Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Summary

Die Methode der Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) wurde ausgiebig verwendet, um native Komplexe aus zellulärem Extrakt, hauptsächlich eukaryotisch, für die Proteomik zu isolieren. Hier stellen wir ein TAP-Methodenprotokoll vor, das für die Aufreinigung von nativen Komplexen für Strukturstudien optimiert ist.

Abstract

Affinitätsreinigung Ansätze wurden erfolgreich für Proteomik Charakterisierung zu isolieren nativen Komplexe. Strukturelle Heterogenität und ein gewisses Maß an Heterogenität der Zusammensetzung eines Komplexes nicht behindern in der Regel Fortschritte in solchen Studien durch. Im Gegensatz dazu ist ein Komplex für die strukturelle Charakterisierung bestimmt sind, sollten in einem Zustand gereinigt werden, die sowohl kompositionell und strukturell homogener als auch in einer höheren Konzentration als für die Proteomik erforderlich ist. Seit kurzem gibt es für die Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe in der Anwendung von Elektronenmikroskopie signifikante Fortschritte. Dies hat das Interesse an Ansätzen erhöhte auf native Komplexe von ausreichender Qualität und Quantität für die Strukturbestimmung mittels Elektronenmikroskopie zu reinigen. Die Tandem Affinity Purification (TAP) Verfahren optimiert wurde , um eine 18-Untereinheit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein Montage von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) zu extrahieren und zu reinigen

Introduction

Viele wichtige zelluläre Prozesse werden ¹ von großen Protein- und Protein-RNA - Komplexen durchgeführt. Ein wesentlicher Engpass biophysikalische und strukturelle Untersuchungen solcher Komplexe zur Durchführung wird sie in geeigneter Qualität (dh Homogenität) und in einer geeigneten Konzentration zu erhalten. Isolieren eines Komplexes aus einer natürlichen Quelle hat viele Vorteile, einschließlich der Beibehaltung relevanten posttranskriptionales und / oder translationale Modifikationen von Untereinheiten und die richtige komplexe Montage sicherstellt. Jedoch sind große Zellkomplexe oft in einer Zelle bei einer niedrigen Kopienzahl und die Reini....

Protocol

Hinweis: Das folgende Protokoll zur Reinigung eines Komplexes von 4 l Zellkultur entwickelt wurde, etwa 40 g Nassgewicht der Zellen. Nach der Vorbereitung sollten alle Puffer bei 4 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach ihrer Herstellung verwendet. Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren werden nur Puffer zugesetzt unmittelbar vor der Verwendung.

1. Herstellung von Gesamtzellextrakt für Tandem Affinity Purification

1. Das Wachstum von S. cerevisiae - Zellen
   1. Streak die gewünschte TAP markiert S. cerevisiae - Stamm aus dem Speicher (-80 ° C) auf eine Hefe - Pepton Dextrose (YPD) Platte.....

Results

Eine modifizierte TAP Methode wurde verwendet , von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, einen 18-Untereinheit Ribonukleoproteinkomplex. Eine anfängliche TAP Reinigung des Komplexes nach dem veröffentlichten Protokoll ^2,3 ergab einen Komplex, der heterogene erschienen, die Migration als drei Bänder auf einem silbergefärbten nativen Polyacrylamidgel (2A). Mehrere Runden der Optimierung des TAP - Methode ergab einen Komplex, der in erster Li.......

Discussion

Die TAP-Methode verwendet zwei Tags, die eine Notwendigkeit für strenge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten leichen. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Darüber hinaus markiert einzelne TAP ORFs von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind, so dass man jeden Hefestamm mit einem markierten Proteins für je.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP-getaggter Stamm	Open Biosystems	YSC1177	Dies ist der primäre Hefestamm, der zur Entwicklung des TAP-Protokolls verwendet wurde. Sein Hintergrund ist S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Kaffeemühle	Mr. Coffee	IDS77	Wird für die Zelllyse
verwendet Hämozytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Wird verwendet, um die Zelllyse
zu beurteilen JA 9.100 Zentrifugenrotor	Beckman Coulter, Inc.		Wird zur Ernte der Hefezellen
JA 20 Festwinkel-Zentrifugenrotor	Beckman Coulter, Inc. verwendet.		Wird verwendet, um den Zellextrakt von unlöslichem Zellmaterial
zu reinigen Ti 60 Festwinkelzentrifugenrotor	Beckman Coulter, Inc.		Wird verwendet, um den löslichen Zellextrakt weiter zu reinigen
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperaturgesteuerter Schüttler
Novex Gelsystem	Thermo Fisher Scientific
IgG-Harz	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 schnell fließendes
Calmodulin-Harz	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinitätsharz
Proteasehemmer Cocktail, Mini-Tabletten	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-freie Tabletten
Protease-Inhibitor-Cocktail, große	Tabletten Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-freie Tabletten
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)			Gelöst in Isopropanol
2 ml Bio-Spin-Säule	Bio-Rad Laboratorien, Inc.	7326008	Wird zum Verpacken und Waschen der Calmodulin-Säule
10 ml Poly-Prep-Säule	Bio-Rad Laboratories, Inc. verwendet.	7311550	Wird zum Verpacken und Waschen des IgG-Harzes verwendet
native PAGE Bis-Tris Gele	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% vorgefertigte Polyacrylamid-Gele NativeMark
Proteinstandard	Thermo Fisher	Scientific LC0725	Ungefärbter Proteinstandard für native PAGE. Belastung 7,5 μ L für ein silberbeflecktes Gel und 5 μ l für ein SYPRO Rubin gefärbtes Gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris Gele	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% vorgefertigte Polyacrylamid-Gele
PageRuler Proteinstandard	Thermo Fisher Scientific	26614	Ungefärbter Proteinstandard für Western Blotting
SDS Laufpuffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP Antikörper	Thermo Fisher Scientific	Primärer Antikörper gegen CBP-Tag
Sekundärer Antikörper	Thermo Fisher Scientific	31341	Ziegen-Anti-Kaninchen-Phosphatase, konjugiert BCIP
/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat/nitroblaues Tetrazolium
Dialaysis-Einheiten	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer Mini-Dialyseeinheiten
Zentrifugalfiltereinheiten, 100 kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-100-Membran
Reinigungsmittelabsorbierende Kügelchen	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 Absorptionsmittel
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Fluoreszenzfarbstoff für die Nukleinsäurefärbung, bei der Detektion mit vorhandenem SYPRO Ruby eine Anregungswellenlänge von 488 nm und eine Emissionswellenlänge von 532 nm verwenden
SYPRO Ruby	Molekulare Sonden	S-12000	Fluoreszenzfarbstoff für die Proteinfärbung, bei der Detektion mit SYBR Green II wird eine Anregungswellenlänge von 457 nm und eine Emissionswellenlänge von 670 nm verwendet
Kupfergitter	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften G400-CP