, herzustellen vollständigem RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 4 mM L Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin enthält, und 10 & mgr; M2-Mercaptoethanol.
  3. 1,5 ml vollständiges RPMI-1640-Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Zellkulturplatte und legen einen Zellkultureinsatz in jeder Vertiefung. Stellen Sie den Teller zur Seite in einem Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt.
  4. Bereiten Sie einen matschigen Eiswasser-Bad mit Wasser und Eis in einem Eiskübel.
  5. Entfernen Sie vorsichtig alle restlichen Bindegewebe um jede feine Spitze Pinzette Thymus Lappen. Tun Sie dies, während der Thymus Lappen in PBS in einer Gewebekulturschale eingetaucht ist, nach der Übertragung auf ein Gewebe mit PBS getränkten Wischtuch, oder unter einem Binokular.
  6. Lassen Sie die Agarose unter 40 ° C abkühlen, wenn der Kolben nur warm anfühlt ist, zu vermeiden, dass die Gewebe Überhitzung. Gießen des abgekühlten 4% Agarose in eine Gewebeform bis zu einer Höhe von ca. 1 cm.
  7. Verwenden Sie ein Paar Pinzette vorsichtig den Thymus Lappen auf ein Gewebe übertragen wischen und rollen Sie sie vorsichtig, um zu trocknen, ohne das Gewebe zu schädigen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe trocknet vollständig oder es wird aus dem Agarose gleiten während des Schneidens.
  8. Schieben Sie die Lappen in die Agarose und positionieren sie entweder horizontal (zur Erhöhung der Oberfläche jeder Scheibe) oder vertikal (zur Erhöhung der Anzahl der Scheiben) am unteren Ende der Form. Legen Sie die Form in Eiswasser für 5-10 min die Agarose zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
  9. Während dieser Zeit bereiten die Vibratom zum Schneiden von Pufferwanne Montage, die Montage des Objektplatte und Einsetzen des Vibratom Klinge. Legen Sie ein Stück Labor Band auf der Probenscheibe. Sterilisieren Sie die sauber, montiert Arbeitsplatz mit 70% Ethanol.
  10. Nachdem die Agarose erstarrt, invertieren die Form und drücken Sie sanft in seiner Mitte die Agarose eingebettet Lappen freizugeben.
  11. Mit einem scharfen Messer die überschüssige Agarose rund um die Lappen zu verlassen ~ 2 mm Agarose zu trimmen auf jeder Seite und ~ 0,5 cm an der Unterseite.
  12. Sichern Sie sich Agaroseblock mit einem Tropfen Gewebekleber auf das Stück Klebeband auf der Probenscheibe. Mehrere Blöcke können auf das Band geklebt werden.
  13. Richten Sie die Vibratom Klinge with die Spitze des Agaroseblock. Füllen Sie den Pufferwanne mit sterilem PBS, bis die Klinge und Agarose-Block (s) vollständig eingetaucht sind.
  14. Abschnitt die Agarose eingebetteten Gewebeschnitten mit einer Dicke von 400 bis 500 & mgr; m zu erhalten. Stellen Sie die Vibratom bis 0.225 mm / s Geschwindigkeit, Frequenz von 100 Hz und 5 ° Winkel.
  15. Verwenden Sie einen gebogenen Spatel die Thymus-Scheiben in eine Gewebekulturplatte mit steriler PBS zu sammeln, wie sie geschnitten werden. Entsorgen Sie die erste und die letzte Scheibe.
  16. Untersuchen Sie die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wählen Sie die Scheiben mit intakten Thymusgewebes und umgebende Agarose (1A).
  17. Übertragen Sie die Scheiben auf der Platte vorbereitet in Schritt 2.3 durch eine Pipettenspitze vorsichtig die Thymus-Scheibe aus dem gebogenen Spatel auf die Zellkultureinsatz zu gleiten. Jeder Einsatz kann ~ 3 Scheiben aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben berühren einander nicht oder die Zellkultureinsatz Wände.
  18. Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C, bis sie benötigt.
3. Herstellung von Thymozyten zum Umlegen

  1. Isolieren thymic Keulen wie in 1 beschrieben die Lappen Dissociate manuell eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer sterilisierten 15 ml Gewebemühle mit 5 ml steriler PBS, enthaltend 2% FBS gefüllt zu machen. Übertragen, um die Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen.
  2. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x ACK - Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA) bei Raumtemperatur für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren.
  3. Das Rohr wird bis 15 ml mit PBS 2% FBS enthält. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C.
  4. Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS, enthaltend 2% FBS und Pass-Zellen durch ein 255 & mgr; m-Mesh-Filter.
  5. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspendieren des Zellpellets in PBS, enthaltend 2% FBS bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen pro ml.
  6. Beschriften Sie die Zellen mit Zellfarbstoffe wie Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) nach Herstellerprotokolle, wenn nicht Thymozyten von Mäusen, die congenic Markern oder genetisch fluoreszierenden Reporter codiert zu unterscheiden von Scheibe körpereigenen Zellen.
  7. Nach dem letzten Waschen der markierten Zellen, Zellpellet in komplettem RPMI-1640 - Medium bei 1-3 x 10 6 Zellen pro 15 ul.

4. Übereinander Thymozyten auf den Thymus Scheiben

  1. rund um die Thymus-Scheiben auf dem Einsatz Verwenden Sie eine Pipette jede Flüssigkeit abzusaugen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, zu vermeiden, die Agarose zu beschädigen. Wenn die Agarose beschädigt wird, werden die überlagerten Thymozyten nicht durch den Verlust von Oberflächenspannung der Schichtoberfläche anschließen.
  2. Ohne die Scheibe mit der Pipettenspitze berühren, Overlay 15 ul Thymozyten in Abschnitt 3 hergestellt, auf jede Thymus in Scheiben schneiden.
  3. Inkubieren Sie die plate bei 37 ° C für 2 h, damit die Zellen in die Thymus-Scheiben zu migrieren.
  4. Nach 2 Stunden, spülen Sie die Thymus-Scheiben 3-mal mit 1 ml PBS Überschuss überlagertem Thymozyten zu entfernen, die noch nicht in das Gewebe gewandert sind.
  5. Die Platte bei 37 ° C, bis die Thymus-Scheiben bereit sind, geerntet werden, in der Regel 1-72 Stunden je nach Experiment.

5. Die Dissoziation von Thymic Scheiben für die Durchflusszytometrie

  1. Bereiten Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für jede Scheibe durch Zugabe von 150 ul PBS, das 2% FBS.
  2. 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS auf das Gewebekultureinsatz mit den Thymus Scheiben und sanft rühren mit einem gebogenen Spatel die Scheiben von der Oberfläche der Zellkultureinsatz zu lösen.
  3. Übertragen Sie die Scheibe aus dem Einsatz auf dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gebogenen Spachtel.
  4. Manuell stören die Scheibe ein Mikrozentrifugenröhrchen Probe zerstoßen. Zugabe von 150 & mgr; l PBS, enthaltend 2% FBS auf ein Endvolumen von 300ul.
  5. Filtern Sie das dissoziierte Gewebe durch ein 40 um-Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Die gefilterten Zellen sind bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse gefärbt werden 40.
  6. Filterzellen ein zweites Mal, bevor sie auf einer Flussdurchlass Zytometer um sicherzustellen, daß all die Agarose entfernt und verstopft nicht Durchflusszytometers.
  7. Erwerben Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer und Analyse von Daten , wie zuvor 40 beschrieben wurde.

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Ergebnisse

Thymus slices Unterstützung Analyse verschiedener Aspekte der T-Zell-Entwicklung, wie beispielsweise positive und negative Selektion. Für eine erfolgreiche Versuche, die Qualität des Thymus-Scheibe von größter Bedeutung. Somit sollte thymic Scheiben untersucht werden , um die Integrität des Thymusgewebe zu gewährleisten , und dass die Agarose die Thymus - slice (1a Abbildung) intakt umgibt. Oberflächenspannung kann beeinträchtigt werden, wenn die Agaro...

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Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben und repräsentative Ergebnisse effizienter positive und negative Selektion von überlagerten Vorselektion MHC-Klasse-I-restringierten TCR transgene Thymozyten durch Durchflusszytometrie. Dieses System wurde mit ähnlichem Erfolg verwendet , um eine positive Selektion von MHC - Klasse - II-restringierte CD4 + T - Zellen von Vorselektion DP Thymozyten 32 und, in Gegenwart von Agonist - Antigen, negative Selektion und thymic T

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Marilaine Fournier für ihre Kommentare zum Manuskript und Josée Tessier für die technische Unterstützung. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175 wurden über das NIAID Exchange Program, NIH, bezogen. Diese Forschung wird durch einen Zuschuss der SickKids Foundation und des CIHR-IHDCYN (NI15-002), einen Betriebskostenzuschuss des CIHR-III (MOP-142254) und Startkapital des FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) und der Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation an HJM unterstützt. HJM ist Junior 1 Scholar des FRQS, CIHR New Investigator (MSH-141967) und Preisträger des Cole Foundation Early Career Transition Award.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VibratomeLeica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG AgaroseLonza50080mit niedriger Schmelztemperatur
(abgeschnitten - T12)Polyzienzen1898622 mm x 22 mm quadratisch, abgeschnitten auf 12 mm x 12 mm
Doppelschneidige VorbereitungsklingenPersonna74-0002
Gewebekleber3M 1469SB
0,4 & Mikro; m Zellkultur-Einsätze BD Falcon353090Von mehreren getesteten Marken, diese hielten die Zellen auf den Scheiben am besten
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisher21600-010
RPMI-1640 mit L-GlutaminWisent350-000-CL
Fötales RinderserumWisent080-110Hitzeinaktiviertes
L-Glutamin, 200 mMWisent609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoethanolAlfa AesarA15890
15 ml Tenbroeck Tissue GrindersWheaton357426
Nylon Mesh FilterKomponentenversorgungU-CMN-255
Mikrozentrifugenröhrchen ProbenstößelBel-ArtF19922-0000
40 & Mikro; m Nylon ZellsiebBD Falcon352340
Pinzette Inox SpitzeDumont RS-5047Gebogene Pinzette mit feiner Spitze, Größe .17 x .10 mm
MikropinzetteDumont RS-5090 
Agarose-Einbettungsform

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