Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Zusammenfassung

In mehrzelligen Organismen lösen sekretierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis der parakrinen Signalübertragung aus. Insert-Co-Kultursysteme bieten eine einfache Möglichkeit, die Veränderungen zu beurteilen, die durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden.

Zusammenfassung

Die Rolle von sezernierten löslichen Faktoren bei der Modifikation zellulärer Reaktionen ist ein wiederkehrendes Thema in der Erforschung aller Gewebe und Systeme. In dem Versuch, die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen zellulären Subtypen, aus denen sich mehrzellige Organismen zusammensetzen, zu verdeutlichen, wurden In-vitro-Techniken entwickelt, die den Forschern helfen, ein detailliertes Verständnis einzelner Zellpopulationen zu erlangen. Bei einer dieser Techniken werden Einsätze mit einer durchlässigen Membran verwendet, die es den sezernierten löslichen Faktoren ermöglichen, zu diffundieren. So kann eine Population von Zellen, die in Inserts gezüchtet wurden, in einer Vertiefung oder Schale, die einen anderen Zelltyp enthält, co-kultiviert werden, um zelluläre Veränderungen nach parakriner Signalübertragung in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu bewerten. Solche Insert-Co-Kultursysteme bieten verschiedene Vorteile gegenüber anderen Co-Kulturtechniken, nämlich bidirektionale Signalübertragung, konservierte Zellpolarität und populationsspezifische Detektion zellulärer Veränderungen. Neben ihrer Verwendung im Bereich der Entzündung, des Krebses, der Angiogenese und der Differenzierung sind diese Co-Kultursysteme von größter Bedeutung für die Erforschung der komplizierten Beziehungen, die zwischen den verschiedenen zellulären Subtypen im Zentralnervensystem bestehen, insbesondere im Zusammenhang mit der Neuroinflammation. Dieser Artikel bietet allgemeine methodische Richtlinien für den Aufbau eines Experiments, um zelluläre Veränderungen, die durch sezernierte lösliche Faktoren vermittelt werden, unter Verwendung eines Insert-Co-Kultursystems zu bewerten. Darüber hinaus wird ein spezifisches Protokoll zur Messung der neuroinflammatorischen Wirkungen von Zytokinen, die von Lipopolysaccharid-aktivierten N9-Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen sezerniert werden, detailliert beschrieben, was ein konkretes Verständnis der Insert-Co-Kultur-Methodik bietet.

Einleitung

Die Untersuchung von Geweben, Organen oder Systemen in vitro ist ein Versuch , die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zellsubtypen bestehenden zu vereinfachen , die mehrzellige Organismen umfassen. Tatsächlich in - vitro - Studien ermöglichen es , ein detailliertes Verständnis der einzelnen Zellpopulationen zu erwerben. Es gibt zwei Hauptvorteile von in vitro Experimenten Durchführung: 1) zellulare Wechselwirkungen reduziert, und 2) die Fähigkeit, leicht die zelluläre Umgebung manipulieren. Daher haben diese beiden Vorteile erlaubt, das Verhalten von spezifischen Zelltypen in vivo vorherzusagen, zu der Fähigkeit führen Ergebnisse der extrinsischen Einflüsse in ganzen Organismen zu regulieren. In diesem Sinne arbeitet in - vitro - Zellkultur oft als Brücke zwischen Grund- und Lebenswissenschaften angewendet. Dennoch gibt auch mehrere Nachteile der Arbeit in vitro sind, die wichtigste ist , daß eine gewisse Vorbehalte in der physiologischen wohnenal Relevanz der beobachteten Phänotypen. Tatsächlich, wenn ein Zelltyp ist, in einem Gefäß aufgewachsen, die Kultur verliert, in unterschiedlichem Umfang, dessen Zell-Zell-Verbindungen mit anderen Zelltypen, ihren Beitrag zur humoralen Umgebung aus dem Gewebe und Herkunftsorganismus und den Anker innerhalb das Gewebe, das es ermöglicht, eine bestimmte dreidimensionale Struktur manchmal entscheidend für die Zellfunktion aufrecht zu erhalten.

Die Frage nach der Zell-Zell-Beziehungen wurde durch die Entwicklung der Mischkultur-Techniken gerichtet. In diesem Verfahren werden zwei oder mehr Zellpopulationen miteinander in dem gleichen Kulturgefäß gezüchtet. Allerdings tragen diese Mischkulturen wichtige Nachteile. Einerseits nicht physisch miteinander in dem Ursprungsgewebe und verlassen sich ausschließlich auf parakrine Kommunikations getragen von sezernierten löslichen Faktoren und in der Nähe Rezeptoren interagieren einige Zellsubtypen. Dies ist der Fall für mehrere entzündliche Prozesse, die auf proximalen Cytokine Signaling abhängen. In gemischten cultures, physikalische Wechselwirkungen sind unvermeidbar und es unmöglich machen, parakrine Kommunikation in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakte zu studieren, die veränderten Ergebnisse liefern kann. Auf der anderen Seite wird, ohne die Verwendung von ätzenden Trenntechniken undurchführbar zellspezifische Interpretationen aus einer gemischten Population zu erzielen, die deutlich Ergebnisse beeinflussen könnten.

Um diese wichtige Probleme zu lösen, wurde die Verwendung von konditionierten Medien wurden als eine Technik entwickelt, so dass für compartmentalized Kulturen und das Studium der parakrinen Signalisierung. Dieses Verfahren erfordert den Transfer des Überstands eines Zelltyps, so konditionierte Medium benannte in die Vertiefungen einer anderen Population von Zellen enthält. Noch ein wichtiger Nachteil ist, dass kurzlebige Moleküle überleben nicht lange genug in dem konditionierten Medium zu den Vertiefungen der zweiten Population von Zellen zu übertragen. Auch langlebige Moleküle stark im Laufe der Zeit wird durch Diffusion verdünnt. Außerdem sind sowohl ZellPopulationen teilnehmen nur in einer Richtung parakrine Kommunikation statt in aktive bidirektionale Kommunikation. Dies führt zur Abwesenheit von Rückkopplungssignalisierung , die in Neuer genaue vielzelligen Beziehungen wichtig ist , da sie in vivo existieren.

Als Folge und durch die Notwendigkeit , in der in vitro Zellumgebung haben , um besser simulieren die ursprünglichen in - vivo - Bedingungen angetrieben wird , mehrere Fortschritte in der Zellkulturtechniken wurden im Lauf der Jahre erreicht. Einer der bedeutendsten Fortschritte hat Kompartimentierung Zellkulturen, die Verwendung von durchlässigen Träger mit mikroporösen Membranen wurden zum ersten Mal von Grobstein 1953 ¹ verwendet. Solche permeable Träger über die Jahre zugeschnitten wurden zahlreiche Zelltypen zu unterstützen und zu verwende in verschiedenen Anwendungen. Heute existieren diese Träger als Hohl Einsätzen, die in den Vertiefungen von einer Multi-Well-Gewebekulturplatte ruhen sollen oder in circular Speisen. In einem Co-Kultursystem, enthält der Einsatz einen Zelltyp , während die Vertiefung oder Schale enthält die anderen Zellpopulation, um den Beitrag von zwei verschiedenen Populationen von Zellen auf ihrer humoralen Umgebung zu studieren ermöglicht (Figur 1). Als Ergebnis erhalten bleibt Zellpolarität (basolaterale vs apikal Sekretion oder Signalempfang), so dass Einsatz Co-Kultur-Systeme einen wichtigen Vorteil gegenüber Mischkulturen und konditioniertes Medium Techniken verleihen. Verschiedene Arten von Membranmaterialien zur Verfügung, die gebräuchlichsten sind Polyester (PET), Polycarbonat (PC) oder Polytetrafluorethylen (PTFE) mit Kollagen beschichteten und sie existieren in verschiedenen Porengrößen von 0,4 & mgr; m bis 12,0 & mgr; m reichen. Diese Sorten von Materialien und Porengrößen bieten ein Spektrum von Einsätzen variable relevanten Merkmale optischen Eigenschaften, Membrandicke und Zellhaft ausübt, die sie praktisch auf unterschiedlichen Ebenen für den folgenden machen Verwendungen nicht beschränkt auf:
-studyingZelldifferenzierung, die embryonale Entwicklung, Tumormetastasen und Wundreparatur durch chemotaktische Assays durchlässige Membranen;
-Bewertung Wirkstoffpenetration durch den Transport durch epitheliale oder endotheliale Monolayern Beurteilung kultiviert auf durchlässigen Träger, und;
-Beim Ausführen Zelle Kokulturen Modulationen Zellverhalten, induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu analysieren.

Der Zweck dieses Artikels ist allgemeinen methodischen Richtlinien beschreiben die dritte Funktion oben angegeben zu erfüllen, die die zelluläre Veränderungen von sezernierten löslichen Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelt zu bewerten ist. Mehrere verschiedene Forschungsbereiche nutzen Einsatz Co-Kultursystemen, um Fragen, die die Wirkung von sekretierten löslichen Faktoren auf Populationen von Zellen zu beantworten. Tatsächlich parakrine Signalisierung, die auf verschiedenen Ebenen Zellverhalten moduliert ist relevant in allen Gewebenund Systeme, die Insert-Co-Kultursystemen macht unentbehrliche Fortschritte in diesen Bereichen zu gewährleisten. Umgekehrt kann die Verwendung von Einsätzen, welche die Signaltransduktion bestätigen ist durch direkte Zell-Zell-Kontakt und nicht durch sekretierte Faktoren. Eine der wichtigsten Anwendungen von Einsätzen ist in Entzündungsstudien ^2-14 , wo der Effekt von sekretierten Zytokinen in verschiedenen zellulären Immunität Spieler ausgewertet wird. Insbesondere hat die Untersuchung der Entzündung im zentralen Nervensystem (ZNS) profitiert sehr von Insert Kokultur Studien, die besser erlaubt haben , die zu dem unterscheidbaren parakrine Funktionen von Neuronen und Mikroglia Definition in ^15-21 neuroinflammation fahren. Diese Systeme wurden auch die entzündungshemmende Potential von Molekülen zu untersuchen entwickelt , die auf ihrer Fähigkeit beruht zu verringern oder die Sekretion von entzündungsfördernden Faktoren ^22-26 hemmen. Betreffend Forschung insbesondere zur Krebs ^27-31, die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese ^32-34 und inflammatiauf ^35-42 in tumorigenesis, profitiert auch von Insert - Co-Kultursystemen. Darüber hinaus sind lösliche Faktoren von zentraler Bedeutung in den Prozessen , die verwendet wurden Einsätze Differenzierung und mehrere Studien treiben ^43-50 Fragen in diesem speziellen Bereich zu beantworten. Im ZNS, wie Nervengewebe zu sehen , hat eine sehr begrenzte Erneuerungspotential, das Studium der neurotrophism und Neuroprotektion ist von grundlegender Bedeutung und ^51-56 durch die Verwendung von Stammzellen in Kokultur Systemen weit sichergestellt ist. Darüber hinaus Einsätze sind auch in so unterschiedlichen Bereichen wie der Nephrologie ^57,58, endotheliale Wechselwirkungen und Angiogenese ^59-62, Apoptose Signalgebung ^63-65, Entzündung bei Adipositas und metabolisches Syndrom ^22,23,66-67, Innenohrhaarzellschutz genutzt ^68,69 und sogar in Pilz Virulenz ^70,71 und Parasitologie ^72,73.

Dieser Artikel bietet allgemeine methodische Leitlinien, um eine Experim einzurichtenent angesichts von sezerniert löslichen Faktoren unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelte zelluläre Veränderungen zu bewerten. Insbesondere werden wir unsere Aufmerksamkeit auf die Nervenzelle Co-Kulturen und deren Anwendung bei der Untersuchung neuroinflammatorische Prozess konzentrieren. das sehr breite Spektrum von Experimenten gegeben, die Piloten ermöglichen, einfügt, ist es unerträglich, jeden Aspekt dieser Zellkulturtechnik zu decken. Als Beispiel für ein bestimmtes Protokoll die Wirkungen von Zytokinen sezerniert messen Lipopolysaccharid (LPS) -aktivierten wird N9 Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen detailliert, ein konkretes Verständnis der Einsatz Kokultur Methodologie bietet.

Protokoll

NB: Jeder der folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, wie für Säugetierzellkultur erforderlich. Darüber hinaus gelten die allgemeinen Richtlinien für die optimale sterile Zellkultur, z. B., Tipps jederzeit verwerfen sie zu Kreuzkontaminationen führen kann, die Verringerung der Menge an Zeit , Zellen der Luft ausgesetzt werden , wenn ganze Medienwechsel durchführen, richtig , aber vorsichtig alle Rühren Zellsuspensionen ihre homogene Pipettieren, um sicherzustellen, etc. Darüber hinaus Einsätze eine Art von Plastikmaterialien, die eine besondere Behandlung erfordern. Erstens, wenn Einsätze manipuliert werden, vermeiden die zerbrechliche Membran berührt, die sich leicht reißt und damit das Experiment gefährden könnten. Auch ist es nicht geeignet Vakuumabsaugung des Zellkulturmedium durchzuführen, da die Gefahr der Perforation der Membran oder Dissoziieren adhärenten Zellen ist. Als nächstes hängen Einsätze lose in der Multi-Well-Gewebekulturplatte und somit Vorsicht, wenn mo eingesetzt werden müssenving die Kunststoffgeschirr oder wenn dissoziierenden anhaftenden Zellen zu vermeiden Pipettieren. Zusätzlich wird, wenn Einsätze mit großen Porengrößen verwendet werden, ist es eine Möglichkeit, dass das Zellkulturmedium durch die Membran eindringt, und daher ist es wichtig, das Niveau der Flüssigkeit häufig überwachen. Schließlich ist zu beachten, dass das folgende Protokoll für adhärente Zellen konstruiert und erfordert geringen Modifikationen, um für Suspensionszellen geeignet.

1. Allgemeine Richtlinien für die Durchführung von Einsatz Co-Kultur-Experimente

1. Seeding Zelltyp # 1 in Einsätze
   1. Packen Sie die Einsätze aus der Verpackung.
   2. Legen Sie die Einsätze in einem leeren Multi-Well-Gewebekulturplatte von der richtigen Dimension. Dazu greifen die oberste Kante des Einsatzes mit einer Pinzette.
   3. Um die Anlage zu verbessern und die Verbreitung von anhaftenden Zellen, bedingen die Einsätze mit Zellkulturmedium vor der Aussaat. Dazu deckt die gesamte Oberfläche der Membran mit Zellkultur medium mit einer Mikropipette.
      HINWEIS: Tun Sie dies für so viele Einsätze wie erforderlich.
   4. Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation für mindestens 1 Stunde oder O / N unter den gleichen Bedingungen ( in der Regel 37 ° C, 5-10% CO _2).
   5. Wenn die Einsätze bedingt sind, entfernen alle Zellkulturmedium mit einer Mikropipette. Entsorgen Sie das verwendete Medium.
   6. Seed Zelltyp # 1 in frischem Zellkulturmedium in der gleichen Weise wie in einer Multi-Well-Platte. Dazu ziehen so, ein geeignetes Volumen der Zellsuspension mit einer Mikropipette und verzichtet die Flüssigkeit im Einsatz.
      HINWEIS: Bereiten Sie so viele Einsätze wie erforderlich.
   7. Nach der Aussaat alle Einsätze, schaukeln sanft die Platte links und rechts, dann hin und her, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie kreisförmige Bewegungen zu machen, da dies die Zellen bewirkt, dass in der Mitte der Einsätze zu akkumulieren.
   8. Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation, wie nach zellulären Anforderungen angegeben (in der Regel 37 ° C, 5-10% CO _2).
2. Seeding Zelltyp # 2 in Multi-Well-Gewebekulturplatten
   1. Seed Zelltyp # 2 in frischem Zellkulturmedium gemäß § 1.
   2. Bereiten so viele Vertiefungen wie für die Anzahl der Einsätze erforderlich. Rock die Platte wie in Schritt 1.1.7), um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt.
   3. Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation unter den gleichen Bedingungen ( in der Regel 37 ° C, 5-10% CO _2).
3. Erfrischende Medium in Einsätze
   1. Mit einer Mikropipette, entfernen einen Teil oder die gesamte Zellkulturmedium, in den Einsätzen enthaltenden Zelltyp # 1. Entsorgen Sie das verwendete Medium.
   2. Zeichnen Sie ein entsprechendes Volumen an frischem Zellkulturmedium. die Spitze an der Innenwand des Einsatzes sanft ruhen und langsam die Zellkulturmedium verzichtet werden kann.
   3. Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation gemäß Schritt 1.1.4.
4. Erfrischende Medium in Multi-Well-Gewebekulturplatten
   1. Mit Hilfe eines MICROPIPette, einen Teil oder alle Zellkulturmedium in den Vertiefungen, die Zelltyp # 2 zu entfernen. Entsorgen Sie das verwendete Medium.
   2. Zeichnen Sie ein entsprechendes Volumen an frischem Zellkulturmedium. Ruhen die Spitze an der Innenwand des Schachts und abzugeben langsam das Zellkulturmedium.
   3. Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation nach vorher etablierten Zellkulturprotokolle.
5. Übertragen Einsätze Zelltyp # 1 bis Multi-Well-Gewebekulturplatten, enthaltend Zelltyp # 2.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt, wenn beide Zelltypen die entsprechende Wachstumsstadium erreicht haben.
   1. Vor der Einsätze in die Vertiefungen übertragen, nehmen Sie alle notwendigen Änderungen Medium, wie dies zuvor in den Schritten 1.3) und 1.4).
      HINWEIS: An diesem Punkt ist es wichtig, die entsprechenden Volumina der Medien in den beiden Kammern zu verzichten, wie durch den Einsatz Anweisungen des Herstellers angegeben.
   2. Mit einer Pinzette greifen die oberste Kante eines Einsatzes enthält Zelle typ 1 # und vorsichtig in die entsprechende Vertiefung mit Zelltyp # 2 einzustufen.
   3. Nachdem alle Einsätze übertragen, überprüfen Sie das Vorhandensein von Luftblasen unter der Membran von Einsätzen.
      HINWEIS: Luftblasen verhindern jeglichen Austausch über die Membran des Einsatzes und können das gesamte Experiment gefährden.
   4. Wenn Luftblasen vorhanden sind, heben Sie sehr vorsichtig, den Einsatz von den gut mit einer Pinzette und zurück in die Zellkulturmedium stürzen. Die Blasen werden verschwinden. Wenn sie noch vorhanden sind, versuchen sanft Einsätze wieder in das Zellkulturmedium in einem Winkel eintaucht.
      HINWEIS: Verwenden Sie klopfen nicht oder Einsätze rühren anhaftenden Zellen zu vermeiden, distanziert.
   5. Nach dem Entfernen der alle Luftblasen und Überprüfung, dass die Volumina der Medien in den beiden Abteilen, auf der Platte des Deckels legen und inkubieren.
6. Refreshing Medien in einem Co-Kultursystem
   Hinweis: Obwohl die Membran leicht Medienaustausch zwischen dem Einsatz und auch ermöglicht, das Aktualisieren des Mediums erfolgt inbeide Fächer seit der Zeit allein ziemlich lang sein kann, zu erreichen Gleichgewicht in der oberen und unteren Kammern durch Diffusion erforderlich.
   1. Refreshing Medium in Inserts enthalten Zelltyp # 1 wird in der gleichen Weise wie in Schritt 1.3).
   2. So aktualisieren Sie Medium in Vertiefungen, die Zelltyp # 2, schieben Sie den Einsatz an der Seite einen Raum breit genug zu schaffen, um eine Pipettenspitze aufzunehmen. Aktualisieren Sie das Medium wie in Schritt 1.4).
   3. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Luftblasen und überprüfen Sie die Volumina gemäß Schritt 1.5.3) bis 1.5.5).

2. Beispiel: Messung der Wirkungen der Cytokine sezerniert durch LPS-aktivierte Mikroglia N9 auf neuronale PC12 - Zellen

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind für bestimmte Kolben ausgelegt, gut und Parabolgrößen. Jedoch kann das Protokoll für alle Kunststoffgeschirr Dimensionen angepasst werden. Für die Medien und die Zusammensetzung siehe Materialien Tabelle.

1. Säen und Differenzierung PC12-Zellen in MultiWell-Gewebekulturplatten
   1. Warm Routine PC12 Zellkulturmedium, PC12 Differenzierungsmedium und Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad.
   2. Verwenden Sie PC12 - Zellen bei 60-80% Konfluenz aus einem 75 cm ² Kolben.
   3. Mit einem 15 mm Pasteur-Pipette, führen Vakuumabsaugung des gesamten Zellkulturmedium in den Kolben.
   4. Spülen Sie vorsichtig die Zellschicht mit 5 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pasteur-Pipette. Seien Sie vorsichtig, nicht Zellen in diesem Schritt zu distanzieren.
   5. Decken Sie die Zellschicht mit 3 ml Trypsin-EDTA und Inkubation für 2-3 min bei 37 ° C.
   6. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen unter einem Mikroskop abgelöst werden. Wenn nur sehr wenige Zellen schweben, für maximal 5 Minuten für einen längeren Zeitraum inkubiert.
   7. 10 ml Routine PC12 Zellkulturmedium, um die Trypsin-EDTA zu inaktivieren.
   8. Mit einer 10 ml Pipette, verreiben sanft gleichzeitig aber dafür sorgen, dass die meisten Zellen vom Boden gelöst sind of den Kolben. Vermeidung von Luftblasen in der Zellsuspension zu schaffen.
   9. Mit dem gleichen 10 ml Pipette die Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen.
   10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 3.200 xg
   11. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette Pasteur, während darauf geachtet nicht das Pellet zu stören.
   12. 10 ml Routine PC12 Zellkulturmedium mit einer 10 ml Pipette.
       Hinweis: Dieses Volumen eingestellt werden kann, wenn das Pellet ungewöhnlich klein oder groß ist.
   13. Man reibt mit dem gleichen 10 ml Pipette das Pellet zu homogenisieren. PC12-Zellen verklumpen oft zusammen, so dass mindestens 20 Pipettieren und downare notwendig.
       HINWEIS: Während kräftige Verreiben notwendig ist, vermeiden Sie Luftblasen in der Zellsuspension zu schaffen.
   14. In einem 1,5-ml-Röhrchen, eine geeignete Verdünnung der Zellsuspension in Trypanblau vorzubereiten. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zählkammer nach zuvor festgelegten Protokollen ^74.
   15. In einem separaten 50-ml-Röhrchen, teilen Sie die Zellsuspensionmit PC12 Differenzierungsmedium eine verdünnte Zellsuspension geeignet für Aussaat Brunnen von einer 24-Well - Platte (30.000 ¢ / cm ^2, 0,6 ml pro Vertiefung gemäß dem Protokoll des Herstellers) zu erhalten.
       HINWEIS: Die 24-Well - Platte muss vorher mit Kollagen beschichtet werden , wie ⁷⁵ von zuvor festgelegten Protokolle festgelegt wurden .
   16. 0,6 ml der Zellsuspension verteilen pro Vertiefung einer Mikropipette.
   17. Wenn alle Vertiefungen ausgesät sind, schaukeln sie die Platte wie in Schritt 1.1.7).
   18. Die richtige Differenzierung von PC12 - Zellen zu ermöglichen, bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ feuchten Atmosphäre in PC12 Differenzierungsmedium ^15,16 die 24-Well - Platten für 7-9 Tage brüten vor Co-Kulturexperimente durchgeführt werden .
   19. Führen jeden zweiten Tag Mediums ändert die Hälfte der Flüssigkeit entfernt und mit einem gleichen Volumen von frischem PC12 Differenzierungsmedium ersetzt.
2. Aussäen N9 Mikroglia in den Einsätzen und der Behandlung mit LPS
   1. Einen Tag vor der Co-Kultur-Experimente durchführen, vorzubehandeln PTFE 0,4 um Poreneinsätze mit Routine N9 Zellkulturmedium die Zellhaftung zu optimieren, folgende Schritte 1.1.1) bis 1.1.4)
   2. Warm Routine N9 Zellkulturmedium und Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad.
   3. Inzwischen wiegen etwa 10 mg LPS in einem 1,5-ml-Röhrchen für eine spätere Verwendung.
      HINWEIS: Da LPS ist ein potenter proinflammatorischer Endotoxin und erfordert besondere Sicherheitsvorkehrungen, Brille, Handschuhe und ein einatmen werden dringend empfohlen.
   4. Verwenden Sie N9 Zellen bei 80-90% Konfluenz aus einem 75 cm ² Kolben.
   5. Führen Sie die Schritte 2.1.3) bis 2.1.14). Verwenden Sie immer Routine N9 Zellkulturmedium anstelle von Routine PC12 Zellkulturmedium. Beachten Sie auch, dass N9 Mikroglia nicht verklumpen, so viel wie PC12-Zellen zu tun, so dass weniger Pipettieren nach oben und unten kann in Schritt 2.1.13) erforderlich sein.
   6. In einem separaten 50-ml-Röhrchen, teilen Sie die Zellsuspension mit N9 Zellkulturmedium zu obtain einer verdünnten Zellsuspension geeignet für Aussaat Einsätze konzipiert in 24-Well - Platten (60.000 ¢ / cm ^2, 0,05 ml pro Einsatz nach dem Protokoll des Herstellers, für Membranoberfläche , Hersteller Informationen) zu halten.
      ANMERKUNG: Diese Einsätze sind bereits mit Kollagen vom Hersteller beschichtet und für Zelladhäsion optimiert.
   7. mit einer Mikropipette 0,05 ml der Zellsuspension pro Platte verteilen.
   8. Wenn alle Einsätze ausgesät sind, schaukeln sie die Platte wie in Schritt 1.1.7).
   9. Führen Reihenverdünnungen von LPS N9 Behandlungsmedium unter Verwendung von 4 & mgr; g / ml zu erhalten, 2 ug / ml und 1 ug / ml Arbeitslösungen.
   10. Pipette 0,05 ml der 4 ug / ml Arbeitslösung in einem der Satz von Einsätzen, um eine endgültige Verdünnung von 2 pg / ml zu ergeben.
   11. Wiederholen Sie Schritt 2.2.10) für die beiden anderen Arbeitslösungen in verschiedenen Sätzen Einsätzen, wodurch man Endverdünnungen von 1 ug / ml und 0,5 ug / ml.
   12. Imcubate die Platten , die Einsätze für 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ enthaltenden feuchten Atmosphäre N9 Mikroglia - Aktivierung mit LPS zu ermöglichen , bevor die Co-Kultur - Experimente durchführt.
3. Co-Kultivierung von neuronalen PC12-Zellen mit N9 Mikroglia
   1. An 7-9 Tagen von PC12-Zellen differenzieren, aktivieren Sie die N9 Mikroglia nach 24 Stunden Inkubation mit LPS durch warme N9 Behandlungsmedium und PC12 Behandlungsmedium in einem 37 ° C Wasserbad.
   2. Führen Sie eine Gesamtmediumwechsel für N9 Mikroglia, wie in Schritt 1.3), das gesamte verwendete Medium durch 0,1 ml N9 Behandlungsmedium zu ersetzen. Tun Sie dies für alle insert.This ist notwendig, um alle Spuren von LPS zu entfernen, nur dann aktiviert N9 Mikroglia in den Einsätzen zu verlassen.
   3. Führen Sie eine Gesamtmediumwechsel für neuronale PC12-Zellen, wie in Schritt 1.4). Übertragen , um die Einsätze in die 24-Well - Platten , wie in Schritt 1.5) .Incubate die N9-PC12 Kokulturen für 24 h oder 48 h bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ feuchten Atmosphäre.
   4. nach 24h oder 48 h, ernten Sie den Überstand und / oder die auf Zytotoxizität, Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), Western Blot oder andere Tests.

Ergebnisse

Die Verwendung von Einsatz Co-Kultursystemen ist besonders relevant bei der Untersuchung von neuroinflammatorischen Prozesse, die parakrine Beziehungen zwischen verschiedenen zellulären Spieler des ZNS zeigen. Immunität im ZNS erfolgt in erster Linie von den ansässigen Zellen genannt Mikroglia, die ihre Umwelt in ihrem Ruhezustand verästelten (2A) zu überwachen und sind von Sensorstörungen fähig das könnte Probleme der sehr wertvollen Homöostase notwendig für die richtig...

Diskussion

Der kritischste Schritt jedes Einsatzes Kokultursystem Experiment verweilt tatsächlich in der richtigen Einsatz Wahl zu verwenden. Die Porengröße und Membranmaterial muss in gründliche Rechnung getragen werden, ohne zu vergessen, die Art der Zellen zu betrachten, und der Zweck des Experiments ausgesät werden. Beispielsweise Kontaktchemotaktische Assays können die gleiche Art von Membran als Zell Kokulturen verwenden, um Zellverhalten Modulationen analysieren induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit v...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI-1640 mittel	Sigma	R8755	Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium-/Nährstoffmischung F-12 Schinken	Sigma	D6421	Warm in 37 μd; C Wasserbad vor Gebrauch, muss mit 0,365 g/L L-Glutamin ergänzt werden
Pferdeserum	ATCC	30-2040	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales Rinderserum	MultiCell	80350	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Nerve Growth Factor-7S aus der murinen Submaxillarldrüse	Sigma	N0513	Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver in einer Lösung aus gepufferter Kochsalzlösung oder Gewebekulturmedium mit einem Gehalt von 0,1– 1,0 % Rinderserumalbumin oder 1-10 %
	Sigma	T3924	Warm in 37 μg; C Wasserbad vor Gebrauch
Lipopolysaccharide aus  Escherichia coli  055:B5	Sigma	L2880	Toxische
Zellkultureinsätze für die Verwendung mit 24-Well-Platten	BD Falcon	353095	0,4 μ m Poren
24-Well-Platten	TrueLine	TR5002	Vor Gebrauch mit Kollagen beschichten
Routine PC12 Zellkulturmedium			Routine N9 Zellkulturmedium
-            85% RPMI mittel			-            90% DMEM-F12 mittel
-            10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum			-            10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum
-            5% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
PC12 Differenzierungsmedium			N9 Behandlungsmedium
-              99% RPMI mittel			-            99% DMEM-F12 mittel
-              1% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum			-            1% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
-              50 ng/mL Nervenwachstumsfaktor
PC12 Behandlungsmedium
-              99% RPMI mittel
-              1 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum