Method Article

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

DOI:

10.3791/54371

⸱

September 20th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

In This Article

Summary

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Wir berichten hier über Methoden zur molekulargenetischen Manipulation des Yarrowia lipolytica Po1g-Stammes zur Verbesserung der Gendeletionseffizienz. Die daraus resultierenden gentechnisch veränderten Y. lipolytica-Stämme haben potenzielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und biochemischen Produktion.

Abstract

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Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe - Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 - Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen - Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 - Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen - Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 - Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 - Knockout - Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 - Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen - Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.

Introduction

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Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen 1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie 3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel 6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine be....

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Protocol

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1. Erzeugung des Y. lipolytica KU70 Deletionsstamms

  1. Der Bau der Disruptionskassette
    Anmerkung: Siehe Tabelle 1 für alle Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationen verwendet.
    1. Design Primer 20 der PCR die LEU2 Expressionskassette amplifizieren (siehe Tabelle 1) von einer Y. lipolytica Expressionsvektor und LoxP - Stellen in den 5'- und 3' - Enden der LEU2 Kassette mit einem langen Vorwärtsprimer (# 1; Tabelle 1) einzuführen , und einem langen Rückwärtsprimer (# 2; Tabelle 1), respectively. Um ei....

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Results

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Die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in das Genom von Y. in die pBR Andockplattform eingefügt lipolytica Po1g Stamm von 27 eine einzige Crossover - Rekombination durchführen. Durch die schnelle chemische Transformationsverfahren unter Verwendung der in dieser Studie festgestellt, die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in den Wildtyp - Po1g Stamm bei einer Transformationseffizienz von> 100 KBE / ug D.......

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Discussion

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Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die erfolg.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Nationalen Umweltagentur von Singapur (ETRP 1.201.102), die Competitive Research Program der National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur ( 1324004108), globale F & E-Projekt Programm, das Ministerium für Wissensökonomie, der Republik Korea (N0000677), die Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) und der synthetischen Biologie Initiative der National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenz/Material
Oligonukleotid-PrimerIntegrated DNA Technologies25 nmol DNA-Oligos
Y. lipolytica Stamm Po1gHefe BiotechLeucin auxotrophes Derivat des Wildtyp-Stammes W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeast BiotechFYY203-5MGY. lipolytica Expressionsvektor
E. coli TOP10InvitrogenFür die Klonierung und Vermehrung von Plasmiden
pGEM-T-Vektor PromegaA3600TA Klonierungsvektor
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Für die Plasmidisolierung
Wizard SV Gel und
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Extrahieren Sie DNA-Fragmente aus Agarosegelen
und reinigen Sie PCR-Produkte aus einer Amplifikationsreaktion
Die iProof High-Fidelity
DNA-Polymerase		Bio-Rad172-5302High-Fidelity-DNA-Polymerase
BamHI New England BiolabsR0136SRestriktionsenzym
BglII New England BiolabsR0144LRestriktionsenzym
KpnINew England BiolabsR0142SRestriktionsenzym
NdeI New England BiolabsR0111SRestriktionsenzym
NotINew England BiolabsR0189LRestriktionsenzym
PmlINew England BiolabsR0532SRestriktionsenzym
PstI New England BiolabsR0140SRestriktionsenzym
SacIINew England BiolabsR0157SRestriktionsenzym
SalINew England BiolabsR0138SRestriktionsenzym
XhoINew England BiolabsR0146LRestriktionsenzym
T4 DNA-LigaseNew England BiolabsM0202L
Taq DNA-Polymerase& nbsp;Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027Antibiotika
Hygromycin BPAAP21-014Antibiotika
GeneRuler 1 kb DNA-LeiterThermo ScientificSM03121 kb DNA-Leiter
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Lachs Sperma DNAInvitrogen15-632-011
LithiumacetatSigma
EssigsäureSigma
Glasperlen (425-600 µ m)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA Loading FarbstoffThermo ScientificR0611
Bacto HefeextraktBD212750
Bacto PeptonBD211677
D-Glucose1. BaseBIO-1101
YNB ohne AminosäurenSigmaY0626
DO Supplement-LeuClontech630414
GlycerinSigmaG5516
Difco LB BouillonBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Ausrüstung
PCR-GerätBioradT100 Thermocycler
WasserbadMemmertWNB 14
Stationär-/Schüttel-InkubatorYihderLM-570RD
ThermoschüttlerAllshengMS-100
MikrozentrifugeEppendorf5424R
ZentrifugeEppendorf5810R
SpektralphotometerEppendorf BioPhotometer plus
Gel-ImagerGEAmersham Imager 600

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I.

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Yarrowia LipolyticaGenetic EngineeringHomologous RecombinationGene DeletionKU70 KnockoutDNA TransformationCre LoxP SystemBiofuel ProductionBiochemical ProductionTargeted Gene Disruption

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