Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Eine neuartige Technik zum Nachweis von endogenen Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen wird beschrieben. Wir haben es AFLIP genannt, weil es aus der Affinitätsmarkierung des Rezeptors durch seinen Liganden besteht, der mit der Immunpräzipitation verbunden ist.

Zusammenfassung

Durch die Kombination der Kräfte von Affinity Labeling und ImmunopRecipitation (AFLIP) wurde eine Technik zum Nachweis von Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen implementiert. Diese Technik nutzt die Selektivität und Sensitivität, die durch die Affinitätsmarkierung eines gegebenen Rezeptors durch seinen Liganden mit der Spezifität der Immunpräzipitation verliehen wird. Wir haben AFLIP verwendet, um den Typ-III-TGF-β-Rezeptor (TGFBR3), auch bekannt als Betaglykan, während der frühen Entwicklung des Zebrafisches nachzuweisen. AFLIP war maßgeblich an der Validierung der Wirksamkeit eines TGFBR3-Morphanten-Zebrafisch-Phänotyps beteiligt. Im ersten Schritt werden embryonale Proteinextrakte hergestellt und zur Herstellung von ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3-Komplexen verwendet, die durch Immunpräzipitation aufgereinigt werden. Später werden diese Komplexe kovalent vernetzt und mittels SDS-PAGE-Trennung und Autoradiographie-Detektion freigelegt. Diese Technik erfordert die Verfügbarkeit eines markierten Liganden für den zu detektierenden Rezeptor und eines spezifischen Antikörpers gegen ihn und muss leicht angepasst werden können, um jeden Wachstumsfaktor oder Zytokinrezeptor zu identifizieren, der diese Anforderungen erfüllt.

Einleitung

Der spezifische Nachweis von Proteinen, die während der Embryonalentwicklung exprimiert werden, ist erforderlich, um Expressionsprofile zu validieren, die durch Messung ihrer verwandten mRNAs mit RT-PCR oder in situ Hybridisierung (ISH) erhalten wurden. Dies wird in der Regel durch einen Western Blot von Embryonenextrakten erreicht, gefolgt von einem Nachweis mit spezifischen Antikörpern. Dieser Ansatz lässt sich jedoch nur schwer auf Proteine anwenden, die in sehr geringer Menge vorkommen oder die Eigenschaften aufweisen, die ihren quantitativen Transfer während ihres Blottings behindern. Betaglykan, auch bekannt als Typ III transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)-Rezeptor (TGFBR3), ist ein Beispiel für diese Schwierigkeiten. TGFBR3 ist ein Teilzeit-Membranproteoglykan, das TGF-β über sein Kernprotein¹ bindet, mit einer deutlich höheren Affinität für die Isoform TGF-β2, eine Eigenschaft, die es von allen anderen TGF-β-bindenden Proteinen² unterscheidet. TGFBR3 wird im Zebrafisch ab 8 hpf exprimiert und erreicht ein Maximum von 72 hpf, wie durch RT-PCR seiner mRNA³ nachgewiesen wird.

Trotz der Verfügbarkeit eines sehr spezifischen Antikörpers³ erwies sich jeder Versuch, sein translatiertes Produkt mittels Western Blot nachzuweisen, als erfolglos. Unter der Annahme, dass die Proteoglykan-Natur von TGFBR3 sowie die mutmaßlich geringe Abundanz für dieses Versagen verantwortlich sein könnten, wurde eine Nachweismethode, AFLIP, entwickelt, die sich die hohe Affinität von TGFBR3 zu TGF-β2 zunutze macht. Bei dieser Methode wird einem Proteinextrakt aus gepoolten Embryonen erlaubt, spezifisch an ¹²⁵I-markiertes TGF-β2 zu binden, und die Rezeptor-Liganden-Komplexe werden durch Immunpräzipitation gereinigt und vor der Trennung durch SDS-PAGE vernetzt. Die durch die Autoradiographie der Gele beobachteten Migrationsmuster zeigten das Vorhandensein und die Art der markierten Rezeptorspezies. Dieser Ansatz kombiniert die Ligandenspezifität der Affinitätsmarkierung mit der Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper, wodurch der Nachweisbereich erhöht und das ineffiziente Transfer-Blotting von TGFBR3 vermieden wird. Aufgrund seiner inhärenten Eigenschaften handelt es sich beim AFLIP Assay nicht um einen quantitativen Assay, sondern es kann verwendet werden, um relative experimentelle Unterschiede im analysierten Rezeptor sicher zu messen.

Protokoll

Alle Versuche an Tieren durchgeführt wurden vom Ausschuss für Laboratory Animal Care und Verwenden der Autonomen Nationalen Universität von Mexiko (UNAM) genehmigt, unter dem CICUAL-Protokollnummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Herstellung von Embryo Protein Extract

1. Sammeln Sie 100 bis 200 Embryonen für jede Bedingung zu vergleichen (morphants vs. Wildtyp) in der gewünschten Stufe, zum Beispiel 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF).
2. Platz Embryonen in Petrischalen mit Fischwasser (siehe Tabelle 1) und manuell dechorionate Embryonen mit feinen bestückte Zange. Während dieses Schritts zu vermeiden (oder einer anderen Protease gesamten Protokoll) unter Verwendung von Pronase, da es die gezielte Rezeptor verdauen kann.
3. Ort Embryonen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und wasche Embryonen twEis mit 1x Phosphatpufferlösung (PBS) (siehe Tabelle 1).
4. In 500 ul deyolk Puffer (siehe Tabelle 1).
5. Lassen Sie die meisten Eigelb durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten (ca. 30 - 40-mal) die Embryonen in der Lösung. Für 72 HPF und 48 HPF Embryonen verwenden, blaue und gelbe Pipettenspitzen sind. Gelb Spitzen müssen leicht geschnitten werden kann, Zerstörung von Embryonen zu vermeiden. Die erfolgreiche Dotter Freisetzung kann durch die Beobachtung Embryonen unter dem Mikroskop geprüft werden.
6. Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec.
7. Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette.
8. Wash Embryonen zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch bei niedrigster Geschwindigkeit sanft verwirbelt.
9. Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec.
10. Ab hier geht das Verfahren bei 4 ° C.
11. Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette.
12. Resuspendieren Embryonen in 350 & mgr; l Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und homogenisieren einen Plastik zerstoßen.
13. Inkubieren lysiert Embryonen 30 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C.
14. Zentrifuge lysiert Embryonen bei 11.000 xg für 15 min, um unlösliche Rückstände zu entfernen.
15. Transfer geklärte Überstand einer Pipette in ein frisches Röhrchen verwenden.
16. Bestimmung der Gesamtprotein durch Bradford-Test ⁴ oder ein anderes geeignetes Verfahren. Wenn Bradford - Test verwendet wird, führen Sie die Kalibrierungskurve in Gegenwart von äquivalenten Konzentrationen der Waschmittel präsentiert im Lysepuffer, da sie eine Unterschätzung des Proteins Standard - ⁴ führen.

2. Nachweis von endogenen Rezeptor Protein

1. Affinitätsmarkierung und Immunpräzipitation (alle diese Schritte wurden bei 4 ^° C)
   1. Platzieren 400-500 ug Gesamt - Embryo - Protein in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mit Wasser auf 1 & mgr; g / & mgr; l mit Puffer 1 (siehe Tabelle 1).
      Hinweis: Um 500 ug Gesamt-Embryo-Protein zu erhalten, etwa 100 bis 200 Embryonen müssen zunächst verarbeitet werden. 72 HPF Embryonen routinemäßig ergeben ~ 5 ug Gesamt-Embryo-Protein, das für Betaglycan Nachweis ausreichend ist.
   2. Hinzufügen genügend Volumen an markiertem TGF-β2 Lager um eine Endkonzentration von 150 pM zu erreichen und inkubiere unter Schütteln auf einem Reagenzglas Wippe 2 h bei 4 ° C. TGF-β2 müssen gekennzeichnet werden , bevor AFLIP gestartet wird, mit ¹²⁵ I nach dem Verfahren Chloramin T , wie durch Cheifetz et al. ^5.
      ACHTUNG: Verwenden Sie Abschirmung Exposition zu minimieren , während ¹²⁵ Umgang mit der Bezeichnung I - Liganden.
   3. Hinzufügen genügend Volumen an unverdünntem Antikörper gegen den Rezeptor von Interesse, um eine 1 zu erreichen: 100 Verdünnung und weiter Inkubation für weitere 2 h bei 4 ° C (Inkubation kann O / N sein). Dies ist die optimale Verdünnung des Antiserums # 31, die in dieser Studie verwendet und anderswo ³ beschrieben, jedoch in Abhängigkeit von der Qualität der eintibody, eine größere oder kleinere Verdünnung kann die optimal sein.
   4. Zugabe von 50 & mgr; l geeignete Immunglobulin-Bindungsperlen (zB G-Protein-Sepharose, die zuvor in TNTE äquilibriert wurde und resuspendiert 1: 5 des ursprünglichen Volumens in TNTE) und Inkubation für 50 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C.
   5. Gewinnen Sie die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 11.000 × g für 20 Sekunden.
   6. Überstand verwerfen in einem geeigneten radioaktiven Abfallbehälter.
   7. Waschen Sie die IP-Perlen dreimal mit 1 ml IP - Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch Vortexen und Mikrozentrifugation bei 11.000 xg für 20 sec jedes Mal.
   8. Resuspendieren IP-Perlen in 250 ul IP Waschpuffer.
   9. Fügen 1,5 ul Disuccinimidylsuberat (DSS, gelöst in DMSO bei 10 mg / ml). Bereiten Sie die DSS-Lösung kurz vor der Verwendung in diesem Schritt.
   10. Inkubieren für 15 min bei 4 ° C unter Rühren.
   11. Um die Vernetzungsreaktion zu löschen, 500 & mgr; l of IP Waschpuffer, ergänzt mit genügend Tris-Cl pH 7,4 Lager 25 mM Tris-Cl zu erreichen. Die freien Aminogruppen in Tris erfassen nicht umgesetzten DSS.
   12. Zentrifuge bei 11.000 g für 20 sec IP-Perlen zu sammeln und Überstand verwerfen.
   13. Resuspendieren IP-Perlen in 30 ul Puffer Laemmli reduzieren.
   14. Boil Proben 5 min bei 94 ° C.
   15. Optional analysieren Proben in einem Gamma-Zähler des Protokolls Hersteller.
2. Probenanalyse
   1. Gegenstand Proben einer SDS-PAGE denaturieren. Verwenden Sie Polyacrylamid auf der entsprechenden Prozentsatz für die Masse des Rezeptors und führen Gel unter Standardverfahren.
   2. Tauchen Gel in Fixierlösung (siehe Tabelle 1) für 30 min bei RT.
   3. Waschen Sie Gel mit destilliertem Wasser 15 min.
   4. Setzen Sie Gel in vorher hydratisiert Filterpapier und Deckel mit Saran Wrap Folie.
   5. Trockenen Gels bei 80 ° C für 1 Stunde.
   6. Expose Gel auf einem weißen Phosporimager screen bei RT O / N.
   7. Scan ausgesetzt Bildschirm mit einem Phosporimager mit Protokoll des Herstellers.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit AFLIP erhalten. Die Signale in Spur 1 kommen aus dem ¹²⁵ I-Ligand kovalent an entweder der Zebrabärbling Betaglycan Core - Protein (BG Kern unterhalb der 150 kDa - Marker) verknüpft oder dem BG Kern, der zu seiner Proteoglykan Form verarbeitet wurde , durch Anbringung von Glykosaminoglykanen (GAG, Abstrich im Bereich von 170 kDa an die Spitze des Gels). Dieses Muster der Migration, ein scharfer Core - Protein plus...

Diskussion

Die Verwendung von Western - Blots mit einem spezifischen Antikörper gegen ein Protein von Interesse ist ein wertvolles Instrument zum Ausdruck ⁷ während der Embryonalentwicklung zu studieren. Jedoch Immunoblotting hoch glycosylierten Proteinen war nicht sehr erfolgreich gewesen aufgrund ihrer ineffizienten Übertragung und eine schwache Bindung an Nitrocellulose oder PVDF Membranen ^8,9.

Proteoglykane sind ein gutes Beispiel für dieses Manko, die aufgrund ihrer kovalent ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Disuccinimidylsuberat (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Geltrockner Modell 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto Gamma Counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix