Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

Summary

Aquí, se describe un método que utiliza un sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable a estudiar los efectos de estreptolisina S, una toxina secretada producida por estreptococos del grupo A, en los queratinocitos. Este sistema se puede aplicar fácilmente al estudio de otras proteínas bacterianas secretadas en diversos tipos de células huésped durante la infección.

Abstract

Muchos patógenos bacterianos secretan potentes toxinas para ayudar en la destrucción de tejido del huésped, para iniciar los cambios de señalización en células huésped o para manipular las respuestas del sistema inmune durante el curso de la infección. Aunque se han desarrollado métodos para purificar y producir con éxito muchos de estos factores de virulencia importantes, todavía hay muchas toxinas bacterianas cuya estructura única o extensas modificaciones posteriores a la traducción que sean difíciles de purificar y estudiar en sistemas in vitro. Además, incluso cuando se puede obtener la toxina pura, hay muchos retos asociados con el estudio de los efectos específicos de una toxina en condiciones fisiológicas pertinentes. La mayoría de modelos de cultivo celular in vitro diseñados para evaluar los efectos de las toxinas bacterianas secretadas en células huésped implican la incubación de células huésped con una dosis de una sola vez de la toxina. Tales métodos poco se aproximan a lo que en realidad células huésped experiencia durante una infección, en donde la toxina es producida continuamente porcélulas bacterianas y permite que se acumule gradualmente durante el curso de la infección. Este protocolo describe el diseño de un sistema de infección bacteriana basada en la inserción de la membrana permeable a estudiar los efectos de estreptolisina S, un potente toxina producida por estreptococos del grupo A, en los queratinocitos epiteliales humanos. Este sistema imita más estrechamente el entorno fisiológico natural durante una infección que los métodos donde la toxina pura o sobrenadantes bacterianos se aplican directamente a las células huésped. Es importante destacar que este método también elimina el sesgo de las respuestas del huésped que se deben al contacto directo entre las bacterias y las células huésped. Este sistema se ha utilizado para evaluar eficazmente los efectos de la estreptolisina S (SLS) sobre la integridad de acogida de la membrana, la viabilidad celular y las respuestas de señalización celular. Esta técnica se puede aplicar fácilmente al estudio de otros factores de virulencia secretados en una variedad de tipos de células huésped de mamíferos para investigar el papel específico de un factor secretado d bacterianaurante el curso de la infección.

Introduction

La comprensión de la función de factores de virulencia bacteriana en el contexto de la infección de la célula huésped es un foco principal de la investigación patogénesis bacteriana. Muchos patógenos bacterianos secretan activamente toxinas y otros factores solubles para ayudar en la destrucción de tejido del huésped, para iniciar los cambios de señalización en células huésped o para manipular las respuestas del sistema inmune durante el curso de la infección ^1-10. Aunque se han desarrollado métodos para purificar con éxito y producir muchos de estos factores de virulencia importantes para el estudio, algunos productos bacterianas tienen estructuras únicas o extensas modificaciones post-traduccionales que los hacen candidatos recalcitrantes para métodos de purificación y por lo tanto no pueden ser estudiados en forma aislada usando sistemas in vitro . Por ejemplo, estreptococos del grupo A, el patógeno bacteriano responsable de una gran variedad de infecciones que van desde faringitis a la fascitis necrotizante y síndrome de shock tóxico, produce un secretadatoxina bacteriana conocida como estreptolisina S (SLS) ^11-17. Este péptido producido ribosomally es codificada por el grupo de genes de estreptolisina S asociado (sag), y el producto maduro se estima en 2,7 kDa de tamaño ^14-17. La protoxina, codificada por Saga, se modifica después de la traducción por varias enzimas (SAGB, SAGC, y SAGD) para producir la forma madura y funcional ^{15 - 17.} La complejidad de estas modificaciones post-traduccionales, junto con la secuencia de aminoácidos inusual de la toxina han hecho que la toxina incompatible con todos los esfuerzos de elucidación de purificación y la estructura que se han intentado hasta la fecha ^15,17. Estos retos han complicado los esfuerzos para determinar el papel específico de esta toxina en la patogénesis de acogida.

En los casos en que la preparación de toxinas purificadas u otros factores secretados es compleja, ya sea o no sea posible, los mecanismos paradilucidar la función de estos productos tradicionalmente han sido estudiados mediante la preparación de sobrenadantes bacterianos filtrados, que se aplican a continuación a las células huésped ^18-20. Hay varios desafíos asociados con esta técnica. En primer lugar, muchos de estos factores secretados, incluyendo SLS, no mantienen la actividad máxima o consistente cuando se almacena y se aplica a las células huésped en un momento posterior. Además, cuando se recogen los sobrenadantes en un solo punto de tiempo y después se aplican a las células huésped, es difícil determinar la relevancia fisiológica y sacar conclusiones directas sobre el proceso de la infección natural, donde se permite que los factores secretados a acumularse durante el curso de la infección a una concentración fisiológicamente relevante. Este segundo desafío se aplica no sólo a la utilización de sobrenadantes bacterianos, pero también para el uso de toxinas purificadas en estudios de células huésped ^{1 - 3,8.} Para abordar estas cuestiones, una membrana permeable insesistema de infección basados ​​en RT se ha desarrollado para evaluar los efectos de SLS en células huésped de una manera que mantiene la actividad de la toxina óptima y también elimina la variable de contacto directo entre las bacterias y las células huésped. En este sistema, las células epiteliales humanas se cultivan en una monocapa en la cámara inferior de una cámara de dos bien, y las bacterias se introducen en la cámara superior de la misma también. Una membrana porosa (0,4 micras poros) separa las cámaras superior e inferior, lo que permite factores secretados que se intercambian entre las dos cámaras, pero impide el paso de bacterias. Este sistema ha permitido la evaluación eficaz de las respuestas del huésped que se deben a componentes bacterianos secretadas sostenidos exclusivamente al tiempo que elimina cualquier respuesta que pueden ocurrir a través del contacto directo durante la infección estreptocócica del grupo. Aunque otros factores bacterianas secretadas, además de SLS también pueden pasar a través de la membrana porosa, el uso de un panel de mutantes isogénicas incluyendo de tipo salvaje (WT), un SLS-knockout (ΔsagA) y una cepa complementada Saga (Saga ΔsagA +) permite una evaluación precisa de las respuestas del huésped que son estrictamente dependientes ^SLS-21.

Aunque los sistemas de inserción de membrana permeable similares han sido empleados para el estudio de factores secretados implicados en las infecciones virales, la biología del cáncer, y la migración de células inmunes ^22-26, pocos estudios que implican interacciones bacterianas con células huésped han utilizado este enfoque ^6,27,28. Incluso los estudios que han utilizado estos sistemas para explorar las interacciones entre las bacterias y las células huésped se han centrado principalmente en la migración de células inflamatorias o bacterias a través de una monocapa epitelial o endotelial chapada en la pieza de inserción de la membrana permeable. El sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable descrita en este documento es un método sencillo y eficaz que se basa en la separación de las bacterias y las células huésped a través de una membrana porosa para evaluar la efects de la toxina secretada, SLS, en la integridad de la membrana de acogida, la viabilidad celular, la transducción de señal celular, y los factores de la célula huésped secretadas. Esta técnica se puede adaptar para el estudio de otros factores de virulencia secretados en una variedad de tipos de células huésped de mamíferos para investigar el papel de un factor específico de bacterias en el transcurso de una infección.

Protocol

1. bacteriana Cultura

1. Generar cepas mutantes isogénicas que se utilizará para el estudio del factor secretado específica de interés ^21.
   Nota: Los GASM1T1 5448 cepas utilizadas para estos experimentos incluidos WT GAS ', un gato Saga Δ SLS-mutante deficiente (abreviada en el texto como Δ SAGA), y una cepa complementada Saga (abreviado en el texto como Δ + Saga Saga) ^21.
2. Preparar cultivos líquidos durante la noche de cepas bacterianas de interés. Crecer GAS M1T1 5448 cepas en -10 ml de caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C durante 16 a 20 h antes de infectar las células humanas.
3. Centrifugar cultivos de una noche bacterianas (2.400 rcf durante 10 min) y se resuspenden en medio bacteriano fresco.
   Nota: la resuspensión en el mismo volumen que los cultivos de una noche se hicieron crecer en (5-10 ml) en general produce una densidad óptica inicial deseable.
4. Normalizar los cultivos bacterianos aconcentraciones de partida iguales por la dilución de los cultivos se resuspendieron en medio bacteriano adicional hasta que la misma densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ se obtiene para todas las cepas a ensayar (OD ₆₀₀ de aproximadamente 1,0 se recomienda por conveniencia).
   Nota: En estos estudios, se utilizaron cultivos de bacterias de fase estacionaria para infectar células huésped inmediatamente después de la normalización. Sin embargo, ya que algunas cepas de bacterias en fase estacionaria salida nonsynchronously que puede ser más apropiado para iniciar infecciones huésped con cultivos en fase de registro si este se encuentra que es el caso para las cepas de interés.
5. Antes de análisis, realizar un recuento de colonias de ensayo para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro presente en los cultivos de partida de modo que la multiplicidad de infección (MOI), o la relación de bacterias por célula huésped, se puede determinar.
   1. Preparar 1 ml de diluciones seriadas de cultivos bacterianos que se han normalizado a la óptica deseada DENSIty en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o medio de crecimiento bacteriano adecuado (caldo de Todd-Hewitt se utilizó en estos estudios). Preparar diluciones que van desde 10 ^-1 a 10 ^-6 para producir al menos un conjunto de placas de agar con colonias contables (30-300 colonias). Realizar todas las diluciones por triplicado.
   2. Transferir 100 l de cada dilución en serie en una placa de agar que contenía medio apropiado para la especie bacteriana que se está analizando.
      Nota: se utilizó agar Todd-Hewitt en estos estudios.
   3. Use un vaso o esparcidor bacteriana plástico para distribuir uniformemente la alícuota de 100 l en toda la superficie de la placa de agar, y continuar la propagación hasta que el líquido ha sido absorbido en el agar. Llevar a cabo bajo la llama utilizando una técnica estéril.
   4. Se incuban las placas de agar a 37 ° C durante la noche o hasta que las colonias contables aparecen.
   5. Contar las colonias que crecen en cada plato y el cálculo de las UFC / ml en la cultura original por el siguiente formula: número de colonias x inversa del volumen de dilución / cultura en serie chapado en mililitros.
      por ejemplo (200 x 1/10 colonias ^-5 dilución) / 0,1 ml chapados = 2,0 x 10 ⁸ UFC / ml

2. anfitrión de Cultivos Celulares

1. Obtener una línea de célula huésped apropiada para los análisis deseados.
   Nota: HaCaT queratinocitos epiteliales humanos ^29, una especie de regalo de V. Nizet, fueron utilizados para estos estudios.
   1. Mantener las células HaCaT en placas de 100 mm de cultivo en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS). Incubar a 37 ° C con 5% de CO _2.

La infección de la célula anfitrión 3. La permeabilidad de la membrana Sistema Insertar

1. células de la placa en placas de cultivo de tejidos apropiados y les permiten crecer hasta que alcanzan el 90% de confluencia.
   Nota: Las células HaCaT utilizados en estos estudios típicamente alcanzar la confluencia en 2-3 days después de la siembra.
   1. Para la recolección de lisado (por ejemplo, el análisis y ensayos de determinación de trifosfato de adenosina (ATP) de señalización), la placa de células HaCaT en placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 10 ⁵ células / pocillo.
   2. Para los experimentos de formación de imágenes de inmunofluorescencia, las células de la placa en cubreobjetos de vidrio estériles dentro de placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 10 ⁵ células / pocillo.
   3. Para etidio homodímero permeabilización de la membrana y ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), la placa de células HaCaT en placas de 24 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 5 x 10 ⁴ células / pocillo.
2. Inmediatamente antes del tratamiento, lavar las células con 1 x PBS estéril.
3. Aplicar medio de crecimiento fresco a las células. Para las condiciones descritas aquí, aplicar 2 ml de medio por pocillo de placas de 6 pocillos o 0,5 ml de medio por pocillo de placas de 24 pocillos. Si los tratamientos farmacológicos se están probando, mezclar con medio fresco y se aplicará durante este stepag.
   Nota: Algunos ensayos pueden requerir medios de comunicación alternativos. Por ejemplo, como fenol concentraciones séricas de color rojo y de alta interfieren con el ensayo de liberación de LDH, libre de rojo fenol DMEM suplementado con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) (w / v), 2 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM era utilizado para estos experimentos.
4. Después de medio fresco se ha aplicado, se coloca cuidadosamente un inserto de membrana permeable a 0,4 micras estéril en cada pocillo. Realice este paso en una campana de flujo laminar, y el uso de pinzas estériles para transferir la pieza de inserción de la membrana permeable en cada pocillo.
5. Aplicar medio de cultivo celular fresco a la cámara superior de cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las condiciones descritas aquí, aplicar 1 ml de medio por pocillo durante placas de 6 pocillos o 0,1 ml de medio por pocillo durante placas de 24 pocillos.
6. Aplicar un volumen apropiado de cultivos bacterianos normalizados (véase el apartado 1) a la cámara superior del sistema de inserción de membrana permeable. Utilice medio bacteriano para contr no infectadatratamientos ol. Para los resultados aquí descritos, se añaden 25 l de las culturas normalizados por cámara de placas de 24 pocillos y añadir 100 l de las culturas por cámara de placas de 6 pocillos.
   Nota: En estos estudios, se aplicaron de tipo salvaje o mutante GAS a las células huésped a una MOI de 10. MOI se calculó basándose en el número de células eucariota finales (por ejemplo, 2 x 10 ⁶ células / pocillo), de tal manera que 10 veces la cantidad de bacterias fueron añadidos por la célula huésped en el comienzo del período de infección (por ejemplo, 2 x 10 ⁷ CFU por pocillo). MOI apropiada variará con diferentes especies bacterianas y con los análisis de seguimiento deseadas.
   Nota: Además de utilizar medio bacteriano para los controles no infectados, otros controles útiles para ciertas aplicaciones de esta técnica pueden incluir bacterias muertas por calor o medio bacteriano gastado para la comparación.
7. Se incuban las células infectadas a 37 ° C con 5% de CO _2.

Colección 4. Muestra

1. Para recoger el medio de cultivo de células, lisados ​​de células huésped, o cubreobjetos de vidrio con células intactas para el seguimiento de los análisis, empezar por eliminar cuidadosamente el inserto de membrana permeable con pinzas estériles.
2. Para la evaluación de Protiens anfitrión secretadas:
   1. Recoger el medio de la cámara inferior en tubos de 1,5 ml. Evitar perturbar la monocapa durante la recogida.
   2. Centrifugar las muestras a 14.000 rcf durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares.
   3. Retire todos menos 50 l del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente.
3. Para la evaluación de Host Cell lisados:
   1. aspirar suavemente el medio por encima de la monocapa de células huésped. No perturbar la monocapa, ya que esto puede resultar en la pérdida de muestra.
   2. Enjuagar las células una vez con PBS 1x.
   3. aspirar suavemente PBS. Inmediatamente aplicar un volumen apropiado de tampón de lisis enfriado en hielo para conseguir la concentración deseada de proteínas, e incubar lamuestras en hielo durante 15 min. Aplicar entre 200 l y 350 l de tampón de lisis por pocillo de cada placa de 6 pocillos para conseguir concentraciones de proteína entre 0,5 y 1,5 mg / ml.
      Nota: El tampón de lisis usado en estos estudios se compone de agua desionizada, 1% (v / v) Sustituto de Nonidet P40, un cóctel inhibidor de fosfatasa, y un cóctel inhibidor de la proteasa. reactivos específicos se enumeran en la sección de Materiales y Equipos.
   4. Use un raspador celular para desprender las células de la superficie de la placa de cada pocillo y la pipeta todo el contenido de cada pocillo a un tubo de 1,5 ml.
   5. Centrifugar las muestras a 14.000 rcf durante 20 min a 4 ° C.
   6. Para evaluar los componentes solubles de lisado, eliminar el sobrenadante a un tubo nuevo y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente.
   7. Para evaluar los componentes insolubles del lisado nucleares o de otro tipo, reservar el sedimento y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente.
4. Para su evaluación por inmunofluorescencia de imagen:
   1. Comopirata medio y lavar las células en 1x PBS frío.
   2. Fijar las células durante la noche en% de paraformaldehído (PFA) solución de 4 en PBS (w / v).
      Nota: En estos estudios, se añadió 1 ml de PFA por pocillo de cada placa de 6 pocillos.

5. Aplicaciones sugeridas

1. Anfitrión Análisis de Señales de Transducción por SDS-PAGE y transferencia de Western
   1. Recoger lisados ​​de células huésped como se describe en la sección 4.3.
   2. Determinar la concentración de proteínas de cada lisado de la muestra por el ácido bicinconínico de ensayo (BCA) o equivalentes utilizando estándares de proteína ^{de 30.}
   3. Normalizar las concentraciones de proteína entre las muestras antes de cargar y ejecutar las muestras en un gel de poliacrilamida al 4-15% o apropiado alternativa ^31.
      1. Normalizar concentraciones de la muestra con la pipeta la misma cantidad de proteínas de cada muestra (por ejemplo, 20 g) en un nuevo tubo de 1,5 ml y la adición de volúmenes variables de tampón de lisis (volumen de tampón = volumen total - volumen de la muestraañadido) a cada tubo para llevar el volumen total (por ejemplo 50 l) y equivalente concentración final de proteína a través de muestras.
   4. Transferir las muestras a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) (o equivalente). Para los resultados descritos aquí, transferir muestras a 25 voltios durante 2 horas antes de aumentar la tensión a 70 voltios durante 45 minutos adicionales. Utilizar tampón de transferencia compuesto por Tris base 200 mM, 1,5 M de glicina y 20% de metanol (v / v) en agua desionizada.
   5. membranas bloque en 5% de BSA + 0,1% de Tween 20 en solución salina amortiguadora Tris (TBS). Ajustar en consecuencia sobre la base de las recomendaciones del fabricante para el anticuerpo a utilizar.
   6. Se incuban las membranas con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Uso en el fabricante recomienda la dilución.
   7. Lavar las membranas durante 1,5 horas en TBS + 0,1% Tween 20; refrescar amortiguar cada 10-15 minutos.
   8. Incubar con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario a una dilución de 1: 5000 para 1,5 horas a temperat habitaciónUre.
   9. Lavar las membranas durante 1,5 horas en TBS + 0,1% Tween 20; refrescar el tampón cada 10 - 15 min.
   10. Incubar membranas con reactivo de detección de quimioluminiscencia antes de desarrollar en la película de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Otros métodos de detección se pueden usar como se desee.
2. Host Cell La tinción de inmunofluorescencia e Imagen
   1. Fijar cubreobjetos que contienen células huésped como se describe en la sección 4.4.
   2. Retire la solución de PFA y lavar cubreobjetos que contienen células tratadas dos veces en PBS, aspirando entre lavados.
      Nota: PFA es altamente tóxico y debe ser desechado de manera apropiada.
   3. Bloquear los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente en PBS con 1% (w / v) de suero normal de cabra, 2% (v / v) de Triton X-100, y 0,5% (v / v) de Tween 20.
   4. Lavar los cubreobjetos con PBS durante 30 minutos, la actualización de la memoria intermedia cada 10 minutos.
   5. Incubar los cubreobjetos con anticuerpo primario en una proporción 1:50 (o según lo recomendado por el fabricante) en el bloqueo de sollución durante la noche a 4 ° C.
   6. Lavar los cubreobjetos durante 1,5 horas en PBS, refrescante el tampón cada 30 minutos.
   7. Incubar los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente en anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de conejo AlexaFluor488 se utilizó para estos estudios) utilizando una proporción de 1: 200 de anticuerpo para la solución de bloqueo.
   8. Lave cubreobjetos durante 1 hora, la actualización de la memoria intermedia cada 20 minutos.
   9. Aplicar las manchas deseadas.
      Nota: Estos estudios utilizaron DAPI (tinción nuclear) y rodamina-faloidina (actina mancha) en proporciones de 1: 1000 en solución de bloqueo.
   10. Incubar cubreobjetos con manchas nucleares y de actina durante 30 min a temperatura ambiente.
   11. Lavar los cubreobjetos en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, la actualización de la memoria tampón cada 10 minutos.
   12. Montar el cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje.
   13. Permitir a los cubreobjetos para establecer en las diapositivas durante la noche antes de sellar y de imagen. Para los resultados descritos aquí, recoger imágenes en un microscopio de fluorescencia USIng de un objetivo 20X estándar. Utilice el software ImageJ y las imágenes del microscopio para procesar las imágenes capturadas.
3. Ensayo de Muerte Celular homodímero de etidio
   1. Aspirar medio de cada pocillo y se lavan las células dos veces con PBS estéril.
   2. Aplicar 4 M de etidio homodímero-1 en PBS.
   3. Se incuban las células a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
   4. Determinar el nivel de fluorescencia usando un lector de placas ajustado a 528 nm de excitación y 617 nm de emisión con un valor de corte de 590 nm.
   5. Añadir 0,1% (w / v) de saponina a cada pocillo después de la lectura inicial y permitir que la placa de incubar durante 20 min adicionales a temperatura ambiente (con balanceo) antes de leer la placa una segunda vez en la misma configuración.
   6. Determinar el porcentaje de permeabilización de la membrana de forma individual para cada pocillo al dividir la fluorescencia inicial de lectura (post-tratamiento) por la segunda lectura de fluorescencia (post-saponina).
4. Ensayo de determinación de ATP
   1. Recoger lisados ​​como se describe en el apartado 4.3 anterior.
   2. Normalizar los niveles de proteína en los lisados ​​mediante ensayo BCA ³⁰ o similar.
   3. Determinar los niveles celulares de ATP usando un kit de determinación de ATP basados ​​en la luminiscencia o equivalente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   4. Normalizar los valores tratados a las correspondientes muestras de control no infectadas.
5. Ensayo de liberación de LDH
   1. Después de la infección, recoger los sobrenadantes como se describe en la sección 4.3.
   2. Evaluar la liberación de LDH utilizando un kit de detección de citotoxicidad de la liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Results

El protocolo de sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable desarrollado para el estudio de los factores bacterianas secretadas se detalla en la Figura 1. Este sistema se basa en la separación de las bacterias y las células huésped a través de una membrana porosa para evaluar los efectos de los factores bacterianas secretadas, en este caso estreptolisina S (SLS), en las respuestas del huésped tales como la integridad de acogida de la membrana, la viabilidad celular, la transducción de señal celular, y los factores de la célula huésped secretadas. la figura 2 proporciona datos de Western Blot representativos que demuestran que este sistema puede ser usado para evaluar los cambios en la activación de contacto señalización de acogida proteínas -independiente. En concreto, los datos representativos muestran una mayor significativamente la activación de p38 MAPK en la presencia de cepas GAS SLS productoras. Este sistema también se puede aplicar para visualizar los efectos de factores bacterianas secretadas en la localización de proteínas huésped por microscopía de inmunofluorescencia ( Figura 3). Los datos muestran la activación SLS dependientes del mediador inflamatorio clave Nuclear Factor kappa B (NFkB), que se transloca desde el citoplasma al núcleo tras la activación ^21. Los resultados en las Figuras 2 y 3 indican que tanto SLS-dependientes respuestas inflamatorias de señalización no requieren contacto directo entre las bacterias y las células huésped. Como experimentos anteriores han demostrado ya SLS dependiente de p38 y la activación de NFkB en modelos de infección directos ^21, niveles similares de p38 o la activación de NFkB entre las tres cepas de gas en el sistema basado en el inserto de la membrana permeable se han indicado que la respuesta requiere el contacto directo entre la bacterias y células huésped. la Figura 4 demuestra que este sistema de la infección se puede aplicar para evaluar los cambios de toxina dependiente de la citotoxicidad host a través de ensayos de homodímero de etidio y la liberación de LDH. Esto se evidencia por el aumento significativo in tanto permeabilización de la membrana y en la liberación de LDH de las células huésped expuestos a cepas de gas que contienen SLS en comparación con las células no infectadas o las células expuestas a la cepa SLS-deficiente. Estos cambios en la citotoxicidad no son inmediatos, como efectos significativos no son evidentes hasta después de la infección de 12 horas en el caso de permeabilización de la membrana y de 16 horas en el caso de la liberación de LDH. Los datos representativos ilustran la importancia de seleccionar puntos de tiempo apropiados y condiciones de infección para la evaluación de estas respuestas del huésped. Además de lo que permite la evaluación de la señalización de cambios de acogida y la citotoxicidad, el sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable es aplicable al estudio de los cambios metabólicos como la determinación exacta de los niveles de ATP de host mediante la prevención de la contaminación bacteriana de lisados ​​de células huésped (Figura 5) . Estos datos muestran una pérdida significativa de ATP de queratinocitos en respuesta a la infección por GAS 16 horas después de la infección, con la pérdida de ATP mejorada in la presencia de SLS. Estos resultados son consistentes con los aumentos de toxina dependiente observadas en anfitrión de señalización de respuesta al estrés y la citotoxicidad.

Figura 1: Protocolo Infección Sistema basado en Insertar Diagrama de membrana permeable para evaluar los efectos de los factores bacterianas secretadas en células huésped queratinocitos humanos se sembraron en el compartimiento inferior y cultivadas a 90% de confluencia.. Una membrana recubierta de colágeno con 0,4 micras poros separa las cámaras superior e inferior, y las bacterias se añaden a la cámara superior del sistema de inserción de membrana permeable para el período de infección deseado. Sobrenadantes de cultivo de células y células huésped pueden recogerse después del período de la infección y se utilizan para una variedad de análisis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.

Figura 2:. El Sistema de infección basados-Insert membrana permeable puede ser utilizado para Host Cell lisado El análisis por SDS-PAGE y transferencia Western Los datos representativos que demuestran SLS mejora la activación de la vía de p38 MAPK en los queratinocitos infectados. HaCaTs (A) se infectaron con el gas durante 7 horas a través del sistema de inserción infección membrana permeable (a MOI = 10) y los lisados ​​se evaluaron para la activación de p38. (B) La densitometría de tres Blots independiente Western se realizó para cuantificar la activación relativa de p38 en respuesta a GAS'infection. Promedios de tres repeticiones biológica se muestran, con barras de error representan la desviación estándar. la activación relativa de p38 se representa como el nivel de proteína fosforilada / total. La significación estadística se determinó en comparación concélulas no infectadas. El p-valor global se determinó por ANOVA (p = 0,0063). pruebas de Dunnett post hoc se realizaron para comparar cada condición a la que corresponde el control no infectado significar. *, P = 0,01 a 0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 a 0,001; ****, P <0,0001. Esta cifra ha sido modificado a partir de Flaherty et al. 2015 ^21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. El Sistema de infección basada en Insertar membrana permeable permite visualizar de anfitrión de Señalización Cambios por microscopía de inmunofluorescencia Los datos representativos muestran que estreptolisina S mejora de señalización pro-inflamatorias a través de la activación de NFkB. queratinocitos humanos HaCaT fueron infectadas con gas a una M OI de 10 por 8 hr utilizando el sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable. (A y B) la localización nuclear de NFkB se evaluó por formación de imágenes de inmunofluorescencia. El porcentaje de células localizadas nucleares se calculó contando el número de células en las que había NFkB translocados desde el citoplasma al núcleo para un campo determinado y dividiendo ese número por el número total de células para el mismo campo. Las barras de escala indican 100 micras. (A) El promedio de tres repeticiones biológica se representan para cada condición con barras de error representan la desviación estándar. El p-valor global se determinó por ANOVA; p <0,0001. pruebas de Dunnett se realizaron para comparar cada condición a la condición de control no infectado correspondiente. *, P = 0,01 a 0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 a 0,001; ****, P <0,0001. Esta cifra ha sido modificado a partir de Flaherty et al., 2015 ^21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:. El Sistema de infección basada en Insertar membrana permeable permite la determinación de la bacteriana mediada por membrana permeabilización y la citotoxicidad en ausencia de contacto directo entre bacterias y células huésped Los datos representativos demuestran que la viabilidad de queratinocitos disminuye en presencia de la toxina SLS activo . GAS - muerte celular inducida se evaluó en células HaCaT en presencia de WT, GAS SLS-deficientes o Saga complementa queratinocitos se expone al gas usando el sistema basado en la infección de inserción de membrana permeable de 8-16 horas a una MOI de 10. (. A) La viabilidad se evaluó mediante el ensayo de homodímero de etidio o ensayo de liberación B) LDH (. En ambos paneles, 3 recomplica y se promedian las barras de error representan la desviación estándar. Importancia para cada punto de tiempo se determinó por ANOVA (A) 8 hr, p = 0,0241; 12 h, p <0,0001 (B) 8 h, p = 0,0287; 12 h, p = 0,1977; 16 horas, p = 0,0031. pruebas de Dunnett se realizaron para comparar las medias de cada condición para la infección de tipo salvaje para el punto de tiempo correspondiente. *, P = 0,01 a 0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 a 0,001; ****, P <0,0001. Esta cifra ha sido modificado a partir de Flaherty et al. 2015 ^21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El Sistema de infección basada en Insertar membrana permeable Permite la determinación exacta de los niveles de ATP mediante la prevención de anfitrión Bacterial La contaminación de la célula anfitrión lisados. Los datos representativos demostrar la pérdida SLS-dependientes de ATP durante la infección estreptocócica del grupo. Las células HaCaT fueron infectadas con el gas de 8-16 horas usando el sistema basado en la infección de inserción membrana permeable. Técnico repeticiones (n = 3) de una biológica replicar representante (2 x 10 ⁶ células por muestra) se promediaron para cada condición, con barras de error representan la desviación estándar. El p-valores totales se determinaron por ANOVA (12 horas, p <0,0001; 16 horas, p <0,0001). pruebas de Dunnett se realizaron para comparar cada condición con la infección de tipo salvaje para el punto de tiempo correspondiente. *, P = 0,01 a 0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001 a 0,001; ****, P <0,0001. Esta cifra ha sido modificado a partir de Flaherty et al. 2015 ^21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este documento se describe un método que utiliza un sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable a examinar los efectos de la toxina bacteriana estreptolisina S en los queratinocitos epiteliales humanos en un sistema in vitro. Este protocolo puede ser adaptado para el estudio de otros factores de virulencia bacterianas secretadas, así como tipos de células huésped alternativo. Este sistema recientemente desarrollado proporciona varias ventajas sobre los métodos experimentales que utilizan toxinas purificadas o sobrenadantes bacterianos filtrados ^{1 - 3,8,18 - 20.} El sistema basado en inserto de membrana permeable proporciona una dosis constantemente mantenido de la toxina bacteriana correspondiente a las células huésped tal como se produce, lo que permite actividad de la toxina máxima se mantenga y también aumenta la coherencia entre los experimentos. Además, este sistema reproduce mejor las condiciones fisiológicas al permitir que el factor secretado que se acumulan con el tiempo que la infección progresa y por eliminarios la necesidad de seleccionar arbitrariamente concentraciones de toxina específicas que se aplicarán a las células huésped. Por otra parte, este sistema también podría proporcionar los medios para que los investigadores puedan evaluar si un factor bacteriana de interés se entrega a las células huésped de una manera dependiente del contacto. Contacto dependencia a menudo se prueba a través de la generación de mutantes bacterianos isogénicas deficientes en la adherencia o mediante el uso de reactivos que impiden la adherencia. El sistema aquí descrito proporcionaría una alternativa simple para complementar o sustituir estos enfoques tradicionales.

Además de las aplicaciones probadas descritas en el apartado 5 del protocolo, otras aplicaciones a las que este sistema de la infección se podría adaptar fácilmente incluyen la toma de muestras para las matrices de citoquinas y ensayos ELISA. En ambos de estos casos, un protocolo similar al descrito para ensayos de liberación de LDH puede ser seguido. Aunque no se muestra aquí, este sistema se ha utilizado para recoger eficazmente muestras de la célula huésped a ser unanalyzed por citometría de flujo. En esta aplicación, la pieza de inserción de la membrana permeable se retira después del período de infección, las células se lavan para eliminar medio de cultivo celular, y se aplica la tripsina para permitir la recogida de las células para el análisis. La separación física de las bacterias de las células huésped es particularmente útil para esta aplicación, ya que ayuda a evitar la formación de grandes agregados que constan de bacterias adheridas y las células huésped que de otro modo podrían interferir con el recuento de células precisa por el citómetro de flujo.

Aunque se han observado respuestas del huésped muy consistentes al comparar los resultados de los estudios de infección basada en la inserción de membrana permeable con los estudios tradicionales de infección directos, algunas notables diferencias en la cinética de estas respuestas del huésped se han observado ^21. Por ejemplo, los cambios en la señalización de host y de la membrana a base de citotoxicidad toman 30 a 50% más de tiempo que se producen en el modelo de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable que correspondiendo modelos de infección directos. Debido a que el sistema basado en el inserto de membrana permeable requiere medio para ser aplicado a los compartimentos superior e inferior de cada pocillo, el sistema desarrollado para los estudios descritos aquí requiere un incremento del 30% en el volumen total del medio de por pocillo en comparación con los correspondientes modelos de infección directa utilizada previamente ^21. Esta diferencia en el volumen total de medio, junto con el aumento de la distancia entre las bacterias y las células huésped cuando se prohíba el contacto directo, probablemente aumenta el tiempo que toma para que SLS se difunda a través del medio para llegar a las células huésped y susciten los efectos observados. Además, el sistema basado en el inserto de membrana permeable elimina muchos factores de virulencia GAS que puedan contribuir a la sede de daño de las células; la ausencia de estos factores adicionales en este sistema también es probable que contribuya a la demora en la muerte de la célula huésped y la iniciación de los eventos de señalización de acogida en comparación con la infección directa ^21. Estos factores deben ser consideradosen el diseño de experimentos para evaluar otros componentes bacterianas secretadas.

Para identificar las condiciones más significativas para probar los efectos de los factores bacterianas secretadas en células huésped, probando una gama de puntos de tiempo para cada aplicación del sistema de la infección a base de inserto de membrana permeable se recomienda. Es importante tener en cuenta en qué condiciones el factor de virulencia específico de interés se produce de manera óptima (por ejemplo, la fase de registro, la fase estacionaria, en respuesta a ciertas señales del medio ambiente, etc.) con el fin de observar con éxito sus efectos. En los experimentos se centraron en la evaluación de los cambios en las proteínas de señalización de acogida, fue necesario seleccionar los puntos de tiempo que permitió un tiempo adecuado para SLS para llegar a las células huésped y que se produce en cantidades suficientes para inducir modificaciones de la señalización ^21. Al mismo tiempo, la evaluación de los cambios en la señalización necesaria anfitrión se lleve a cabo antes de la permeabilización de la membrana inducida por SLS, ya que este efecto complicates la colección de lisados ​​de células huésped para su análisis. La muerte celular inducida por el SLS se pudo observar de manera óptima en los dos modelos de infección basada en la inserción de membrana permeable directa y varias horas después de la iniciación de los eventos de señalización reportados ^21. Además, en la selección de los puntos de tiempo de interés, también es importante asegurarse de que las bacterias que se están estudiando son incapaces de penetrar la membrana inserto poroso durante el período de estudio. La producción de ciertos componentes bacterianos durante un período prolongado puede perturbar la integridad de la membrana y permitir el paso de las bacterias a el compartimiento inferior. Para determinar si este es un problema potencial en el sistema de interés, las cepas bacterianas que han de estudiarse se pueden aplicar a la cámara superior del sistema basado en el inserto de la membrana permeable a una gama de puntos de tiempo. En cada punto de tiempo, el inserto se puede quitar con cuidado y el medio de la cámara inferior puede ser recogida y utilizada en un co colonia estándarunting ensayo (ver sección 1.5). Si no hay colonias se forman a partir del medio de cultivo de células en el compartimiento inferior, la membrana de inserción puede suponerse que está previniendo con eficacia el paso de bacterias en el punto de tiempo y la carga bacteriana probado.

Otro componente de diseño experimental de que es probable que requiera optimización para el análisis eficaz de factores bacterianos secretadas es la multiplicidad de infección (MOI). La MOI se refiere a la proporción de células bacterianas por la célula huésped, y por lo tanto se ve influenciada por la confluencia de la célula huésped en el momento de la infección y por el número de unidades formadoras de colonias bacterianas (CFU) aplicada a las células. En estos estudios, las células de queratinocitos se hicieron crecer hasta 90% de confluencia, lo que permite que estas células para formar una monocapa cohesiva con uniones estrechas intactas. Una consideración cuidadosa de la organización fisiológica de las células huésped a ser estudiado es necesario seleccionar una confluencia apropiado para experimentos de infección. Una vez que un correspondIATE número de células huésped por pocillo se determina, un CFU bacteriano adecuado puede ser estimado a partir de la MOI deseada. En los estudios descritos aquí, se aplica gas a las células huésped a una MOI de 10. MOI apropiada variará con diferentes bacterias y con los análisis de seguimiento deseadas. Un bajo principio MOI es típicamente más fisiológicamente relevante y permite el factor bacteriana de interés para acumular suficiente lentamente para captar los cambios sutiles en la señalización de la célula huésped antes de los cambios dramáticos en la viabilidad de la célula huésped son evidentes. MOI más altas se utilizan en muchos estudios de evaluación de la citotoxicidad, pero este efecto también se puede lograr comenzando con una baja MOI y permitiendo que la infección progrese durante un período de tiempo más largo. Es importante determinar un CFU precisión de corolario densidad óptica para todas las cepas bacterianas a ensayar, como mutantes isogénicas pueden tener una tasa de crecimiento alterada en comparación con bacterias de tipo salvaje y por lo tanto puede requerir que se añada un CFU superior o inferior por pocillo agarantizar una comparación adecuada de la respuesta del huésped entre las cepas. En los casos en que las células huésped de mamífero que se están estudiando son capaces de matar bacterias o inhibir su crecimiento o si se sospecha de crecimiento no sincrónico entre las cepas bacterianas, que también puede ser útil para llevar a cabo estudios para evaluar la carga bacteriana final al final del período de infección. Esto se podría lograr mediante la recopilación de los contenidos de la pieza de inserción permeable y realizar un ensayo de recuento de colonias similar a la descrita en la sección 1.5 del procedimiento.

Selección de pozos de tamaño apropiado para el ensayo deseado también es importante para obtener resultados óptimos. insertos de membrana permeable están disponibles en una variedad de tamaños, pero se observaron los resultados más consistentes para los estudios que se muestran aquí usando insertos diseñados para 24 bien y 6 placas de cultivo de tejidos. Estos tamaños de inserción son relativamente fáciles de manejar con pinzas estériles, y la facilidad de manipulación es fundamental para Preveniring transferencia no deseada de las bacterias desde el compartimiento superior hasta el compartimiento inferior del pozo. Para los experimentos que implican la recogida de lisados ​​de células huésped, 6 platos así proporcionan un número de células apropiado por condición para la mayoría de los análisis y son lo suficientemente grandes para acomodar raspadores de células para la recogida de muestras. Para los ensayos de citotoxicidad en la que las células huésped permanecen adherentes y se marcan con un colorante fluorescente o colorimétrico que puede ser medido en un lector de placas (por ejemplo de etidio ensayo homodímero, el ensayo de exclusión de azul de tripano), el uso de una placa de 24 pocillos con los insertos correspondientes es recomendado. Para los experimentos en el que se recogió el medio de cultivo de células y analizadas (por ejemplo, la liberación de LDH, estudios de citoquinas) o bien el 24 bien o placas de 6 pocillos se pueden utilizar, aunque los pozos más pequeños proporcionan típicamente volúmenes de muestra adecuados para estos análisis y minimizar el uso de la requerida reactivos. En general, el método es muy versátil y se puede adaptar según sea necesario para preparar samplES para numerosas aplicaciones de seguimiento.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caldo Todd-Hewitt	Acumedia	7161A	Utilice un caldo adecuado para las especies bacterianas de interés.
BioSpectrometer	Modelo básico	Eppendorf	Cualquier espectrofotómetro UV-Vis es adecuado.
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713	Otras marcas son adecuadas.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Otras marcas son adecuadas.
		epiteliales humanos HaCaT	Regalo del laboratorio de Victor Nizet.
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Utilice el medio apropiado para la línea celular de interés.
Suero fetal bovino (FBS)	Biowest	S162H	Utilice aditivos de medios apropiados para la línea celular de interés.
Placas de cultivo de tejidos de 10 cm	Nunc	150350	Otras marcas son adecuadas.
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	CytoOne	cc7682-7506	Otras marcas son adecuadas, pero deben ser compatibles con el inserto Corning.
24 placas de cultivo de tejidos de pocillos	CytoOne	cc7682-7524	Otras marcas son adecuadas, pero deben ser compatibles con el inserto Corning.
Cubreobjetos de vidrio	Fisherbrand	12-541-B	Estos deben esterilizarse en autoclave antes de su uso para el recubrimiento de celdas.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	medios libres de rojo de fenol solo se requieren para el ensayo de liberación de LDH.
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamina	Gibco	25030149	Solo se requiere complementar los medios de cultivo celular para el ensayo de liberación de LDH.
Piruvato de sodio	Gibco	BP356100	Solo se requiere para complementar los medios de cultivo celular para el ensayo de liberación de LDH.
Recubierto de colágeno 0,4 μ m Insertos Transwell (6 pocillos)	Corning	3540
Recubierto de colágeno 0,4 μ m Insertos Transwell (24 pocillos)	Pinzas Corning	3595
Fisher	3120018		Estos deben esterilizarse con etanol antes de manipular los insertos Transwell.
Raspadores de células	Fisherbrand	08-100-241	Estos solo son necesarios para la recolección de lisados de células.
Paraformaldehído	Fisher Scientific	04042-500	TÓXICO. Esto solo es necesario para las imágenes de inmunofluorescencia.
Kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA)	Pierce	23227	pueden utilizar otros ensayos de cuantificación de proteínas.
Los geles de tris-glicina 4 - 15% de poliacrilamida	BioRad	4561083	sistema tampón y el porcentaje de poliacrilamida deben seleccionarse en función de las proteínas de interés.
El casete de electroforesis suministra	BioRad	1658063	Solo se requiere para Western Blotting.
Fuente de alimentación de electroforesis	BioRad	1645050	Solo se requiere para Western Blotting.
Casete de transferencia Western blot	BioRad		Solo se requiere para Western Blotting.
Membrana de polivinilideno (PVDF)	EMD Millipore IPVH00010		Solo se requiere para Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
Conejo IgG-HRP anticuerpo secundario	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	El anticuerpo secundario debe determinarse en función del método de detección seleccionado.
Anticuerpo secundario IgG-HRP de ratón	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	El anticuerpo secundario debe determinarse en función del método de detección seleccionado.
Phospho-p38 (T180 + T182) Anticuerpo MAPK	Señalización Celular	4511	Seleccione los anticuerpos primarios apropiados en función de las proteínas de interés.
Anticuerpo p38 MAPK total	Señalización celular	8690	Seleccione los anticuerpos primarios apropiados en función de las proteínas de interés.
IgG anti-conejo de cabra Alexafluor 488	Sondas moleculares	A-11034	Se pueden utilizar otros anticuerpos secundarios para la detección por imágenes de inmunofluorescencia.
Reactivo de detección LumiGLO	KPL	54-61-00	Solo se requiere para Western Blotting con detección en película.
Película de detección	Biodot	BDB57	Solo se requiere para Western Blotting con detección en película.
Microscopio de fluorescencia DeltaVision Nikon 90i	Nikon		Otros microscopios de fluorescencia son adecuados para estos análisis.
Suero de cabra normal	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI Tinción nuclear	Señalización celular	4083	Seleccione las tinciones en función de las aplicaciones específicas de inmunofluorescencia de interés.
Tinción de rodamina-faloidina actina	Sondas moleculares	R415	Seleccione las tinciones en función de las aplicaciones específicas de inmunofluorescencia de interés.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Solo se requiere para imágenes de inmunofluorescencia.
Homodímero de etidio 1	Sondas moleculares	E1169	Solo se requiere para el ensayo de citotoxicidad de permeabilización de membrana.
Lector de microplacas Spectramax M5	Dispositivos moleculares		Otros lectores de microplacas capaces de detectar UV-vis, fluorescencia y luminiscencia pueden ser adecuados.
Saponina	Sigma	47036-50G-F	Solo se requiere para el ensayo de citotoxicidad de permeabilización de membrana.
Sondas moleculares Kit de determinación de ATP Life Technologies		A22066	Es probable que otros kits sean adecuados.
Kit de detección de citotoxicidad para la liberación de LDH	Roche	11644793001	Es probable que otros kits sean adecuados.
Nonidet P40 Sustituto	Sigma	74385-1L	Otros proveedores son adecuados.
Cóctel inhibidor de fosfatasa HALT	Thermo Scientific	78420B	Es probable que otros cócteles sean adecuados.
SIGMAFAST Inhibidor de la Proteasa Cocktail Tablets, sin EDTA	Sigma	S8830-2TAB	Es probable que otros cócteles sean adecuados.