Her beskrives en fremgangsmåde under anvendelse af en permeabel insert-baserede infektion systemet membran for at studere virkningerne af Streptolysin S, et udskilt toksin produceret af gruppe A Streptococcus, på keratinocytter. Dette system kan let anvendes på studiet af andre udskilte bakterielle proteiner på forskellige vært celletyper under infektion.
Mange bakterielle patogener udskiller potente toksiner til støtte i ødelæggelse af værtsvæv, at indlede signalændringer i værtsceller eller at manipulere immunsystemet reaktioner under infektionens forløb. Selvom fremgangsmåder er blevet udviklet med succes oprense og fremstille mange af disse vigtige virulensfaktorer, er der stadig mange bakterielle toksiner, hvis unikke struktur eller omfattende posttranslationelle modifikationer gør dem vanskelige at oprense og studere i in vitro systemer. Selv når der kan opnås rent toksin, der er mange udfordringer forbundet med at studere de konkrete virkninger af et giftstof i henhold til relevante fysiologiske betingelser. De fleste in vitro-cellekultur modeller designet til at vurdere virkningerne af udskilte bakterielle toksiner på værtsceller involverer inkubere værtsceller med en engangs-dosis af toksin. Sådanne fremgangsmåder dårligt tilnærme hvad værtsceller faktisk erfaring under en infektion, hvor toksin kontinuerligt produceret afbakterieceller og fik lov til at akkumulere gradvist i løbet af infektionen. Denne protokol beskrives udformningen af en permeabel membran insert-baserede bakterieinfektion system til at undersøge virkningerne af Streptolysin S, en potent toksin produceret af gruppe A Streptococcus, på humane epiteliale keratinocytter. Dette system efterligner nærmere det naturlige fysiologiske miljø under en infektion end metoder, hvor ren toksin eller bakterielle supernatanter anvendes direkte til værtsceller. Vigtigt er det, denne metode eliminerer også forspændingen af værtsresponser, der skyldes direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. Dette system er blevet udnyttet til at effektivt at vurdere virkningerne af Streptolysin S (SLS) på vært membran integritet, cellulær levedygtighed, og cellulære signalering svar. Denne teknik kan let påføres på studiet af andre udskilte virulensfaktorer på en række mammale vært celletyper at undersøge den specifikke rolle et udskilt bakteriel faktor dnder infektionens forløb.
Forståelse funktionen af bakterielle virulensfaktorer i forbindelse med værtscellen infektion er et vigtigt fokus for bakteriel patogenese forskning. Mange bakterielle patogener udskiller aktivt toksiner og andre opløselige faktorer for at hjælpe til ødelæggelse af værtsvæv, at indlede signalændringer i værtsceller eller at manipulere immunsystemet reaktioner under infektion 1 – 10. Selvom fremgangsmåder er blevet udviklet med succes oprense og fremstille mange af disse vigtige virulensfaktorer til studier, nogle bakterielle produkter har unikke strukturer eller omfattende posttranslationelle modifikationer, der gør dem genstridige kandidater til oprensningsmetoder og kan således ikke undersøges isoleret under anvendelse af in vitro-systemer . For eksempel Gruppe A Streptococcus, det bakterielle patogen, som et utal af infektioner lige fra pharyngitis til nekrotiserende fasciitis og toksisk shock syndrom, producerer en secerneretbakterielt toksin kendt som Streptolysin S (SLS) 11 – 17. Dette ribosomalt produceret peptid kodes af Streptolysin S associerede gen (SAG) klynge, og det modne produkt er estimeret til 2,7 kDa i størrelse 14 -. 17 Protoksinet, der kodes af Saga, modificeres posttranslationelt med flere enzymer (SAGB, SagC, og SagD) for at fremstille det modne, funktionelle formular 15 -. 17 Kompleksiteten af disse post-translationelle modifikationer kombineret med toksinet usædvanlige aminosyresekvens har gjort toksinet uforenelig med alle rensning og Strukturopklaring indsats, der er forsøgt til dato 15,17. Disse udfordringer har komplicerede indsats for at bestemme den særlige rolle, dette toksin i vært patogenese.
I tilfælde, hvor udarbejdelsen af oprensede toksiner eller andre udskilles faktorer er enten komplekst eller ikke er mulig, mekanismer tilbelyse funktionen af disse produkter er traditionelt blevet undersøgt gennem udarbejdelse af filtrerede bakterielle supernatanter, som derefter anvendes til værtsceller 18-20. Der er flere udfordringer forbundet med denne teknik. Første er mange af disse udskilte faktorer, herunder SLS, ikke opretholde maksimal eller sammenhængende aktivitet, når lagring og værtsceller på et senere tidspunkt. Derudover, når supernatanter opsamles på et enkelt tidspunkt og derefter anvendt til værtsceller, er det vanskeligt at bestemme fysiologiske relevans og drage direkte konklusioner om den naturlige infektion proces, hvor udskilte faktorer får lov til at akkumulere under infektion til en fysiologisk relevant koncentration. Denne anden udfordring gælder ikke kun for anvendelsen af bakterielle supernatanter, men også anvendelsen af oprensede toksiner i værtscelleproteiner studier 1 – 3,8. For at løse disse problemer, en permeabel membran Insert-baserede infektion er udviklet til at vurdere virkningerne af SLS på værtsceller på en måde, som opretholder optimal toksin-aktivitet, og også eliminerer variabel for direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. I dette system er humane epitelceller dyrket i et monolag i bunden kammer i et to kammer brønd, og bakterier indføres i det øvre kammer i samme brønd. En porøs membran (0,4 um porer) adskiller de øvre og nedre kamre, så udskilte faktorer, der skal udveksles mellem de to kamre, men forhindrer passage af bakterier. Dette system har givet mulighed for effektiv evaluering af værtens reaktioner, der alene skyldes vedvarende udskilles bakterielle komponenter samtidig fjerne alle svar, der kan opstå ved direkte kontakt under gruppe A streptokok-infektion. Skønt andre udskilte bakterielle faktorer end SLS også kan passere gennem den porøse membran, anvendelse af en isogen mutant panel herunder vildtype (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) og en saga suppleret stamme (ΔsagA + saga) giver mulighed for præcis evaluering af værtens reaktioner, der er strengt SLS-afhængige 21.
Selvom lignende permeable membran indsætte systemer er blevet anvendt til studiet af udskilte faktorer involveret i virusinfektioner, kræft biologi og immuncellemigrering 22-26, få studier, der involverer bakterielle interaktioner med værtsceller har udnyttet denne tilgang 6,27,28. Selv undersøgelser, som har beskæftiget sådanne systemer til at udforske interaktioner mellem bakterier og værtsceller har primært fokuseret på migration af inflammatoriske celler eller bakterier gennem en epitelial eller endotelmonolaget udpladet på den permeable membran insert. Den permeable membran insert-baserede infektion heri beskrevne er en enkel og effektiv metode, der bygger på adskillelse af bakterier og værtsceller via en porøs membran til at vurdere effects af det secernerede toksin, SLS, om værten membran integritet, cellulær levedygtighed, cellulær signaltransduktion, og udskilte værtscelleproteiner faktorer. Denne teknik kan tilpasses til studiet af andre udskilte virulensfaktorer på en række mammale vært celletyper til at undersøge den rolle, som en specifik bakteriel faktor i løbet af en infektion.
Heri beskrives en metode ved hjælp af en gennemtrængelig insert-baserede infektion systemet membran til at undersøge virkningerne af den bakterielle toxin Streptolysin S på humane epiteliale keratinocytter i et in vitro-system. Denne protokol kan tilpasses til undersøgelse af andre udskilte bakterielle virulensfaktorer samt alternative vært celletyper. Dette nyligt udviklet system giver flere fordele i forhold eksperimentelle metoder, der udnytter oprensede toksiner eller filtrerede bakterielle supernatanter 1 – 3,8,18 – 20. Den permeable membran insert-baserede system giver en konstant holdes dosis af det relevante bakterielt toksin til værtsceller, som det er fremstillet, som muliggør maksimal toksin-aktivitet skal opretholdes og øger også sammenhæng mellem eksperimenter. Desuden er denne ordning mere nøje efterligner fysiologiske betingelser ved at lade udskilte faktor at ophobe sig med tiden som infektionen skrider frem, og ved elimidelse behovet for vilkårligt vælge specifikke toksin koncentrationer for at anvende til værtsceller. Endvidere ville dette system også tilvejebringe midler til forskere til at vurdere, om en bakteriel faktor af interesse leveres til værtsceller i en kontakt-afhængig måde. Kontakt-afhængighed er ofte testet ved produktion af isogene bakterielle mutanter deficiente i adhærens eller ved anvendelse af reagenser, der forhindrer vedhæftning. Den her beskrevne system vil give et simpelt alternativ til at supplere eller erstatte disse traditionelle tilgange.
Udover de testede anvendelser beskrevet i afsnit 5 i protokollen, andre programmer, som denne infektion system kan let tilpasses omfatter indsamling af prøver til cytokin arrays og ELISA assays. I begge disse tilfælde kan en lignende protokol som beskrevet for LDH frigivelse assays følges. Selv om det ikke er vist her, er dette system blevet anvendt effektivt indsamle vært celleprøver at være ennalyzed ved flowcytometri. I denne ansøgning er den permeable membran insertet fjernet efter infektionen periode, vaskes cellerne for at fjerne cellekulturmediet, og trypsin anvendes til at tillade samling af cellerne til analyse. Den fysiske adskillelse af bakterier fra værtsceller er særlig nyttig til denne anvendelse, fordi det hjælper til at forhindre dannelse af store aggregater bestående af vedhæftede bakterier og værtsceller, som ellers kan forstyrre nøjagtig celletælling af flowcytometeret.
Selvom meget konsistente værtsresponser er observeret ved sammenligning af resultaterne af den permeable membran insert-baserede infektion undersøgelser med traditionelle studier direkte infektion, har nogle bemærkelsesværdige forskelle i kinetikken for disse værtsresponser blevet observeret 21. For eksempel, ændringer i vært signalering og membran-baserede cytotoksicitet tage 30-50% længere at forekomme i den permeable membran insert-baserede infektion model end correagere direkte infektionsmodeller. Fordi den permeable membran insert-baseret system kræver medium, der skal anvendes på de øvre og nedre rum i hver brønd systemet udviklet til undersøgelserne her beskrevne krævede en stigning i den samlede medium volumen 30% per brønd i forhold til tilsvarende direkte infektionsmodeller tidligere anvendte 21. Denne forskel i total medium volumen, kombineret med den forøgede afstand mellem bakterier og værtsceller når direkte kontakt er forbudt, sandsynligvis øger den tid, det tager for SLS at diffundere gennem mediet at nå værtsceller og fremkalder de observerede virkninger. Derudover permeable membran insert-baseret system fjerner mange GAS virulensfaktorer, som sandsynligvis vil bidrage til vært cellebeskadigelse; fraværet af disse yderligere faktorer i dette system er sandsynligvis også bidrage til forsinkelsen i værtscellen død og initiering af værten signalering begivenheder sammenlignet med direkte infektion 21. Disse faktorer bør overvejesnår designe eksperimenter for at vurdere andre secernerede bakterielle komponenter.
For at identificere de mest meningsfyldte forhold til test af virkningerne af udskilte bakterielle faktorer værtsceller, teste en række tidspunkter for hver ansøgning af indsatsen-baserede infektion systemet membran anbefales. Det er vigtigt at overveje, under hvilke betingelser den specifikke virulens faktor af interesse optimalt produceres (f.eks logaritmisk fase, stationær fase, som svar på visse miljømæssige signaler, etc.) for at kunne observere dens virkninger. I forsøg med fokus på evaluering af ændringer i vært signalering proteiner, var det nødvendigt at vælge tidspunkter, der tillod tilstrækkelig tid til SLS at nå værtsceller og skal produceres i tilstrækkelige mængder til at fremkalde signalændringer 21. Samtidig, at vurdering af ændringer i vært signalering behov skal foretages før SLS-induceret membranpermeabilisering, da denne effekt complicates indsamling af værtscellelysater til analyse. Celledød fremkaldt af SLS kunne optimalt observeres i både direkte og gennemtrængelig membran insert-baserede infektion modeller flere timer efter indledningen af de rapporterede signalering begivenheder 21. Endvidere ved udvælgelse tidspunkter af interesse, er det også vigtigt at sikre, at bakterierne blive undersøgt er ude af stand til at trænge igennem porøs indsats membran under studieperioden. Produktionen af visse bakterielle komponenter over en længere periode kan forstyrre integriteten af membranen og tillade passage af bakterier til det nedre rum. For at afgøre, om dette er et potentielt problem i systemet af interesse, kan de bakteriestammer, der skal undersøges anvendes på det øverste kammer i permeable membran insert-baseret system på en afstand af tidspunkter. Ved hvert tidspunkt, kan indsatsen fjernes forsigtigt, og mediet fra bunden kammer kan opsamles og anvendes i en standard koloni counting assay (se afsnit 1.5). Hvis ingen kolonier dannes ud fra celledyrkningsmediet i det nedre rum, kan indsatsen membranen antages at være effektivt forhindrer passage af bakterier til tiden og bakteriel belastning testet.
En anden eksperimenterende design komponent, der vil sandsynligvis kræve optimering for en effektiv analyse af udskilte bakterielle faktorer er mangfoldigheden af infektion (MOI). MOI henviser til forholdet af bakterieceller pr værtscelle, og derfor påvirkes af værtscelle konfluens på tidspunktet for infektion og med antallet af bakterielle kolonidannende enheder (CFU) påført til cellerne. I disse studier blev keratinocytceller dyrket til 90% sammenflydning, hvilket tillod disse celler til dannelse af en sammenhængende monolag med intakte tætte sammenføjninger. Tankevækkende overvejelse af den fysiologiske organisering af værtscellerne, der skal undersøges, er nødvendigt at vælge en passende konfluens for infektion eksperimenter. Når en approprIATE antal værtsceller pr brønd bestemmes, kan en egnet bakteriel CFU beregnes baseret off ønskede MOI. I undersøgelserne beskrevet her, blev GAS anvendt til værtsceller ved en MOI på 10. Passende MOI vil variere med forskellige bakterier og med de ønskede opfølgende analyser. En lav begyndelse MOI er typisk mere fysiologisk relevant og giver mulighed for den bakterielle faktor af interesse at akkumulere langsomt nok til at fange subtile ændringer i værtscelle signalering før dramatiske ændringer i værtscellelevedygtighed er indlysende. Højere MOI anvendes i mange undersøgelser, der vurderer cytotoksicitet, men denne virkning kan også opnås ved at begynde med en lav MOI og tillade infektionen at gøre fremskridt i en længere periode. Det er vigtigt at fastslå en nøjagtig CFU til optisk densitet konsekvens for alle bakteriestammer, der skal testes, som isogene mutanter kan have en ændret vækstrate sammenlignet med vildtype-bakterier, og kan derfor kræve, at en højere eller lavere CFU tilsættes per brønd tilsikre en passende sammenligning af værtens respons mellem stammer. I tilfælde, hvor pattedyrværtsceller blive undersøgt er i stand til at dræbe bakterier eller inhibering af deres vækst eller hvis der er mistanke asynkrone vækst mellem bakteriestammer, kan det også være nyttigt at udføre undersøgelser for at vurdere den endelige bakterielle belastning ved udgangen af infektionen periode. Dette kunne udføres ved at indsamle indholdet af permeable insert og udføre en kolonitælling assay svarende til den beskrevet i punkt 1.5 i proceduren.
Valg af passende størrelse brønde for den ønskede assay er også vigtigt for at opnå optimale resultater. Permeable membran indsatser findes i mange forskellige størrelser, men de mest konsekvente resultater for undersøgelserne vist her blev observeret ved anvendelse af indsatse beregnet til 24 brønd og 6 brønds vævskulturplader. Disse skærstørrelser er relativt nemme at håndtere med steril pincet, og nem manipulation er kritisk i Preventing uønsket overførsel af bakterier fra den øvre kammer til det nedre rum af brønden. For forsøg med indsamling af værtscellelysater, 6 brønd skåle give et passende celleantal pr betingelse for de fleste analyser og er store nok til at rumme celle skraber til prøveindsamling. For cytotoksicitet assays, hvor værtscellerne forbliver klæbende og er mærket med en fluorescerende eller kolorimetrisk farvestof, der kan måles på en pladelæser (f.eks ethidiumhomodimer assay trypan blue udelukkelse assay), anvendelse af en plade 24 med de tilsvarende skær er anbefalede. For forsøg, hvor cellekulturmedium vil blive indsamlet og analyseret (f.eks LDH frigivelse, cytokin undersøgelser) enten 24 godt eller 6 brønde kan anvendes, selvom de mindre brønde typisk give tilstrækkelige mængder prøve for disse analyser og minimere brugen af den krævede reagenser. Samlet er fremgangsmåden meget alsidigt og kan tilpasses efter behov for at forberede samples for mange opfølgende applikationer.
The authors have nothing to disclose.
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |