Method Article

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

DOI:

10.3791/54406

⸱

August 19th, 2016

 , 
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung einer permeablen Membran insert-basierten Infektionssystem die Auswirkungen von Streptolysin S zu untersuchen Verwendung eines sezernierten Toxin produziert von Gruppe A Streptococcus, auf Keratinozyten beschrieben. Dieses System kann leicht auf die Untersuchung von anderen sezernierten bakteriellen Proteinen auf verschiedenen Wirtszelltypen während der Infektion angewendet werden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viele bakterielle Pathogene sekretieren potent Toxine in der Zerstörung von Wirtsgewebe zu unterstützen, zu initiieren Signalisierungsänderungen in Wirtszellen oder Reaktionen des Immunsystems im Verlauf der Infektion zu manipulieren. Obwohl Verfahren entwickelt worden , um erfolgreich zu reinigen und sehr viele wichtige Virulenzfaktoren produzieren, gibt es noch viele bakterielle Toxine , deren einzigartige Struktur oder umfangreiche post-translationale Modifikationen machen sie schwer in in vitro - Systemen zu reinigen und zu studieren. Außerdem, selbst wenn reines Toxin erhalten werden kann, gibt es viele Herausforderungen im Zusammenhang mit den spezifischen Wirkungen eines Toxins unter den relevanten physiologischen Bedingungen zu studieren. Die meisten in vitro Zellkulturmodelle entwickelt , um die Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxinen auf Wirtszellen zu bewerten beinhalten Inkubieren von Wirtszellen mit einer einmaligen Dosis von Toxin. Solche Verfahren nähern schlecht, was Wirtszellen während einer Infektion tatsächlich Erfahrung, wo Toxin durch kontinuierlich produziert wirdBakterienzellen und nach und nach im Verlauf der Infektion ansammeln. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines permeablen Membraneinsatzes Basis bakterielle Infektion System die Auswirkungen von Streptolysin S, ein potenter Toxin von Gruppe A Streptococcus, auf menschlichen Epithelzellen Keratinozyten zu untersuchen. Dieses System mehr ahmt die natürliche physiologische Umgebung während einer Infektion als Verfahren, bei denen reine Toxin oder bakterielle Überstände werden direkt an Wirtszellen angewendet. Wichtig ist, beseitigt dieses Verfahren auch die Vorspannung der Host-Reaktionen, die durch Kontakt zwischen den Bakterien und Wirtszellen zu lenken. Dieses System wurde verwendet, um effektiv die Effekte von Streptolysin S (SLS) auf Host Membranintegrität, zelluläre Lebensfähigkeit und zelluläre Signalantworten zu bewerten. Diese Technik kann leicht auf die Untersuchung von anderen sezernierten Virulenzfaktoren auf einer Vielzahl von Säugetierwirtszelltypen angewendet werden, um die spezifische Funktion eines sekretierten Bakterienfaktor d zu untersuchenährend den Verlauf der Infektion.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

die Funktion der bakteriellen Virulenzfaktoren in Zusammenhang mit der Wirtszelle Infektion zu verstehen, ist ein wichtiger Schwerpunkt der bakteriellen Pathogenese Forschung. Viele bakterielle Pathogene sekretieren aktiv Toxine und andere lösliche Faktoren bei der Zerstörung von Wirtsgewebe zu unterstützen, zu initiieren Signalisierungsänderungen in Wirtszellen oder auf Reaktionen des Immunsystems im Verlauf der Infektion 1 manipulieren - 10. Obwohl Verfahren entwickelt worden , um erfolgreich zu reinigen und zu produzieren sehr viele wichtige Virulenzfaktoren für Studie haben einige bakterielle Produkte einzigartige Strukturen oder umfangreiche post-translationale Modifikationen , die sie widerspenstige Kandidaten für Reinigungsverfahren und somit nicht isoliert untersucht in vitro - Systemen verwendet werden können , machen . Zum Beispiel Streptokokken der Gruppe A, die bakterielle Erreger verantwortlich für eine Vielzahl von Infektionen von Pharyngitis nekrotisierende Fasziitis und toxisches Schocksyndrom bis hin erzeugt ein sezerniertBakterientoxin bekannt als Streptolysin S (SLS) 11-17. Diese ribosomal hergestellte Peptid wird durch das Streptolysin S assoziierten Gens (SAG) Cluster und das reife Produkt wird geschätzt , codiert in der Größe 2,7 kDa zu sein 14-17. Das Protoxin, von SAGA codiert, wird modifiziert , post-translational durch mehrere Enzyme (SAGB, SAGC und SAGD) den reifen, funktionellen Form 15 zu erzeugen - 17. Die Komplexität dieser post-translationale Modifikationen gekoppelt mit der ungewöhnlichen Aminosäuresequenz des Toxins haben das Toxin nicht kompatibel mit allen Reinigung und Strukturaufklärung Anstrengungen gemacht , die versucht wurden 15,17 bis heute. Diese Herausforderungen haben komplizierte Anstrengungen, um die spezifische Rolle dieses Toxin in Host-Pathogenese zu bestimmen.

In Fällen, in denen die Herstellung von gereinigten Toxinen oder anderen sekretierten Faktoren entweder komplex oder nicht möglich ist, Mechanismenerläutern die Funktion dieser Produkte werden traditionell durch die Herstellung von gefilterten Bakterienüberstände untersucht worden, die dann angewendet werden Zellen 18 zu hosten - 20. Es gibt mehrere Herausforderungen mit dieser Technik verbunden. Erstens, viele dieser sezernierten Faktoren, einschließlich SLS, halten keine maximale oder konsistente Aktivität bei Lagerung und Anwendung Zellen zu einem späteren Zeitpunkt zu hosten. Zusätzlich wird, wenn Überstände in einem einzelnen Zeitpunkt gesammelt werden und dann angelegt an Wirtszellen ist es schwierig, physiologische Relevanz zu bestimmen und direkte Rückschlüsse auf die natürlichen Infektionsprozess zu ziehen, wo sekretierten Faktoren erlaubt im Verlauf der Infektion zu einem zu akkumulieren physiologisch relevanten Konzentration. Diese zweite Herausforderung gilt für die Verwendung von bakteriellen Überständen nicht nur, aber auch die Verwendung von gereinigten Toxinen in Wirtszellstudien 1 - 3,8. Zur Bewältigung dieser Probleme, eine durchlässige Membran insert-basierten Infektionssystem wurde die Wirkung von SLS auf Wirtszellen in einer Weise zu beurteilen, entwickelt, die Aktivität optimal Toxin beibehält und beseitigt auch die variable direkten Kontakt zwischen Bakterien und Wirtszellen. In diesem System werden humane Epithelzellen in einer Monoschicht in der unteren Kammer eines Zweikammer gut, und Bakterien werden in die obere Kammer des gleichen gut eingeführt gewachsen. Eine poröse Membran (0,4 um Poren) trennt die oberen und unteren Kammern, so dass sekretierte Faktoren zwischen den beiden Kammern zu verhindern, aber den Durchtritt von Bakterien ausgetauscht werden. Dieses System wurde für eine effektive Bewertung der Wirtsreaktionen erlaubt, die nachhaltig ausgeschieden bakteriellen Komponenten allein zurückzuführen sind , während alle Antworten zu beseitigen , die durch den direkten Kontakt während Gruppe A Streptokokken - Infektion auftreten kann. Obwohl andere sezerniert bakterielle Faktoren neben SLS auch durch die poröse Membran, die Verwendung eines isogenen Mutante Tafel mit Wildtyp (WT) passieren kann, ein SLS-knockout (ΔsagA) und einem SAGA ergänzt Stamm (ΔsagA + SAGA) ermöglicht eine präzise Bewertung der Host - Antworten , die streng SLS-abhängige 21 sind.

26 wenige Studien mit bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen , diesen Ansatz 6,27,28 genutzt haben - obwohl ähnliche permeable Membraneinsatz Systeme für die Untersuchung von sekretierten Faktoren in virale Infektionen, Krebsbiologie und Immunzellmigration beteiligt 22 eingesetzt worden sind. Auch Studien, die solche Systeme eingesetzt haben Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen, in erster Linie auf die Migration von Entzündungszellen oder Bakterien durch eine epitheliale oder endotheliale Monoschicht konzentriert zu erforschen auf die durchlässige Membran Einsatz überzogen. Die permeable Membran insert-basierten Infektion hier beschriebene System ist eine einfache und effektive Methode, die auf der Trennung von Bakterien und Wirtszellen über eine poröse Membran stützt sich die effe zu beurteilencts des sekretierten Toxin, SLS, auf dem Host-Membranintegrität, zelluläre Lebensfähigkeit, zellulären Signaltransduktion und sezernierten Wirtszellfaktoren. Diese Technik kann auf die Untersuchung von anderen sezernierten Virulenzfaktoren auf einer Vielzahl von Säugetierwirtszelltypen angepasst werden, um die Rolle eines spezifischen Bakterienfaktor im Verlauf einer Infektion zu untersuchen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakterienkultur

  1. Erzeugen isogenen Mutanten - Stämme , die für die Untersuchung des spezifischen sekretierten Faktor 21 Interesse verwendet werden.
    Hinweis: Die GASM1T1 5448 für diese Versuche verwendeten Stämme enthalten WT GAS ", ein SAGA Δ Katze SLS-defiziente Mutante (abgekürzt in Text als Δ SAGA) und ein SAGA ergänzt Stamm (abgekürzt in Text als Δ SAGA + SAGA) 21.
  2. Bereiten Sie über Nacht Flüssigkulturen von Bakterienstämmen von Interesse. Wachsen GAS M1T1 5448 Stämme in -10 ml Todd-Hewitt-Brühe bei 37 ° C für 16-20 Stunden vor menschliche Zellen zu infizieren.
  3. Zentrifuge über Nacht Bakterienkulturen (2.400 rcf für 10 min) und resuspendieren in frischen Bakterien Medium.
    Anmerkung: Resuspension in dem gleichen Volumen wie die Übernachtkulturen wurden in (5-10 ml) gezüchtet erzeugt im Allgemeinen eine gewünschte anfängliche optische Dichte.
  4. Normalisieren Bakterienkulturen zugleiche Ausgangskonzentrationen durch die resuspendierten Kulturen in zusätzliche Bakterienmedium , bis die gleiche optische Dichte bei 600 nm (OD 600) Verdünnen erhalten für alle Stämme (OD 600 von 1,0 in etwa wird der Einfachheit halber empfohlen) getestet werden.
    Hinweis: In diesen Studien wurden Bakterienkulturen stationäre Phase verwendet, um Wirtszellen unmittelbar nach der Normalisierung zu infizieren. Da jedoch einige Bakterienstämme Ausgang stationäre Phase nonsynchronously kann es sinnvoll sein, Host-Infektionen mit Log-Phase Kulturen beginnen, wenn diese gefunden wird, der Fall für die Stämme von Interesse zu sein.
  5. Vor der weiteren Analyse, führen Assay eine Kolonie Auszählen der koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter in den Ausgangskulturen zu bestimmen, so dass die Multiplizität der Infektion (MOI) oder Verhältnis von Bakterien pro Wirtszelle, bestimmt werden kann.
    1. Vorbereitung 1 ml Verdünnungsreihen von Bakterienkulturen, die dem gewünschten optischen densi normalisiert wurdenty in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder geeigneten Bakterienwachstumsmedium (wurde Todd-Hewitt-Brühe in diesen Studien verwendet). Bereiten Verdünnungen im Bereich von 10 -1 bis 10 -6 mindestens einen Satz von Agarplatten mit zählbare Kolonien zu produzieren (30-300 Kolonien). Führen Sie alle Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung.
    2. Übertragen Sie 100 ul jeder seriellen Verdünnung auf eine Agar-Platte geeignetes Medium für die Bakterienarten enthält, die analysiert werden.
      Hinweis: Todd-Hewitt-Agar wurde in diesen Studien verwendet.
    3. Verwenden Sie ein Glas oder Kunststoff bakterielle Treuer gleichmäßig die 100 ul aliquoten über die gesamte Oberfläche der Agarplatte zu verteilen und weiter verbreitet, bis die Flüssigkeit in den Agar absorbiert wurde. Führen Sie unter Flamme sterile Technik.
    4. Inkubieren Sie die Agar-Platten bei 37 ° C über Nacht oder bis zählbare Kolonien erscheinen.
    5. Zählen der Kolonien, die auf jeder Platte wachsen und berechnen die CFU / ml in der ursprünglichen Kultur durch folgende formula: Anzahl der Kolonien x Umkehrung der Reihenverdünnung / Kulturvolumen in ml plattiert.
      eg (200 Kolonien x 1/10 -5 Verdünnung) / 0,1 ml ausplattiert = 2,0 x 10 8 CFU / ml

2. Host Cell Culture

  1. Erhalten Sie geeignete Wirtszelllinie für die gewünschten Analysen.
    Hinweis: HaCaT Keratinozyten humanen epithelialen 29, eine Art Geschenk von V. Nizet, wurden für diese Untersuchungen verwendet.
    1. Pflegen HaCaT-Zellen in 100 mm Kulturschalen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2.

3. Wirtszelle Infektion mit durchlässigem Membran-Insert System

  1. Platten-Zellen in geeigneten Gewebekulturschalen und es ihnen ermöglichen, zu wachsen, bis sie 90% Konfluenz erreichen.
    Hinweis: Die HaCaT-Zellen in diesen Untersuchungen verwendet typischerweise erreichen Konfluenz in 2-3 days nach der Plattierung.
    1. Für Lysat Sammlung (zB Analyse Signalisierung und Adenosintriphosphat (ATP) Bestimmung Assays), Platte HaCaT - Zellen in 6 - Well - Platten bei einer Aussaatdichte von etwa 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung.
    2. Für die Immunfluoreszenz Bildgebung Experimente, Platten Zellen auf sterilen Glasplättchen innerhalb von 6 - Well - Platten bei einer Aussaatdichte von etwa 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung.
    3. Für Ethidiumhomodimer Membranpermeabilisierung und Laktat - Dehydrogenase (LDH) Freisetzung Assays Platte HaCaT - Zellen in 24 - Well - Platten bei einer Aussaatdichte von ca. 5 x 10 4 Zellen / Vertiefung.
  2. Unmittelbar vor der Behandlung, waschen Sie die Zellen mit 1x sterilem PBS.
  3. Tragen Sie frisches Wachstumsmedium zu den Zellen. Für die hier beschriebenen Bedingungen gelten 2 ml Medium pro Vertiefung für Platten mit 6 Vertiefungen oder 0,5 ml Medium pro Well für 24-Well-Platten. Wenn pharmakologische Behandlungen getestet werden, mit frischem Medium vermischen und während dieser ste geltenSeite
    Hinweis: Einige Tests erfordern alternative Medien. Zum Beispiel, wie Phenolrot und hohe Serumkonzentrationen mit der LDH-Freisetzungstest stören, Phenolrot-freiem DMEM mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (w / v) ergänzt, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat war für diese Experimente verwendet.
  4. Nach frischem Medium aufgebracht wurde, legen Sie vorsichtig mit einer sterilen 0,4 um durchlässige Membran Einsatz in jeder Vertiefung. Führen Sie diesen Schritt in einer Laminar-Flow-Haube, und verwenden Sie sterile Pinzette die durchlässige Membran Einsatz in jede Vertiefung zu übertragen.
  5. Bewerben frische Zellkulturmedium in die obere Kammer jeder Vertiefung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die hier beschriebenen Bedingungen gelten 1 ml Medium pro Vertiefung für Platten mit 6 Vertiefungen oder 0,1 ml Medium pro Well für 24-Well-Platten.
  6. Tragen Sie ein geeignetes Volumen von normalisierten Bakterienkulturen in die obere Kammer des durchlässigen Membran Einsatzsystem (siehe Abschnitt 1). Verwenden Sie bakterielle Medium für nicht infizierte control-Behandlungen. Für die hier beschriebenen Ergebnisse wurden 25 ul der normierten Kulturen pro Kammer für 24-Well-Platten und mit 100 & mgr; l der Kulturen pro Kammer für 6-Well-Platten hinzuzufügen.
    Hinweis: In diesen Studien Wildtyp oder mutierte GAS angewendet wurde Wirtszellen, bei einer MOI von 10 MOI wurde auf der Grundlage der endgültigen eukaryotischen Zellzahl berechnet (beispielsweise 2 x 10 6 Zellen / Vertiefung), so dass 10 - mal so viele Bakterien zu Beginn der Infektionsperiode pro Wirtszelle hinzugefügt wurden (zB 2 x 10 7 CFU pro Vertiefung). Entsprechende MOI wird mit verschiedenen Bakterienarten variieren und mit den gewünschten Follow-up-Analysen.
    Hinweis: Neben der Verwendung von Bakterienmedium für nicht infizierte Kontrollen, andere nützliche Kontrollen für bestimmte Anwendungen dieser Technik kann durch Hitze abgetötete Bakterien oder Bakterien verbrachte Medium zum Vergleich enthalten.
  7. Inkubieren infizierten Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.

4. Probensammlung

  1. So sammeln Zellkulturmedium, Wirtszelllysaten oder Glasplättchen mit intakten Zellen für Follow-up-Analysen, zunächst sorgfältig die durchlässige Membran Einsatz mit einer sterilen Pinzette entfernen.
  2. Für die Beurteilung der sekretierten Host-protiens:
    1. Sammeln Sie das Medium aus der unteren Kammer in 1,5-ml-Röhrchen. Vermeiden Sie die einschichtige während des Sammelns zu stören.
    2. Zentrifuge Proben bei 14.000 rcf für 10 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu entfernen.
    3. Entfernen Sie alle 50 & mgr; l des Überstands in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und bei -20 ° C oder sofort ab.
  3. Für die Beurteilung der Wirtszelle Lystates:
    1. aspirieren vorsichtig das Medium über der Monoschicht von Wirtszellen. Vermeiden Sie die Monoschicht zu stören, da dies in der Probenverlust führen kann.
    2. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS.
    3. Vorsichtig absaugen PBS. Sofort ein geeignetes Volumen eiskaltem Lysepuffer gelten die gewünschte Proteinkonzentration zu erreichen, und brüten dieProben auf Eis für 15 min. Bewerben zwischen 200 & mgr; l und 350 & mgr; l Lysepuffer pro Vertiefung jeder 6-Well-Platte Proteinkonzentrationen zwischen 0,5 und 1,5 mg / ml zu erreichen.
      Hinweis: Der Lysepuffer in diesen Studien verwendet wurde entionisiertes Wasser zusammengesetzt ist, 1% (v / v) Nonidet P40 Substitute, einem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und ein Protease-Inhibitor-Cocktail. Spezifische Reagenzien werden in den Materialien und Geräte aufgeführt.
    4. Verwenden Sie einen Zellschaber, die Zellen von der Plattenoberfläche jeder Vertiefung und Pipette den gesamten Inhalt jeder Vertiefung in ein 1,5-ml-Röhrchen zu lösen.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 rcf für 20 min bei 4 ° C.
    6. Um lösliche Lysatbestandteilen beurteilen zu können, entfernen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und bei -20 ° C oder sofort verwenden.
    7. nukleare oder andere unlösliche Lysatbestandteilen Um beurteilen zu können, behalten sich das Pellet und bei -20 ° C oder sofort verwenden.
  4. Für die Beurteilung von Immunfluoreszenz-Bildgebung:
    1. WiePiraten Medium und waschen Sie die Zellen in 1x kaltem PBS.
    2. Fix Zellen über Nacht in 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung in PBS (w / v).
      Hinweis: In diesen Studien wurden 1 ml PFA pro Vertiefung jeder 6-Well-Platte gegeben wurde.

5. Vorgeschlagene Anwendungen

  1. Host-Signal Transduction Analyse durch SDS-PAGE und Western Blotting
    1. Sammeln Sie Wirtszelllysaten, wie in Abschnitt 4.3 beschrieben.
    2. Bestimmung der Proteinkonzentration jeder Probe Lysat von Bicinchoninsäure (BCA) -Assay o.Ä. Proteinstandards 30.
    3. Normalisieren Proteinkonzentrationen zwischen den Proben vor dem Laden und Ausführen der Proben auf einem 4-15% igen Polyacrylamidgel oder andere geeignete 31.
      1. Normalisieren Probenkonzentrationen durch Pipettieren die gleiche Proteinmenge aus jeder Probe (beispielsweise 20 & mgr; g) in ein neues 1,5 - ml - Röhrchen und Zugabe von variablen Volumina Lysepuffer (Puffervolumen = Gesamtvolumen - Probenvolumenhinzugefügt) zu jedem Röhrchen , das Gesamtvolumen (beispielsweise 50 & mgr; l) und Protein - Endkonzentration äquivalent in Proben zu machen.
    4. Transfer Proben auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran (oder Äquivalent). Für die hier beschriebenen Ergebnisse, übertragen Proben bei 25 Volt für 2 Stunden, bevor die Spannung auf 70 Volt für weitere 45 min erhöht wird. Verwenden Transferpuffer aus 200 mM Tris-Base, 1,5 M Glycin und 20% Methanol (v / v) in entionisiertem Wasser.
    5. Block Membranen in 5% BSA + 0,1% Tween 20 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS). Entsprechend anpassen basierend auf den Empfehlungen des Herstellers für die Antikörper verwendet werden.
    6. Inkubieren Membranen mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie bei Hersteller empfohlenen Verdünnung.
    7. Waschen Membranen für 1,5 h in TBS + 0,1% Tween 20; Refresh alle 10-15 min puffern.
    8. Inkubieren mit Meerrettichperoxidase (HRP) -konjugiertem sekundärem Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 5000 1,5 h bei Raum temperature.
    9. Waschen Membranen für 1,5 h in TBS + 0,1% Tween 20; Refresh alle 10 Puffer - 15 min.
    10. Inkubieren Membranen mit Chemilumineszenz Nachweisreagenz vor der Entwicklung auf dem Film entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Andere Detektionsverfahren können wie gewünscht verwendet werden.
  2. Wirtszelle Immunfluoreszenzanfärbung und Imaging
    1. Fix Deck enthaltenden Wirtszellen, wie in Abschnitt 4.4 beschrieben.
    2. Entfernen PFA-Lösung und waschen Deck behandelten Zellen zweimal in PBS, das, Absaugen zwischen Wäschen.
      Hinweis: PFA ist sehr giftig und müssen ordnungsgemäß entsorgt werden.
    3. Blockieren die Deckgläser für 2 Stunden bei Raumtemperatur in PBS mit 1% (w / v) normales Ziegenserum, 2% (v / v) Triton X-100 und 0,5% (v / v) Tween 20.
    4. Waschen Sie Deckgläser mit PBS für 30 min, erfrischende den Puffer alle 10 min.
    5. Inkubieren Sie die Deckgläser mit dem primären Antikörper bei einem 01.50-Verhältnis (oder wie vom Hersteller empfohlen) in Sol blockiertution über Nacht bei 4 ° C.
    6. Waschen Sie die Deckgläser für 1,5 Stunden in PBS, erfrischend die alle 30 min puffern.
    7. Inkubiere die Deckgläser für 2 h bei Raumtemperatur in Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-IgG AlexaFluor488 für diese Studien verwendet wurde) unter Verwendung einer 1: 200-Verhältnis von Antikörper zu Blockierungslösung.
    8. Wash Deckgläser für 1 Stunde, alle 20 min den Puffer zu aktualisieren.
    9. Wenden Sie gewünschte Flecken.
      Hinweis: Diese Studien verwendeten DAPI (Kernfärbung) und Rhodamin-Phalloidin (Aktin-Färbung) in Verhältnissen von 1: 1000 in Blocking-Lösung.
    10. Inkubieren Deckgläser mit nuklearen und Aktin-Flecken für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    11. Waschen Sie Deckgläser in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, erfrischend die alle 10 min puffern.
    12. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasplatten mit Montagemedium.
    13. Lassen Sie Deckgläser auf den Folien zu setzen über Nacht vor dem Versiegeln und Bildgebung. Für die hier beschriebenen Ergebnisse, sammeln Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop using eines Standard 20X Ziel. Verwenden Sie ImageJ und Mikroskop-Imaging-Software die aufgenommenen Bilder zu verarbeiten.
  3. Ethidiumhomodimer Cell Death Assay
    1. Absaugen Medium aus jeder Vertiefung und die Zellen zweimal mit sterilem PBS waschen.
    2. Bewerben 4 uM Ethidiumhomodimer-1 in PBS.
    3. Inkubiere Zellen bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln.
    4. Bestimmen Sie das Niveau der Fluoreszenz eines Plattenlese auf 528 nm Anregung und 617 nm Emission mit einem Cut-off-Wert von 590 nm verwendet wird.
    5. In 0,1% (w / v) Saponin in jede Vertiefung nach der ersten Lesung und lassen Sie die Platte für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur (mit rocking) inkubiert, bevor die Platte ein zweites Mal bei den gleichen Einstellungen zu lesen.
    6. Bestimmen Prozent Membranpermeabilisierung individuell für jeden gut durch die anfängliche Fluoreszenz Dividieren Lesen (Nachbehandlung) durch die zweite Fluoreszenzmesswert (post-Saponin).
  4. ATP Bestimmung Assay
    1. Lysaten sammeln als 4.3 in Abschnitt beschrieben.
    2. Normalisieren Proteinspiegel in den Lysaten durch BCA - Assay oder ähnliches 30.
    3. Bestimmen Sie zellulären ATP-Spiegel mit einem Lumineszenz-basierten ATP Bestimmungskits oder gleichwertig gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Normalisieren behandelt Werte zu den entsprechenden nicht-infizierten Kontrollproben.
  5. LDH-Freisetzungstest
    1. Nach der Infektion sammeln Stände, wie in Abschnitt 4.3 beschrieben.
    2. Bewerten LDH-Freisetzung eine Zytotoxizität Nachweis-Kit für LDH-Freisetzung unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die permeable Membran insert-basierte Infektionssystemprotokoll für die Untersuchung von sekretierten bakteriellen Faktoren entwickelt ist detailliert in Abbildung 1. Dieses System zur Trennung von Bakterien und Wirtszellen über eine poröse Membran , die die Wirkungen von sekretierten bakteriellen Faktoren zu beurteilen beruht, in diesem Fall Streptolysin S (SLS), auf dem Host - Reaktionen, wie Host - Membranintegrität, zelluläre Lebensfähigkeit der zellulären Signaltransduktion und sezernierten Wirtszellfaktoren dar. 2 stellt repräsentative Western Blot Daten , die zeigen , dass dieses System verwendet werden kann , Änderungen in der Aktivierung des Kontakts zu beurteilen -unabhängigen Host signal~~POS=TRUNC. Im einzelnen zeigen die repräsentativen Daten p38 MAPK-Aktivierung in Gegenwart von SLS-produzierenden GAS-Stämme signifikant verbessert. Dieses System kann auch die Effekte von sekretierten bakteriellen Faktoren auf Wirtsproteinlokalisierung durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie sichtbar zu machen angewendet werden ( Abbildung 3). Die Daten zeigen , SLS-abhängige Aktivierung des Schlüssels Entzündungsmediators Nuclear Factor kappa B (NFKB), die aus dem Cytoplasma bei Aktivierung 21 zum Kern transloziert. Die Ergebnisse in den Figuren 2 und 3 zeigen , daß sowohl SLS-abhängige Entzündungssignalisierungsantworten erfordern nicht den direkten Kontakt zwischen den Bakterien und Wirtszellen. Wie frühere Versuche haben bereits SLS-abhängige gezeigt p38 und NFKB - Aktivierung in direkten Infektionsmodellen 21, ähnliche Niveaus von p38 oder NFKB - Aktivierung unter den drei GAS - Stämme in der permeablen Membran insert-basiertes System hätte angezeigt , dass die Antwort einen direkten Kontakt zwischen dem erforderlichen Bakterien und Wirtszellen. Abbildung 4 zeigt , dass diese Infektionssystem angewendet werden kann toxin abhängige Änderungen in Wirts Zytotoxizität über Ethidium Homodimer und LDH - Freisetzungstests zu bewerten. Dies wird durch die signifikante Zunahme i bewiesenn beide Membranpermeabilisierung und in der Freisetzung von LDH aus Host GAS-Stämmen exponierten Zellen SLS enthalten, im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen oder mit dem SLS-defizienten Stamm exponierten Zellen. Diese Veränderungen in Zytotoxizität nicht sofort, da signifikante Wirkungen nicht offensichtlich, bis 12 Stunden nach der Infektion im Falle Membranpermeabilisierung und 16 h im Fall der LDH-Freisetzung. Die repräsentativen Daten veranschaulichen die Bedeutung der Auswahl der geeigneten Zeitpunkten und Infektionsbedingungen für die Auswertung dieser Wirtsreaktionen. Zusätzlich zur Bewertung der Host - Signalisierungsänderungen ermöglicht und Zytotoxizität, die permeable Membran insert-basierten Infektions System ist anwendbar auf die Untersuchung von Stoffwechselveränderungen , wie beispielsweise eine genaue Bestimmung von Wirts ATP - Spiegel durch bakterielle Kontamination von Wirtszelllysaten verhindern (Figur 5) . Diese Daten zeigen einen signifikanten Verlust von Keratinozyten ATP als Reaktion auf GAS-Infektion um 16 Stunden nach der Infektion, mit erhöhter ATP Verlust in die Anwesenheit von SLS. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den beobachteten Toxin abhängige Erhöhungen der Host-Stress-Response-Signalisierung und Zytotoxizität.

figure-results-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der durchlässigen Membran Insert-Based - Infektion System - Protokoll über die Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Faktoren auf die Wirtszellen zur Beurteilung humanen Keratinozyten sind überzogen im unteren Fach und zu 90% Konfluenz gezüchtet.. Eine Kollagen beschichtete Membran mit 0,4 um Poren trennt die oberen und unteren Kammern, und Bakterien werden in die obere Kammer der permeablen Membran Einsatzsystem für die gewünschte Infektionsperiode hinzugefügt. Zellkulturüberstände und Wirtszellen können nach der Infektionsperiode und verwendet für eine Vielzahl von Analysen gesammelt werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehendieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2:. Die permeable Membran Insert-Based - Infektion Das System kann für Wirtszelle Lysate Analyse durch SDS-PAGE und Western Blotting verwendet werden Die repräsentativen Daten zeigen , dass SLS Aktivierung des p38 MAPK - Weg in infizierten Keratinozyten verbessert. (A) HaCaTs wurden mit GAS infiziert 7 h über die durchlässige Membran Einsatz Infektion System (bei ​​MOI = 10) und Lysate wurden für die Aktivierung von p38 bewertet. (B) Densitometry aus drei unabhängigen Western Blots wurde durchgeführt , um die relative Aktivierung von p38 als Reaktion auf GAS'infection zu quantifizieren. Mittelwerte aus drei biologischen Replikate angezeigt, mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Relative Aktivierung von p38 als phosphoryliert / Gesamtproteinebene vertreten. statistische Signifikanz wurde bestimmt im Vergleich zunicht-infizierte Zellen. Die Gesamt-p-Wert wurde durch ANOVA (p = 0,0063) bestimmt. Dunnetts Tests wurden post hoc jede Bedingung an die entsprechende nicht-infizierten Kontrolle zu vergleichen bedeuten. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 bis 0,001; ****, P <0,0001. Diese Zahl hat sich von Flaherty et al modifiziert. 2015 21. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3:. Die permeable Membran Insert-Based - Infektion System ermöglicht die Visualisierung von Host Änderungen der Signalgebung durch Immunfluoreszenzmikroskopie Die repräsentativen Daten zeigen , dass Streptolysin S verbessert proinflammatorischen Signal durch die Aktivierung von NFkB. HaCaT Keratinozyten wurden mit GAS bei einem M infiziert OI von 10 für 8 Stunden die durchlässige Membran Insert-basierten Infektion System. (A und B) Kernlokalisation von NFKB wurde durch Immunofluoreszenz Abbildungs ​​beurteilt. Der Prozentsatz der Kern lokalisierten Zellen wurde durch Zählen der Anzahl der Zellen berechnet, in der NFKB aus dem Zytoplasma in den Zellkern für ein gegebenes Feld transloziert hatte, und diese Zahl durch die Gesamtzahl der Zellen für dasselbe Feld teilt. Maßstabsbalken zeigen an 100 & mgr; m. (A) Der Durchschnitt der drei biologischen Replikate sind für jede Bedingung mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung dargestellt. Die Gesamt-p-Wert wurde durch ANOVA bestimmt; p <0,0001. Dunnetts Tests wurden durchgeführt, jede Bedingung zu dem entsprechenden nicht-infizierten Kontrollbedingung zu vergleichen. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 bis 0,001; ****, P <0,0001. Diese Zahl wurde von Flaherty et al modifiziert. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-4
Abbildung 4:. Die permeable Membran Insert-Based - Infektion System ermöglicht die Bestimmung von Bakterien-Mediated Membranpermeabilisierung und Zytotoxizität in Abwesenheit von direkten Kontakt zwischen Bakterien und Wirtszellen Die repräsentativen Daten zeigen , dass Keratinozyten Lebensfähigkeit nimmt in Gegenwart von aktiven SLS - Toxin . GAS - induzierten Zelltod wurde untersucht in HaCaT - Zellen in Gegenwart von WT, SLS-defizienten oder Säga GAS ergänzt Keratinozyten wurden GAS ausgesetzt , um die durchlässige Membran mittels Insert-basierten Infektionssystem für 8-16 h bei einer MOI von 10 (. A) Die Lebensfähigkeit wurde durch Ethidium Homodimer - Assay bewertet oder (B) LDH - Freisetzungstest. In beiden Platten, 3 redadurch erschwert werden gemittelt und Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bedeutung für jeden Zeitpunkt wurde durch ANOVA (A) 8 h, p = 0,0241 bestimmt; 12 h, p <0,0001 (B) 8 h, p = 0,0287; 12 h, p = 0,1977; 16 h, p = 0,0031. Dunnetts Tests wurden Mittel aus jedem Zustand in den Wildtyp-Infektion für den entsprechenden Zeitpunkt zu vergleichen. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 bis 0,001; ****, P <0,0001. Diese Zahl hat sich von Flaherty et al modifiziert. 2015 21. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-5
Abbildung 5: Die permeable Membran Insert-Based - Infektion System ermöglicht eine genaue Bestimmung von Host ATP Levels von Bact Verhindernerial Kontamination von Wirtszelllysaten. Die repräsentativen Daten zeigen SLS abhängige Verlust von ATP während Gruppe A Streptokokken - Infektion. HaCaT-Zellen wurden mit GAS infiziert für 8-16 h mit der durchlässigen Membran Insert-basierten Infektion System. Technische Replikate (n = 3) von einem Vertreter biologische Replikation (2 × 10 6 Zellen pro Probe) wurden für jede Bedingung gemittelt, mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Die Gesamt p-Werte wurden durch ANOVA (12 h, p <0,0001; 16 h, p <0,0001) bestimmt. Dunnetts Tests wurden durchgeführt, jede Bedingung mit Wildtyp-Infektion für den entsprechenden Zeitpunkt zu vergleichen. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 bis 0,001; ****, P <0,0001. Diese Zahl hat sich von Flaherty et al modifiziert. 2015 21. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin wird ein Verfahren unter Verwendung einer permeablen Membran insert-basierten Infektionssystem beschrieben , um die Wirkungen des bakteriellen Toxins Streptolysin S auf menschlichen Epithelzellen Keratinozyten in einem in vitro - System zu untersuchen. Dieses Protokoll kann für die Untersuchung von anderen sezernierten bakterielle Virulenzfaktoren sowie alternative Wirtszelltypen angepasst werden. Das kürzlich entwickelte System bietet mehrere Vorteile gegenüber experimentellen Methoden , die gereinigten Toxinen oder gefiltert Bakterienüberstände 1 nutzen - 3,8,18 - 20. Die permeable Membran insert-basiertes System bietet eine ständig aufrechterhalten Dosis des betreffenden bakteriellen Toxins an Wirtszellen, wie es erzeugt wird, welche die Aktivität maximal Toxins ermöglicht aufrechterhalten werden und erhöht auch die Konsistenz zwischen den Experimenten. Darüber hinaus ahmt mehr dieses System genau physiologischen Bedingungen, indem der sezerniert Faktor im Laufe der Zeit ansammeln, da die Infektion fortschreitet und von elimidie Notwendigkeit Ursprung willkürlich bestimmte Toxin-Konzentrationen zu wählen anwenden Wirtszellen. Darüber hinaus würde dieses System auch Mittel zur Verfügung stellen für die Ermittler, ob eine bakterielle Faktor von Interesse zu bewerten geliefert Zellen in einer kontaktabhängige Weise zu hosten. Kontakt-Abhängigkeit wird durch die Erzeugung von isogenen bakteriellen Mutanten defizient in Anhaftung oder durch die Verwendung von Reagenzien häufig getestet, das Anhaften zu verhindern. Das hier beschriebene System würde eine einfache Alternative zu ergänzen oder diese traditionellen Ansätze ersetzen.

Zusätzlich zu den in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben getestet, andere Anwendungen, für die diese Infektion System leicht umfassen die Entnahme von Proben für die Zytokin-Arrays und ELISA-Assays angepasst werden könnten. In diesen beiden Fällen für LDH-Freisetzungstests, daß ein ähnliches Protokoll zu beschrieben sind, können befolgt werden. Obwohl hier nicht gezeigt, wurde dieses System verwendet, um effektiv Wirtszellproben sammeln a seinnalyzed mittels Durchflusszytometrie. In dieser Anwendung wird die permeable Membran Einsatz nach der Infektionsperiode entfernt, die Zellen gewaschen Zellkulturmedium zu entfernen, und wird Trypsin Sammlung der Zellen für die Analyse zu ermöglichen, aufgetragen. Die physikalische Trennung der Bakterien von Wirtszellen ist besonders nützlich für diese Anwendung, da es die Bildung von großen Aggregaten, bestehend aus anhaftenden Bakterien und Wirtszellen zu verhindern hilft, die sonst mit genauen Zellzählung durch das Durchflusszytometer stören könnten.

Obwohl sehr konsequent Wirtsreaktionen beobachtet wurden , wenn die Ergebnisse der durchlässigen Membran Insert-basierten Infektionsstudien mit traditionellen direkte Infektion Studien zum Vergleich wurden einige bemerkenswerte Unterschiede in der Kinetik dieser Wirtsreaktionen wurden 21 beobachtet. Zum Beispiel können Veränderungen in Host-Signalisierung und membranbasierten Zytotoxizität nehmen 30-50% längere Einsatzbasierte Infektionsmodell in der durchlässigen Membran als cor auftretenreagiert direkte Infektion Modelle. Weil die permeable Membran insert-basiertes System Medium erfordert auch zu den oberen und unteren Kammern eines jeden angewandt werden, entwickelt das System für die hier beschriebenen Untersuchungen erforderlich, um eine 30% ige Erhöhung der Gesamtmittelvolumen pro Vertiefung im Vergleich zu entsprechenden vorher direkten Infektionsmodellen verwendet 21. Dieser Unterschied in der Gesamtmittelvolumen, verbunden mit der erhöhten Abstand zwischen Bakterien und Wirtszellen, wenn direkter Kontakt verboten ist, erhöht sich wahrscheinlich die Zeit, die für die SLS durch das Medium zu diffundieren, um Wirtszellen zu erreichen, und die beobachteten Effekte hervorzurufen. Außerdem entfernt die durchlässige Membran Insert-basierte System Faktoren viele GAS Virulenz, die Zellschäden, die einen Beitrag zu veranstalten; das Fehlen dieser zusätzlichen Faktoren in diesem System ist wahrscheinlich auch der Verzögerung in Wirts Zelltod und Initiierung von Host Signalisierungsereignisse im Vergleich zu direkten Infektion 21 beizutragen. Diese Faktoren sollten in Betracht gezogen werdenwenn Experimente Entwerfen anderer sekretierter bakteriellen Komponenten zu beurteilen.

Zu identifizieren, die am sinnvollsten Bedingungen zum Testen der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Faktoren auf Wirtszellen, Testen einer Reihe von Zeitpunkten für jede Anwendung der permeablen Membraneinsatzes basierten Infektionssystem empfohlen wird. Es ist wichtig , unter zu prüfen , welche Bedingungen die spezifische Virulenzfaktoren von Interesse ist optimal produziert (zB log - Phase, stationäre Phase, in Reaktion auf bestimmte Umweltsignale, etc.) , um ihre Auswirkungen zu erfolgreich zu beobachten. In Experimenten konzentrierte sich auf Veränderungen in Wirtssignalproteine ​​Auswertung war es notwendig , den Zeitpunkten auszuwählen , die ausreichend Zeit erlaubt , für SLS Wirtszellen zu erreichen , und in ausreichenden Mengen produziert werden Signalisierungs 21 wechselt zu induzieren. Zur gleichen Zeit, Bewertung von Änderungen in Wirts Signalisierung benötigt, um vor der SLS-induzierte Membranpermeabilisierung durchgeführt werden, da dieser Effekt complicates die Sammlung von Wirtszelllysaten für die Analyse. Zelltod durch SLS induzierte optimal in direkten und permeable Membraneinsatz basierte Infektionsmodellen mehrere Stunden nach dem Beginn der berichteten Signalereignisse 21 beobachtet werden konnte. Weiterhin Zeitpunkte von Interesse bei der Auswahl ist es auch wichtig, sicherzustellen, dass die Bakterien nicht in der Lage sind, untersucht wird, um die poröse Einsatz Membran während der Dauer der Studie zu durchdringen. Die Herstellung von bestimmten bakteriellen Komponenten über einen längeren Zeitraum kann die Integrität der Membran stören und den Durchtritt von Bakterien zu der unteren Kammer zu ermöglichen. Um festzustellen, ob dies ein potentielles Problem in dem System von Interesse ist, werden die Bakterienstämme untersucht können bei einer Reihe von Zeitpunkten in die obere Kammer der permeablen Membran insert-basiertes System angewendet werden. Zu jedem Zeitpunkt kann der Einsatz sorgfältig entfernt werden und das Medium von der unteren Kammer kann in einem Standardkolonie co gesammelt und verwendet werden,unting-Test (siehe Abschnitt 1.5). Wenn keine Kolonien aus dem Zellkulturmedium in der unteren Kammer ausgebildet sind, kann der Einsatz Membran angenommen werden, wirkungsvoll den Durchgang von Bakterien zu dem Zeitpunkt und bakterielle Belastung getestet werden verhindert.

Ein weiteres experimentelles Design-Komponente, die für die effektive Analyse der sekretierten bakteriellen Faktoren wahrscheinlich erfordern Optimierung ist die Multiplizität der Infektion (MOI). Das MOI bezieht sich auf das Verhältnis von Bakterienzellen pro Wirtszelle und daher durch Wirtszelle Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion und durch die Anzahl der Bakterienkolonie-bildenden Einheiten (CFU), die auf den Zellen beeinflusst wird. In diesen Studien wurden Keratinozyten-Zellen auf 90% Konfluenz gezüchtet, die diese Zellen erlaubt eine zusammenhängende Monoschicht mit intakten tight junctions zu bilden. Thoughtful Berücksichtigung der physiologischen Organisation der Wirtszellen untersucht werden soll, notwendig, eine geeignete Konfluenz für Infektionsversuche auszuwählen. Sobald ein appropriate Anzahl von Wirtszellen pro Vertiefung bestimmt wird, eine geeignete bakterielle CFU berechnet werden kann, um die gewünschte MOI basiert. In den Studien hier beschrieben wurde GAS angewendet Zellen bei einer MOI von 10. Entsprechende MOI hosten mit verschiedenen Bakterien und mit den gewünschten Follow-up-Analysen variieren. Ein niedriger Anfang MOI ist typischerweise physiologisch relevanten und ermöglicht die bakteriellen Faktor von Interesse langsam genug zu akkumulieren subtile Veränderungen in Wirtszellsignalisierung vor dramatischen Veränderungen in Wirtszelllebensfähigkeit zu erfassen, sind evident. Höhere MOIs werden in vielen Studien verwendet Zytotoxizität Beurteilung, aber dieser Effekt kann auch durch beginnend mit einer niedrigen MOI erreicht werden und damit die Infektion für einen längeren Zeitraum fortschreiten. Es ist wichtig, eine genaue CFU auf optische Dichte Folge zu bestimmen, die für alle Bakterienstämme getestet werden, wie isogenen Mutanten eine veränderte Wachstumsrate Wildtyp-Bakterien im Vergleich zu aufweisen können und erfordern daher, dass eine höhere oder niedrigere CFU pro Vertiefung zugegeben werden, umeinen angemessenen Vergleich der Host-Reaktion zwischen den Stämmen zu gewährleisten. In Fällen, in denen die Säugerwirtszellen, deren Wachstum von der Abtötung von Bakterien fähig sind oder Hemmen oder wenn nicht synchrone Wachstum zwischen Bakterienstämmen vermutet wird untersucht, kann es auch nützlich sein, Untersuchungen durchzuführen, die endgültige Bakterienlast am Ende der Infektionsperiode zu bewerten. Dies könnte durch Sammeln des Inhalts des durchlässigen Einsatzes erreicht werden und einen Koloniezählung Assay ähnlich dem in Abschnitt 1.5 des beschriebenen Verfahrens durchgeführt wird.

Auswählen geeigneter Größe Vertiefungen für den gewünschten Assay ist auch wichtig, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Durchlässigem Membran-Einsätze sind in einer Vielzahl von Größen zur Verfügung, aber die meisten konsistente Ergebnisse für die Studien hier gezeigten Darstellungen wurden unter Verwendung von Einsätzen ausgelegt für 24 gut und 6-Well-Gewebekulturplatten beobachtet. Diese Insertgrößen sind relativ einfach mit einer sterilen Pinzette zu handhaben, und die Leichtigkeit der Manipulation ist kritisch in Preventing unerwünschte Übertragung von Bakterien von der oberen Kammer zu der unteren Kammer des Brunnens. Für Experimente, die die Sammlung von Wirtszelllysaten beteiligt, 6-Well-Platten bieten eine geeignete Zellzahl pro Bedingung für die meisten Analysen und sind groß genug, Zellschaber für die Probenentnahme aufzunehmen. Für Zytotoxizitätstests in dem die Wirtszellen haften bleiben und werden mit einem fluoreszierenden oder kolorimetrischen Farbstoff markiert, der auf einem Plattenlesegerät (zB Ethidium Homodimer - Assay, Trypanblau-Ausschluss - Assay) gemessen werden kann, die Verwendung eines 24 - Well - Platte mit den entsprechenden Einsätzen ist empfohlen. Für Experimente , bei denen Zellkulturmedium gesammelt und analysiert werden (zB LDH - Freisetzung, Zytokin - Studien) entweder die 24 - Well - oder 6 - Well - Platten verwendet werden können, obwohl die kleineren Vertiefungen typischerweise eine ausreichende Probenvolumina für diese Analysen zur Verfügung stellen und die Nutzung der erforderlichen minimieren Reagenzien. Insgesamt ist das Verfahren sehr vielseitig und können nach Bedarf angepasst werden sampl vorzubereitenes für zahlreiche Folgeanträge.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken unseren Kollegen von Lee Lab, die wertvolle Einblicke und Fachwissen zur Verfügung gestellt haben, die diese Forschung sehr unterstützt haben. Diese Arbeit wurde durch den Young Innovator Award des National Institute of Health unterstützt, der an S.W. Lee verliehen wurde (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty wird durch das Albertus Magnus Fellowship von Dr. Robert C. Boguslaski und eine Lehrassistenz durch das Eck Institute for Global Health an der University of Notre Dame unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Todd-Hewitt BrüheAcumedia7161AVerwenden Sie eine geeignete Brühe für Bakterienarten von Interesse.
BioSpektrometerEppendorfBasismodellJedes UV-Vis-Spektralphotometer ist geeignet.
PetrischalenFisher ScientificFB0875713Andere Marken sind geeignet.
AgarSigmaA1296-1kgAndere Marken sind geeignet.
HaCaT humane epitheliale KeratinozytenGeschenk aus dem Labor von Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11995-073Verwenden Sie geeignete Medien für die interessierende Zelllinie.
Fötales Rinderserum (FBS)BiowestS162HVerwenden Sie geeignete Medienadditive für die gewünschte Zelllinie.
10 cm GewebekulturschalenNunc150350Andere Marken sind geeignet.
6-Well-GewebekulturschalenCytoOnecc7682-7506Andere Marken sind geeignet, müssen aber mit dem Corning-Einsatz kompatibel sein.
24-Well-GewebekulturschalenCytoOnecc7682-7524Andere Marken sind geeignet, müssen aber mit dem Corning-Einsatz kompatibel sein.
GlasdeckgläserFisherbrand12-541-BDiese müssen vor der Verwendung für die Zellbeschichtung autoklaviert werden.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco10010-023
Phenolrot-frei DMEMLife Technologies31053028Phenolrot-freie Medien werden nur für den LDH-Freisetzungsassay benötigt.
Rinderserumalbumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
L-GlutaminGibco25030149Nur zur Ergänzung von Zellkulturmedien für den LDH-Freisetzungsassay erforderlich.
NatriumpyruvatGibcoBP356100Nur zur Ergänzung von Zellkulturmedien für LDH-Freisetzungsassays erforderlich.
Kollagenbeschichtet 0,4 μ m Transwell-Einsätze (6 Well)Corning3540
Kollagenbeschichtet 0,4 μ m Transwell-Einsätze (24 Well)Corning3595
PinzettenFisher 3120018Diese müssen vor der Verarbeitung von Transwell-Einsätzen mit Ethanol sterilisiert werden.
ZellabstreiferFisherbrand08-100-241Diese werden nur für die Sammlung von Zelllysaten benötigt.
ParaformaldehydFisher Scientific04042-500GIFTIG. Dies ist nur für die Immunfluoreszenzbildgebung erforderlich.
Bicinchoninsäure (BCA) Assay-KitPierce23227Andere Proteinquantifizierungsassays können verwendet werden.
Tris-Glycin 4 - 15% Polyacrylamid-Gele,BioRad4561083Puffersystem und prozentualer Polyacrylamidanteil sollten basierend auf den interessierenden Proteinen ausgewählt werden.
Elektrophoresekassette liefertBioRad1658063Nur für Western Blotting erforderlich.
Elektrophorese-NetzteilBioRad1645050Nur für Western Blotting erforderlich.
Western Blot TransferkassetteBioRadNur für Western Blotting erforderlich.
Polyvinyliden (PVDF) MembranEMD MilliporeIPVH00010Nur für Western Blotting erforderlich.
Tween 20SigmaP1379-500ml
Kaninchen IgG-HRP SekundärantikörperSanta Cruz Biotechnologysc2030Der Sekundärantikörper sollte auf der Grundlage der gewählten Nachweismethode bestimmt werden.
Maus IgG-HRP SekundärantikörperSanta Cruz Biotechnologysc2031Der Sekundärantikörper sollte auf der Grundlage der gewählten Nachweismethode bestimmt werden.
Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK AntikörperCell Signaling4511Wählen Sie geeignete Primärantikörper basierend auf den gewünschten Proteinen aus.
Gesamt p38 MAPK AntikörperCell Signaling8690Wählen Sie geeignete Primärantikörper basierend auf den gewünschten Proteinen aus.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG Alexafluor 488Molekulare SondenA-11034Andere Sekundärantikörper können für die Immunfluoreszenz-Bildgebung verwendet werden.
LumiGLO DetektionsreagenzKPL54-61-00Nur für Western Blotting mit Detektion auf Film erforderlich.
DetektionsfolieBiodotBDB57Nur für Western Blotting mit Detektion auf Film erforderlich.
DeltaVision Nikon 90i FluoreszenzmikroskopNikonFür diese Analysen eignen sich auch andere Fluoreszenzmikroskope.
Normales ZiegenserumThermo Scientific31873
Triton X-100SigmaT9284-500mL
DAPI-KernfärbungCell Signaling4083Ausgewählte Färbungen basierend auf spezifischen Immunfluoreszenzanwendungen von Interesse.
Rhodamin-Phalloidin-Aktin-FärbungMolecular ProbesR415Ausgewählte Färbungen basierend auf spezifischen Immunfluoreszenzanwendungen von Interesse.
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Nur für Immunfluoreszenz-Bildgebung erforderlich.
Ethidium-Homodimer 1Molekulare SondenE1169Nur für Membranpermeabilisierungs-Zytotoxizitätsassays erforderlich.
Spectramax M5 Mikroplatten-ReaderMolekulare GeräteAndere Mikroplatten-Reader, die UV-Vis, Fluoreszenz und Lumineszenz nachweisen können, könnten geeignet sein.
SaponinSigma47036-50G-FNur für Membranpermeabilisierungs-Zytotoxizitätsassays erforderlich.
Molekulare Sonden ATP-BestimmungskitLife TechnologiesA22066Andere Kits sind wahrscheinlich geeignet.
Zytotoxizitätsnachweis-Kit für die LDH-FreisetzungRoche11644793001Andere Kits sind wahrscheinlich geeignet.
Nonidet P40 ErsatzSigma74385-1LAndere Anbieter sind geeignet.
HALT Phosphatase-Hemmer CocktailThermo Scientific78420BAndere Cocktails sind wahrscheinlich geeignet.
SIGMAFAST Proteasehemmer Cocktail Tabletten, EDTA-freiSigmaS8830-2TABAndere Cocktails sind wahrscheinlich geeignet.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).">Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
  2. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314(2011).">Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314(2011).
  3. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970(2012).">Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970(2012).
  4. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).">Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
  5. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).">Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
  6. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).">Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
  7. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).">Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  8. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).">Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
  9. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).">Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
  10. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).">Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
  11. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).">Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
  12. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).">Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
  13. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).">Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
  14. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).">Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
  15. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).">Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
  16. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).">Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
  17. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).">Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
  18. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).">Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
  19. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).">Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
  20. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).">Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
  21. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).">Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
  22. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).">Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
  23. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).">Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
  24. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).">Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
  25. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).">Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
  26. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49(2015).">Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49(2015).
  27. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).">Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
  28. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).">Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
  29. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).">Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  30. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).">Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
  31. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).">Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Permeable Membrane InsertBacterial Toxin StudyStreptolysin SHost Cell ResponsesGroup A StreptococcusHaCaT KeratinocytesWestern Blot AnalysisImmunofluorescence ImagingMembrane Permeabilization AssayLDH Release Assay

Related Articles