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Neuroscience

Automatische Analyse von Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

Eine effiziente und einfache Methode für die computergestützte Analyse von Nematoden Schwimmverhalten in Flüssigkeit beschrieben. Das Verfahren erfordert keine Investitionen für C. elegans Laboratorien wenig. Die verwendete Hardware ist Standard, und der Computer-Software für die Verhaltensanalyse (CELEST) ist eine Open Source ein.

Abstract

Sezieren die neuronalen und neuromuskuläre Schaltungen, die das Verhalten regulieren bleibt eine große Herausforderung in der Biologie. Der Nematode Caenorhabditis elegans hat sich als unschätzbar Modellorganismus zu sein zu helfen , dieser Herausforderung zu begegnen, aus technologischen Ansätzen inspirieren, den Bau des menschlichen Gehirns Connectome, um tatsächlich ein Licht auf die spezifischen molekularen Treiber von grundlegenden Funktionsmuster zu vergießen. Der größte Teil der Verhaltensstudien in C. elegans sind auf festen Substraten durchgeführt. In Flüssigkeit zeigen Tiere Verhaltensmuster, die Bewegung in einem Bereich von Geschwindigkeiten in 3D, sowie Teilkörperbewegungen, wie eine hintere curl ohne vordere Formänderung umfassen, die für die Quantifizierung neue Herausforderungen einzuführen. Die Schritte eines einfachen Verfahrens, und die Verwendung einer Software , die hochauflösende Analyse von C. elegans Schwimmverhalten ermöglicht, werden hier vorgestellt. Die Software namens CELEST, nutzt eine spezielle Computerprogramm, das verfolgtmehrere Tiere gleichzeitig und stellt neue Maßnahmen von C. elegans Fortbewegung in Flüssigkeit (Schwimmen). Die Maßnahmen werden vor allem in der Tierhaltung begründet und basiert auf Mathematik in Computer Vision und Mustererkennung verwendet, ohne Rechenanforderungen für Schwellen cut-offs. Das Software-Tool kann verwendet werden, um sowohl in der Hunderte von Tieren aus kombinierten Kleinserien Studien Gesamt Schwimmen Fähigkeiten beurteilen und neue Phänotypen sogar in gut charakterisierten genetischen Mutanten zu offenbaren. Die Herstellung von Proben für die Analyse mit CELEST ist einfach und Low-Tech, so dass breite Anpassung von der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Die Nutzung der Rechen hier beschriebenen Ansatz sollte daher auf dem besseren Verständnis des Verhaltens und Verhaltensschaltungen in dem C. elegans - Modell beitragen.

Introduction

Definieren, wie Genetik, Epigenetik, Erfahrung und Umwelt Einfluss Verhalten eine große Herausforderung in der modernen Biologie ist. Einfach, genetisch zugänglich Modelle, die rechnerisch verfolgt und gemessen werden können kritische Beiträge zu diesem Ziel leisten können. Die Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein solches Modell. Der Zweck dieses Artikels ist es zu zeigen , wie C. elegans Lokomotion Schwimmen nachverfolgt werden kann und quantifizierten Informationen über acht neue Merkmale mit biologischer Relevanz zu extrahieren.

C. elegans hat eine relativ kurze Lebensdauer von ca. 2 - 3 W und einer Fortpflanzungszeit von etwa 4 d bei 20 ° C 1,2. Im Standard - Laborkulturen wird diese mikroskopisch kleinen Faden auf Petri - Platten , die Nematode Growth Medien (NGM) gezüchtet , die mit einer bakteriellen Nahrungsquelle 3,4 verteilt sind. WT N2 Tiere bewegen sich aktiv in elegant Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten; sie Bewegung Ratte ändernes , wenn ( der Suche nach Nahrung) Roaming, Wohnung (Browsing), oder von einer Mahlzeit (inaktive Sättigung quiescence) Gewinnen 5. Impairment 6 oder im Alter von 7-12 können dramatisch verändern auch die Bewegung auf den Platten.

Gene, die Verhalten, Health oder Alterung modulieren, kann durch die Analyse C. elegans Bewegungsmuster oder Fortbewegung charakterisiert werden funktionell. Ein Ansatz Health zu messen , ist alterungs- Erwachsene in drei Kategorien klassifizieren (zB A, B, und C) entsprechend ihrer Fortbewegung auf Platten, mit intensiver körperlicher Aktivität ist Klasse A und Lähmung ist Klasse C 7,8,13. Obwohl eine solche qualitative Sortierung nützlich ist, Unterschiede in der körperlichen Fitness zu offenbaren, sind die Kategorien breit ohne klare Grenzen und damit ihre Scoring unterliegt Bias Experimentator.

Eine wachsende Zahl von Tracker haben die Objektivität, Raffinesse erhöht und Präzision der Analyse von C. elegans Bewegungauf festen Medien 14-18. C. elegans Fortbewegung auf Platten meist auf die Ebene beschränkt ist , in dem das Tier Kontakt mit der festen Oberfläche des Mediums bildet. (C. elegans kann auch Exploration induzieren , indem Sie den Kopf zu heben weg vom Rest des Körpers , die immer noch in Kontakt mit einer festen Oberfläche ist, die Positionierung des Körpers in mehreren Ebenen. Doch dieses Verhalten ungewöhnlich ist.) Wenn sie in flüssiger gesetzt, diese Nematoden initiiert eine wellen~~POS=TRUNC oder Schwimmen, die weitergehende dreidimensionale Bewegung verfügt, eine größere Bandbreite an Geschwindigkeit und Tiefe der Bewegung und eine erhöhte Inzidenz mit dem Alter der vorderen anders posterior bewegt, wie die Tiere auf festen Oberflächen verglichen. Als schnelle Analyse der körperlichen Fitness und Reaktion auf neue Umgebung kann ein Experimentator eines einzelnen Tieres in einen Flüssigkeitstropfen platzieren und sammle seine Frequenz der Körper biegt sich unter dem Binokular. Die Videoaufnahme kann Gegenwart und Zukunft Ritzungen des Schwimm Kraft der ErleichterungTier. Jedoch begrenzt die manuelle Ansatz die Anzahl der Funktionen, die erzielt werden können, und ist vollständig in einer Zeit, Scoring ein Tier gezwungen.

Locomotion in Flüssigkeit weniger ist als die Fortbewegung auf festen Medien untersucht. Tatsächlich gibt es einige Software - Optionen , die die Fortbewegung im Labor zu implementieren robust und einfach in flüssiger 19-24 zu messen. Die Software CELEST (C. elegans Swim Test) bietet Einfachheit in der Anwendung und mathematisch-basierte Maßnahmen , die 8 - Daten (Krümmungs scores) unmittelbar relevant für die Art der Bewegung liefern; (ausführliche Beschreibung von Merkmalen und Vorteilen in Restif et al. 8). Darüber hinaus ermöglicht Computeranalyse die Aufklärung der phänotypischen Eigenschaften, die für das menschliche Auge unmöglich zu punkten. Dabei werden Daten, die die Auflösung dieser Analyse Ansatz exemplarisch vorgestellt und ein einfaches Protokoll zu implementieren, um schwimmen Studien aufnehmen für nachfolgende CELEST Analyse beschrieben.

Protocol

1. Nematode Wachstum und Handhabung

  1. Wachsen C. elegans auf Standard - Petri - Platten , die NGM 1-3 mit OP50-1 Escherichia coli als Nahrungsquelle entdeckt.
  2. Halten Kulturen in einem Inkubator, der die gewünschte Temperatur beibehält. C. elegans wächst gut 15 bis 25 ° C, mit 20 ° C die Standardwachstumstemperatur ist.
    HINWEIS: Schwimmen ist eine robuste Phänotyp, aber Kraft schwimmen kann durch Umweltfaktoren einschließlich Kontamination auf Platten und eine Überhitzung der Kulturen und Dias betroffen sein. Starke Anstrengungen stabilen Bedingungen zu halten gemacht werden sollte.
  3. Verwenden Sie ein hausgemachtes Nematoden Pick aus einem Platindraht schmolzenen in einem Glasstab 4 Übertragung einzelner Tiere zu behandeln.

2. für Schwimmanalyse einrichten

  1. Verwenden Sie ein integriertes System bestehend aus einem Stereomikroskop, digitale CCD-Kamera und digitale Video-Recording-Software. Die CELEST Software can auf einem separaten Computer verwendet werden.
    1. Bedecken Sie das Mikroskop mit einem dunklen Tuch (zB Filz) Blendung in der Schwimmablegebereich auf dem Objektträger zu verhindern und die Bildqualität zu verbessern.
    2. Stellen Sie den Arbeitsabstand des Mikroskops und Vergrößerung der vollen Ansicht der Schwimmbereich und den unteren Spiegel scharfem Kontrast der Tiere vor dem Hintergrund zu erhalten. Stellen Sie die Beleuchtung Dunkelfeld die Leichen der Erwachsenen als weiß vor dem schwarzen Hintergrund sichtbar zu machen, die sich sehr gut für Computational Visualisierung arbeitet und mit der Swim-Analyse-Tracking-Software.
    3. Achten Sie darauf, den Arbeitsbereich zu halten, Objektträger und schwimmen fallen sehr sauber. Debris kann durch Verschließen der freien Schwimmen der Erwachsenen und dünnen Fäden der Faser mit der Analyse stören können Tiere wie nonmoving nachgewiesen werden während der Verfolgung.

3. Tier Vorbereitung auf die Analyse der körperlichen Fitness in Liquid

  1. Pipette 60 ul of 1x M9-Puffer in einen 10-mm-Ring auf einem Mikroskop-Objektträger vorgedruckt. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen vollständig den Innenbereich des Rings abdeckt. Die Software extrahiert mehr Schwimmen Informationen dieses Tropfengröße auf einer Folie enthalten sind unter Verwendung als es wäre, wenn Multiwell-Platten verwendet.
  2. Wählen Sie einzelne erwachsene Nematoden und übertragen sie in den Tropfen 1x M9-Puffer, minimiert den Transport von Bakterien, die die Flüssigkeit trüben kann. Minimieren Bakterien, indem man zuerst auf eine Seite der Platte, die Tiere für die Übertragung platzieren, die nicht viel Bakterienrasen enthält, lassen sie kriechen, und sie dann sanft anheben.
    1. Wenn die Nematoden in den Tropfen zu übertragen, verwenden Sie ein Binokular nahe der Analysestation die Länge der Schwimmzeit zu reduzieren, was 25 das Verhalten der Tiere beeinflussen können.
    2. Legen Sie nur 4 Erwachsene in der Drop, wenn sie oft heftig und kreuzen sich die Wege bewegen. Als Führung überlappende Schwimmer zu minimieren (die Computeranalyse confounds), sollten Sie platzieren4 Tiere pro Tropfen, wenn sie so aktiv wie junge, gesunde WT Erwachsene und 5 Tiere pro Tropfen, wenn sie älter sind und zeigen weniger Kraft.
      HINWEIS: Gesunde WT Nematoden beginnen instinktiv schwimmen bald nach in Flüssigkeit gelegt. Mit Hilfe eines Nematoden Pick, trennen Sie vorsichtig die Erwachsenen in der Tropfen, wenn sie verklumpen.

4. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Videoaufzeichnung von Schwimmen

  1. Positionieren Sie den Schlitten beladen mit Erwachsenen auf der Basis des Mikroskops ihre Schwimm aufzuzeichnen. 30 s Videos erfassen Details der individuellen Verhalten des Tieres in Flüssigkeit (Video 1), und die Entnahme von einer großen Anzahl solcher Aufzeichnungen erreicht wird leicht , wenn sie von CELEST Software 8,26 Aided; jedoch schwimmen längere Zeit für andere spezifische Verhaltensstudien können 25 ideal. Wichtig ist, stellen Sie sicher, die gleiche Vergrößerung in allen Aufnahmen, da Vergrößerung Unterschiede forderlich, haltent Schwimmen Analyse und spannt Vergleich.
    Hinweis: Diese Schritte werden als Anleitung zur Verfügung gestellt aufgelistet , die digitale Videoaufzeichnungssoftware in der Tabelle der Materialien; VirtualDub Open-Access-Software könnte ersetzen, obwohl wir nicht getestet haben.
    1. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen als Anleitung für eine erfolgreiche Schwimmanalyse: Bildgröße von 696 x 520 Pixel, Bildauflösung von 0,02 mm / Pixel und einer Rate von 18 Bildern / s. Versionen mit höherer Auflösung dieser Einstellungen erleichtern Tracking aber werden die Maßnahmen vom Programm berechnet nicht beeinflussen.
      HINWEIS: Die Schwimmzone durch die 60 & mgr; l Tropfen 1x M9-Puffer auf dem Objektträger nicht viel Tiefe vorgesehen ist, die Bewegung nach oben und nach unten gerichtete Schwimm minimiert.
  2. Unter Einstellungen, gehen Sie auf "Aufnahme", Set 'Limit Sequence Size' auf '545 Frames auf der Festplatte ". Unter der gleichen Position, das Kontrollkästchen "Use Recording Manager '. Klicken Sie auf den "Bearbeiten aktuellen recorSkript ding ... 'Taste, und unter "Befehle" die Option "Grab Frame' und unter 'Stoppbedingungen", geben Sie "Stopp nach 0: 00: 30.00".
  3. Zur Aufzeichnung wählen Sie "Neue Sequenz im RAM" unter der ursprünglichen Position, dann drücken Sie die rote "Record" Taste. Die Software wird 545 Frames über 30 s mit der Digitalkamera greifen und halten sie im RAM-Speicher.

5. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Video-Behandlung

  1. Fragment, das das Video in eine Folge von Bildrahmen durch die nach Hause Schrift klicken und "Export vollständige Sequenz zu ..." im Video-Recording-Software auswählen.
    HINWEIS: Die digitale Videoaufzeichnungssoftware können die Rahmen als .bmp, .jpg, .tif oder .png speichern, von denen alle hier präsentiert von der Swim-Analyse-Programm gelesen werden. Beachten Sie, dass TIF-Dateien verwenden mehr Speicherplatz, aber einige Formate wie JPG kann die Bildqualität verschlechtern.
  2. Starten Sie das Schwimmen Analyseprogramm von MATLAB by Klick auf die Schaltfläche Ausführen.
  3. Auf dem Startbildschirm des Programms schwimmen Analyse, verwenden Sie die "Hinzufügen einer Video 'oder Buttons' mehrere Videos hinzufügen 'Sequenzen von Bild zu laden Rahmen ein zu einer Zeit oder in Gruppen, während relevante Labels wie Genotyp, Datum, Versuch und Dauer Anbringen . Die Software erstellt eine Datenbank der markierten Sequenzen.
  4. Aktivieren Sie die gleichzeitige Verfolgung mehrerer Tiere in den hochgeladenen Sequenzen von 1 'klicken. Prozess Videos '. In dem neuen Bildschirm, wählen Sie die gewünschten Videos im linken Feld und klicken Sie auf "zur Liste hinzufügen". Für jedes Video, klicken Sie auf seinen Namen in der oberen rechten Liste das erste Bild des Videos in der rechten unteren Ecke angezeigt werden soll. Abgrenzen die Schwimmzone um 3 Punkte innerhalb des Rings auszuwählen und initiieren Verarbeitung, indem Sie auf "Process alle Videos oben genannten '. Sehen Sie Fortschritt der Verarbeitung in der Mitte unten.
  5. Einmal vollendet, "Schließen", die Videoverarbeitung Bildschirm.

6. Die Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Messung

  1. Klicken Sie auf "2. Compute Maßnahmen "einen neuen Bildschirm zu öffnen, in dem die bearbeiteten Videos hochgeladen werden können, ein zu einer Zeit, die Verfolgung von einzelnen Tieren zu bestätigen oder abzulehnen. Videos, die in der Liste erscheint auf der linken Seite, wo das Video Name dieses Video zu können geklickt haben, verarbeitet wurden hochladen.
  2. Nutzen Sie die Anleitung Schritt auf die Bereiche der verpassten Tracking (roten Blöcke) im Gegensatz zu erfolgreichen Tracking (grüne Blöcke) zu konzentrieren.
    HINWEIS: Alternativ kann man auf der automatisierten Ausgabe von gültiger Tracking verlassen , da die Software ein robustes Tracking - System (94,1% Gültigkeit ab 404 Videos in 2.020 Tieren beobachtet 8).
    1. Finden Sie die "Gültigkeit des segmentierten Körpers in der ersten Farbbalken auf dem Bildschirm in der unteren Hälfte. Der Prozentsatz der "gültige Rahmen 'ist in grün, und der Prozentsatz der" abgelehnten frames' ist in rot. ≥80% der gültigen Rahmen implizieren, dass die Tracking-ikommt von mindestens 432 Frames nformationen verwendet Maßnahmen zur Berechnung von 540 in einem 30 s schwimmen Studie bei 18 Bildern / s aufgezeichnet.
    2. Leicht steuern und Blöcke gültiger ändern / abgelehnt Rahmen der 'Next Block' verwendet wird, 'Schalter Gültigkeit "," Split-Block "und" Isolieren frame' Optionen. In dem seltenen Fall, dass zwei Tiere Pfade in einem überlaufenen Badezone gekreuzt, schalten ihre Identifikationsnummern über einen bestimmten Bildbereich mit dem 'Switch' Taste.
    3. Sehen Sie sich die Balkendiagramme in der unteren Hälfte des Bildschirms für zusätzliche Informationen über Tracking und überlappende Performances. Die Länge des segmentierten Körper (Tierkörperlänge pro Rahmen) korreliert mit Ausdehnungen überlappen.
  3. Wenn irgendwelche hellen Flecken auf dem Video die Analyse stören, stellen die hellen Bereiche in der Schwimmzone, die durch die "Glare Zonen" Funktion auswählen.
  4. Klicken Sie auf "Speichern und Compute Maßnahmen" die Gültigkeit Eingabe zu speichern, bevor upandere verarbeitete Video geladen ist. In diesem Stadium der Software im Hintergrund berechnet (für den Benutzer nicht gezeigt), Krümmung Karten der Schwimmleistung einzelner Tiere und die Parameter , die unten angegeben (Video 2).
    HINWEIS: Die gemessenen Parameter , die hier fokussiert sind , sind in Tabelle 1 beschrieben. Die Welle Initiationsfrequenz, Körperwellenzahl, Asymmetrie, strecken, und Curling basieren auf den Krümmungen berechnet, dass die Software für die Tiere berechnet; Die Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex Parameter werden auf Krümmung Karten basieren.
  5. Klicken Sie auf "Schließen", die "Compute Maßnahmen" Bildschirm zu verlassen.

7. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Ausgabe Resultate

Hinweis: Die Software auf mehreren Maßnahmen der Schwimmbewegung berichten können, die aus offenkundigen auf sehr subtile Verhaltensmerkmale decken nicht ohne weiteres Tor von Auge (Videos 3 und 4). Hier dasSchwerpunkt liegt auf 8 Parameter, die typischerweise einen guten Dynamikbereich zeigen: Wellenstartgeschwindigkeit, Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch, Curling, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex.

  1. Auf dem Startbildschirm des Programms, klicken Sie auf "3. Ergebnisse anzeigen ", um die Analyseausgabe zu erhalten.
  2. Erstellen Probengruppen für statistische Behandlung durch die gewünschten analysierten Sequenzen von Frames im linken Feld auswählen und sie in eine neue oder bestehende Probengruppe zu bewegen, indem Sie auf die "Hinzufügen zur ausgewählten Probe" oder "In den neuen Sample 'Tasten.
  3. Klicken Sie auf "Show Graphen für diese Proben" zu einem zweiten Bildschirm zu gehen, dass die Graphen anzeigt und die wichtigsten Statistiken der Proben für jede der 8 Parameter durch Auswahl auf dem oberen Rand des Bildschirms.
    1. Falls gewünscht, passen Sie die Darstellung der Balkendiagramme an der oberen linken Ecke des Bildschirms mit den 'Farben', '# von Histogrammen "und" Anzahl der Würmer "Selektoren.
  4. Benutzen"2D-Histogramme" Kombinationen von zwei beliebigen Parameter über die "Maßnahme auf der X-Achse" zu plotten und "Maßnahme auf der Y-Achse 'Drop-Down-Menüs auf der linken Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf "Schließen" zu beenden und zur Rückkehr zum Bildschirm "Ergebnisse anzeigen".
  5. Verwenden Sie den "Export ..." Taste auf der oberen linken Ecke des Bildschirms detaillierte numerische Daten als CSV-Datei zu speichern, zu öffnen und weiter in ein Tabellenkalkulationsprogramm zu manipulieren.
  6. 'Schließen' 'Display Ergebnisse' Bildschirm zurück zum Home-Bildschirm zu gehen und klicken Sie auf "Beenden" Sichern der Datenbank, um sicherzustellen, die analysierten Videosequenzen enthalten.

Representative Results

Durch die Analyse der Fortbewegung in Flüssigkeit (Schwimmen), Phänotypen, die nicht ohne weiteres ersichtlich, auf festen Medien (Crawling) erläutert. Um Quantifizieren Schwimmen Fortbewegung entwickelten wir spezifische Software , die zehn neuen Parameter des Schwimmverhaltens 8 misst. Die acht am nützlichsten dieser Parameter werden im Detail in Tabelle 1 beschrieben. Diese Parameter werden Wave-Startgeschwindigkeit genannt, Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch, Curling, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex. Studien , die die Leistung der Software veranschau haben den funktionellen Rückgang von Hunderten von alternden Erwachsenen mit WT, Verhaltens- oder Langlebigkeit Mutantenhintergründe 8, definiert und haben die gut erforschten Langlebigkeit Mutanten Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50) analysiert, die Mutationen beherbergen, die das normale Insulin-Signalweg unterbrechen. Das Gen Alter-1 kodiert für eine Phosphatidylinositol - 3-Kinase (pIK3) Katalytische Untereinheit, und, wenn es die Mutation hx546 birgt, verursacht Laufzeitverlängerung und Stressresistenz 27-29. Das Gen daƒ-16 kodiert für ein forkhead Box O (FOXO) Transkriptionsfaktor, der Lebensdauer und beeinträchtigt die Stress - Reaktion verkürzt sich, wenn 30-33 gelöscht.

Bestimmte Parameter des Schwimmens wie Wave - Startgeschwindigkeit, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex nach und nach zurückgegangen mit dem Alter auch in günstigen genetischen Hintergrund (Abbildung 1). Im Einklang mit derzeitigen Kenntnissen und langlebiges Alter-1 (hx546) Mutanten zeigten eine starke körperliche Leistung als WT bei fortgeschrittenen und extrem hohen Alter. Auch wie erwartet, kurzlebige daƒ-16 (mgDƒ50) Mutanten zeigten die Leistung beeinträchtigt, vor allem bei extrem hohen Alter. Bemerkenswerterweise war es nur unter der Kontrolle der CELEST Computer Vision und mathematischen Algorithmus Paket, das die superior Schwimmleistung von Alter-1 (hx546) Mutanten war zu Beginn des Erwachsenenalter nachweisbar. Die Tatsache , dass das Alter-1 (hx546) führt zu einer Verbesserung der physischen Leistung bei jungen Erwachsenenleben legt nahe , dass diese Mutation normale Entwicklung und / oder jungen Erwachsenen Phänotyp in einer Weise , die zuvor nicht geschätzt beeinflusst (Abbildung 1).

Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch und Curling - Parameter mit dem Alter in WT tendierten und Alterungs Mutant Erwachsene (Abbildung 2). Interessanterweise ergab die Auflösungsstufe der Software feineren Verhaltensmerkmale wie die nachhaltige Symmetrie des Alters-1 (hx546) Mutanten während ihrer gesamten Lebensdauer und die Unfähigkeit der extremen alten daƒ-16 (mgDƒ50) Mutanten und das gleiche in dem Maße zusammenrollen zu strecken -age WT und Alter-1 (hx546) Erwachsene.

Neben dem Gesamt unvermeidlichen Verlust physikalischer performance aufgrund von Alter, jeder einzelne Erwachsenen ein einzigartiges Muster Progression durch den Alterungsprozess zeigt, selbst wenn Genetik und Umwelt 7 praktisch homogen sind. (Von Genetik und Umwelt, die möglichen verwirrenden Auswirkungen dieser Faktoren minimiert Controlling, den bedeutenden Beitrag von stochasticity zu altersbedingten Degeneration Enthüllung.) Eine synchronisierte C. elegans Population von ähnlichen genetischen Hintergrund gehalten in einer kontrollierten Umgebung enthält immer noch eine Mischung aus verschiedene Klassen von Individuen nach ihren alternden Besonderheiten. Obwohl alle als gesunde Erwachsene beginnen, verlieren einige schnell ihre körperliche Fitness (schlecht Ager, Klasse C), während andere Kraft für längere Zeit (anmutigen Ager, Klasse A) erhalten. Bad Ager erscheinen daher eine wesentlich kürzere als anmutige Health Ager zu haben.

Wie weiter detailliert in unserer Studie 8, gehalten anmutigen Ager jugendliche körperliche FITNess wie durch den Vergleich mit der Swim - Profil von viel jüngeren Erwachsenen (Abbildungen 3, 4 und 5) beobachtet. Diese nachhaltige Fitness ist vergleichbar mit der körperlichen Leistungsfähigkeit von langlebigen Alter-1 (hx546) Mutanten bei post-reproduktiven Alter (D 11) (Abbildungen 1 und 2). Im Gegenteil verloren, schlechte Ager dramatisch viel von ihrer körperlichen Leistungsfähigkeit bald nach der Wiedergabe auf einem Niveau ähnlich denen der extremen alten und progeric daƒ-16 (mgDƒ50) Erwachsene (Abbildungen 1 - 4) durchgeführt wird . Diese Ähnlichkeiten können grob Vergleich gezogen werden, jedoch insbesondere Signaturen sind leicht bemerkbar bei genauerem Hinsehen. Zum Beispiel, obwohl es eine gewisse Korrelation zwischen dem Ausmaß der sowohl strecken und Curling in extremen alten Wildtypen und Alterung Mutanten (Abbildung 2) ist diese Beziehung nicht in schlecht Ager beobachtet (4 und 5), die höhere Neigung zeigen , sich zu kräuseln up abernicht getestet in den Proben zu strecken. Die Software, die wir so präsentieren fügt Dimension der Analyse der körperlichen Fitness oder motorischen Leistungsfähigkeit durch die Werkzeuge für die anspruchsvolleren Studien bieten, die vorher nicht lenkbar waren. Zusammengefasst stellt CELEST umfassende Ablesungen in Form von acht neuen Maßnahmen hier hervorgehoben, die den Verhaltens Fingerabdruck von spezifischen genetischen, epigenetischen definieren und ökologischen Hintergründe, die Identifizierung von einzigartigen und gemeinsamen Parameter Muster ermöglicht, die die Signaturen der spezifischen Bedingungen sein kann ( Umwelt-, pharmakologische, Ernährungs), biologische Prozesse oder Organismus Staaten wie Health.

Abbildung 1
Abbildung 1: CELEST Software Berichte über Wave - Initiation Rate (A), Aktivitätsindex (B), Pinselstrich - Optik (C) und Fahrgeschwindigkeit (D) für WT, das Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50) Erwachsene auf D 4 (junge Erwachsene), 11 (post-Wiedergabe) und 20 (extrem alt). '#' In y-Achse bedeutet "Zahl". WKA sind grau, alters 1 in grün und daƒ-16 in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Same-Alter WT und Alterungs Mutanten wurden für eine statistische Signifikanz im Vergleich mit one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 in jedem Datenpunkt von vier unabhängigen Studien. Beachten Sie, dass hier, und für 2, jedes einzelne 30 s Video mit 4 Tieren gemacht, und für jeden Versuch punkten wir insgesamt 16 Tiere von 4 schwimmen Videos wird diese gezeigt für 4 biologischen Replikaten für jeden Datenpunkt durchgeführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Abbildung 2: Software - Berichte über die Körper - Wellen - Nummer (A), Asymmetrisch (B), Stretch (C) und Curling (D) für WT, das Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50) Erwachsene auf D 4 (junge Erwachsenenalter), 11 (post-Wiedergabe) und 20 (extrem alt). '#' In y-Achse bedeutet "Zahl". WT sind in grau, alters 1 in grün gefärbt und daf-16 in rot. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Same-Alter WT und Alterungs Mutanten wurden für eine statistische Signifikanz im Vergleich mit one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 in jedem Datenpunkt aus vier unabhängigen, 30 s schwimmen Studien.e.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Software - Berichte über die Wave - Initiation Rate (A), Aktivitätsindex (B), Pinselstrich - Optik (C) und Fahrgeschwindigkeit (D) für junge WT Erwachsene (D 4) und Same-Alter Anmutig und Bad Ager (D10 und 11). '#' In y-Achse bedeutet "Zahl". Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün gefärbt und Klasse C schlecht Ager in rot. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 junge Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. ****, P <0,0001. n = 27 in jedem Datenpunkt von zwei unabhängigen, 30 s schwimmen Studien. Graph ist leicht von Restif et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative wurdeCommons Namensnennung (CC BY) Lizenz http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Software - Berichte über die Körper - Wellen - Nummer (A), Asymmetrisch (B) und Curling (C) für junge Erwachsene WT (D 4) und Same-Alter anmutig und Bad Agers (D 10 und 11). '#' In y-Achse bedeutet "Zahl". Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün und Klasse C schlecht Ager in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 junge Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001; et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz http veröffentlicht wurde: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Software - Bericht über Stretch für junge Erwachsene WT (D 4) und Same-Alter Anmutig und Bad Agers (D 10 und 11). Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün und Klasse C schlecht Ager in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 young Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. n = 27 in jedem Datenpunkt von zwei unabhängigen Studien. Graph ist leicht von Restif et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz http veröffentlicht wurde: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Video 1
Video 1: Schwimmen von einer repräsentativen Gruppe von C. elegans Erwachsene. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Video 2
Video 2: CELEST Software Berechnung einzelner Krümmungen der Swim Performances der getesteten Tiere. Curvature Karten werden im Hintergrund berechnet wird; erscheinen sie nicht in der Software-Schnittstelle mit dem Benutzer. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Video 3
Video 3: Software Berechnung der Schwimm Maßnahmen auf der Grundlage individueller Curvature Maps. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Video 4
Video 4: Software Berechnung der Swim Maßnahmen, die auf Curvature Verlassen Sie sich nichtMaps. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Discussion

Die Verwendung von C. elegans als Modellsystem weiterhin aufgrund seiner genetischen Formbarkeit, experimentelle Lenkbarkeit und Anatomie kommentierte akribische Detail zu erhöhen. Zum Beispiel wird die neuronale Struktur und Konnektivität des C. elegans hermaphroditischen deutlich 34-36 kartiert, stark Untersuchungen von spezifischen neuronalen Schaltungen erleichtern , die bestimmte Verhaltensweisen steuern. 302 Neuronen bilden das Nervensystem des erwachsenen Hermaphroditen, die eine breite Palette von sensorischen Input in grundlegende Verhaltens Ausgänge wie Lokomotion verarbeiten. Die Struktur des komplexeren männlichen Nervensystem hat auch 37 beschrieben worden ist , so dass geschlechtsspezifische Schaltung angesprochen werden. 37

C. elegans Verhalten wurde auf Standard - Kulturplatten mit festen Medien ausführlich untersucht. Da WT C. elegans bewegt sich in vorhersehbarer Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten, Abweichungen von derGesamtmuster kann durch Auge und erzielte manuell erfasst werden. Dieser Ansatz ist jedoch unter dem Kriterium des Experimentators und ist arbeitsintensiv. Hard- und Software - Tools entwickelt , zu verfolgen und zu messen C. elegans Fortbewegung auf festen Medien die Vorspannung Subjektivität entfernen und ermöglichen eine groß angelegte Studien, komplexere biologische Fragestellungen ermöglicht angesprochen werden. Die jüngste Verhaltensdatenbank durch das Labor erstellt Schafer 16 ist ein ausgezeichnetes Beispiel für die analytische Ausdehnung und Tiefe , die auf Platten mit einem Rechensystem für die Fortbewegung erreicht wurde.

Wenn WT C. elegans in Flüssigkeit gelegt wird, passt sich das Tier schnell seine Bewegung in die neue Umgebung, ein Bad zu initiieren. C. elegans Schwimmen einen größeren Bewegungsspiel nutzt als kriechende und unregelmäßiger 8 sein kann. Software wie CELEST soll die Lücke für eine detaillierte Analyse von C. elegans zu füllen Verhalten in flüssiger, permitting Quantifizierung von Bewegungs-assoziierten Parameter, die nicht ohne weiteres durch die un-Aided Auge gemessen werden, oder dass schneller als die manuelle Scoring durchgeführt werden kann. In 8 Fest h verarbeiten bis zu 200 Videos, ~ 1.000 Datensätze pro Tag ein individuelles könnte.

Die Software definiert Schwimmen Beurteilung Parameter, die als umfassende Fingerabdruck der körperlichen Fitness und Verhalten dienen. Darüber hinaus Verständnis der komplexen Facetten von C. elegans Verhalten in flüssiger und ihre zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu bereichern, kann diese Software verwendet werden , um mehrere Aspekte der Biologie einschließlich pharmakologischen Reaktionen, Altern und unterschiedliche Verhalten zu erforschen. Der hier präsentierte die Übersicht über die quantifizierten Veränderungen , die in der körperlichen Leistungsfähigkeit von C. elegans auftreten Erwachsene , wie sie im Alter von einem Beispiel für eine solche Anwendung der Software ist (für eine ausführlichere Darstellung siehe Restif et al. 8). Im Zusammenhang mit der Alterung verringerte sich einige gemessenen Parameter währendandere erhöht oder nicht konsequent war in Wildtyp verändern. Trends wurden zu einem großen Teil von der Rechen Profil der Langlebigkeit Mutanten bestätigt, und die relativen Profile von anmutigen und schlechte ager Kohorten gleichgeschlechtlicher Alter Populationen gehalten in Uniform Umweltbedingungen. Die hohe Auflösung der Software kann auch subtile Phänotypen zeigen bisher unbekannte in ausführlich charakterisiert Mutanten (zB Alter-1 (hx546) in Abbildung 1).

Es gibt einige besonders kritische Schritte des Protokolls beschrieben. eine konstante Temperaturumgebung zwischen der Schwimm Umgebung pflegen und die Dehnungsmeßplatte Kultur ist für Schwimmen Reproduzierbarkeit wichtig, so Experimentatoren sind große Mühe zu gehen, sehr ermutigt, um zufällige Temperaturschwankungen vermeiden. Schwimm Medien sollten wie die Platten bei der gleichen Temperatur sein. Ebenso wird sorgfältig auf die Tropfengröße für das Schwimmen helfen Reproduzierbarkeit gewährleisten. Schließlich ist es ratsam, in zu denkenVoraus über die Abladen der großen Video-Dateien, die sich ansammeln. Die Verarbeitung von Bildern auf einer Seite neben der Video-Capture-Computer wird empfohlen.

Die Verwendung der Software hier für swim Analyse vorgestellt hat bestimmte Einschränkungen. Erstens: Obwohl die Programme gleichzeitig mehrere Tiere verfolgen können, wenn mehr als fünf Tiere gemeinsam analysiert werden, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass die Tiere übereinander in den Videobildern schwimmen. Wenn das Programm nicht eindeutig bestimmen, welches Tier war die, wie es jene Datenrahmen zensiert. Obwohl dieses Programm stellt sicher, dass Daten für einzelne Tiere von hoher Qualität sind, schränkt sie den Durchsatz. Zweitens sollten die Bilder ziemlich sauber sein, dh frei von Staub, Schmutz und Blendung durch Leuchten, als assoziierte Signale auch die Bildanalyse durcheinander bringen kann. Wie bereits in Abschnitt 2.1.1 Protokoll, ein sehr Low-Tech-Investitionen, die sich stark der Bildaufnahme durch die Beseitigung Komplikationen im Zusammenhang mit Schwankungen helfen kann in Umgebungsbeleuchtung ist die Bühnenbereich mit einem dunklen Tuch abdecken, die nicht Umgebungslicht erlaubt, um die Bühne zu erreichen. Drittens wird das Programm für die Tiere bei erwachsenen Stadium optimiert. Junge Larven schwimmen sehr schnell und haben kleine Körper, die Programmfehler erhöht. Viertens nutzt einige der Software MATLAB, und wenn es Versions-Upgrades und / oder Betriebssystem-Upgrades können einige Programmverknüpfungen gestört werden. Derzeit ist die Software für den Einsatz auf MATLAB 2015B und Mac OS Version 10.10 optimiert, aber wir erwarten, dass in Kürze eine Software-Version zu veröffentlichen, die robuster gegenüber solchen Veränderungen ist. Schließlich können die Videodatendateien groß werden schnell und Speicherplatz benötigen zugeteilt werden.

Zusammenfassend hier präsentiert ist eine einfache Methode , die von jedem Labor ohne große Investitionen leicht umgesetzt werden können für CELEST Analyse Schwimmen Videos von C. elegans zu erstellen. Funktionen des Softwarepakets gehören umfangreiche Automatisierung von Tracking durchAnalyse, simultanen Multi-Tier - Verfolgung und Verwendung von mathematischen Grundlagen (dh Krümmungsmaßnahmen) zur Quantifizierung der meisten Bewegungsparameter. Die Software ist Open Source, mit Code und Demos öffentlich zugänglich wie in Restif detailliert et al. 8. Obwohl die Programmanalyse Advanced Computer Vision für Tracking - Funktionen, anderen veröffentlichten Tracking - Systeme (zB Greenblum et al., 2014 38) sind kompatibel mit der Parameteranalyse der Software vorgestellt. Zukünftige Verbesserungen werden in Richtung Umwandlung der Software in ein robusteres Paket gerichtet werden, die Verwendung auf die spezifischen Versionen der Betriebssysteme nicht oben erwähnt beschränken (auch in der Tabelle der Materialien angegeben).

Acknowledgments

CELEST Entwicklung von NIH gewährt R21AG027513 und U01AG045864 unterstützt wurde. Daten und einige kurze Videodarstellungen sind aus Restif et al angepasst. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz veröffentlicht wurden http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Wir danken Ricardo Laranjeiro für Manuskript Hilfe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

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Neuroscience Ausgabe 118 Schwimmverhalten Fortbewegung, Altern Sarkopenie Tracking
Automatische Analyse von<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Verhalten mit CELEST Software
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Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

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