Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Summary

Hierin beschreiben wir eine empfindliche immunchemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten, die auf der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und Tyramid-Signalamplifikation basiert.

Abstract

Die Methylierung von Cytosinbasen (5-Methylcytosin, 5mC), die in Wirbeltiergenomen auftritt, ist normalerweise mit transkriptionellem Silencing verbunden. 5-Hydroxylmethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) sind die kürzlich entdeckten modifizierten Cytosinbasen, die durch enzymatische Oxidation von 5mC hergestellt werden und deren biologische Funktionen relativ unklar bleiben. Eine Reihe von Ansätzen, die von biochemischen bis hin zu antikörperbasierten Techniken reichen, wurden eingesetzt, um die genomische Verteilung und den globalen Gehalt dieser Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen. Obwohl einige dieser Ansätze für die quantitative Bewertung dieser modifizierten Formen von 5mC nützlich sein können, liefern die meisten dieser Methoden keine räumlichen Informationen über die Verteilung dieser DNA-Modifikationen in verschiedenen Zelltypen, die für ein korrektes Verständnis ihrer funktionellen Rollen erforderlich sind. Hier stellen wir eine hochempfindliche Methode zum immunchemischen Nachweis der modifizierten Formen von Cytosin vor. Diese Methode ermöglicht die gemeinsame Detektion dieser epigenetischen Markierungen mit Markern der Proteinlinie und kann zur Untersuchung ihrer nukleären Lokalisation eingesetzt werden, wodurch sie zur Entschlüsselung ihrer potenziellen biologischen Rollen in verschiedenen experimentellen Kontexten beiträgt.

Introduction

Die Methylierung von Cytosin - Basen in der DNA (5mC) stellt einen großen in Wirbeltiere Genome gefunden epigenetische Markierung im Zusammenhang mit Transkriptions ¹ zum Schweigen zu bringen. 5mC wird von DNA - Methyltransferasen ^2-5 eingeführt und gehalten, und wurde in einer Reihe von biologischen Prozessen einschließlich genomische Imprinting, X-Chromosom Inaktivierung zellulärer Differenzierung und Entwicklung ^{3, 6.} Folglich wichtige Rollen spielen gezeigt, die Störung der 5mC genomische Muster mit einer Reihe von Krankheiten assoziiert ^{7, 8-11.} Trotz der Fortschritte im Verständnis 5mC Rolle bei der Entwicklung und Krankheit, ist es immer noch weitgehend unbekannt bleiben, wie diese Marke bei der Entwicklung und adulten Geweben entfernt wird. Mehrere mögliche Mechanismen der DNA - Demethylierung aktiven und passiven Demethylierung Mechanismen vor kurzem vorgeschlagen wurden , ^{12, 13, 14, 15.} Entdeckung der Produkte von 5mC sequenzielle Oxidation vermittelt durch 10 bis 11 Translokation enzymES (TET1 / 2/3), wie 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) und 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotischen DNA ^{16, 17, 18, ​​19} veranlasst Spekulationen , ob sie als Zwischenprodukte dienen können , DNA - Demethylierung Prozesse oder als stabile epigenetische Markierungen in ihrem eigenen Recht ^13. Während der Demonstration , dass die Komponente der Reparatur Basis Exzision, Thymin-DNA - Glycosylase (TDG) binden können und beide 5FC und 5caC von DNA ¹⁹ zu ^entfernen, schlägt vor , ²⁰ eine Rolle für die modifizierten 5mC Derivate in einer aktiven DNA - Demethylierung. Neuere Erkenntnisse zeigen , dass 5FC / 5caC die Rate der RNA II processivity Punkte auf mögliche Beteiligung dieser Marken in der Transkriptionsregulation ²⁹ modulieren können. Aufgrund dieses potentielle biologische Bedeutung von oxidierten Formen von 5mC, eine Reihe von biochemischen und Antikörper - basierte Techniken zur Untersuchung ihrer genomischen Verteilung und globale Inhalte wurden ^{19-24 16,} eingesetzt.

Da die meisten ter wirbel Organen verschiedener Zelltypen bestehen und daß die Verteilung der modifizierten Cytosin - Basen Gewebe- und Zelltyp - spezifische ^{16-18, 20, 23, 25-27,} in verschiedenen Geweben , die räumliche Verteilung von oxidiertem 5mC Derivate Bestimmung wird zu einem wichtigen experimentellen Aufgabe erforderlich für ihre biologischen Funktionen enthüllt. Die meisten der biochemischen und Antikörper-basierte Ansätze bieten keine räumlichen Informationen bezüglich der Verteilung der modifizierten Formen von 5mC in verschiedenen Geweben und Zelltypen. Im Gegensatz dazu Immunochemie basierte Techniken kann die räumliche Verteilung und Kernlokalisation von 5mC ²⁸ und dessen oxidierter Derivate ²⁰ ein schnelles Werkzeug für die Beurteilung. Das heißt, der berichtete sehr geringe Häufigkeit von 5FC (20 in jedem 10 ⁶ Cytosin) und 5caC (3 in je 10 ⁶ Cytosin) in das Mausgenom ¹⁸ eine große Herausforderung für Standard Immunochemie darstellt.

Hier,Wir beschreiben eine hochempfindliche immunochemischen Methode, die von oxidierten Form von Cytosin in Säugetierhirngewebe robust und eine schnelle Erkennung bietet. Durch die Integration von Peroxidase-konjugierten sekundären mit einem Signalverstärkungsschritt gekoppelten Antikörpern, umgeht diese Methode für die Herausforderungen der sehr geringe Mengen an 5FC und 5caC zu erkennen. zusammen detektieren die modifizierten Formen von Cytosin mit linienspezifischen Markern, effektiv ergänzt andere Ansätze bei der Aufklärung der biologischen Funktion dieser epigenetische Markierungen Zusätzlich kann diese Technik verwendet werden.

Protocol

Alle Tier verbundenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der University of Nottingham ethischen Review Board durchgeführt.

1. Auswahl geeigneter Gewebepräparation für Immunostaining

1. Generieren Sie in Paraffin eingebetteten Abschnitt von Wildtyp - CD1 Maus - Embryonen und erwachsenen Gehirn Gewebe wie zuvor ²⁵ beschrieben. Verwenden Sie Abschnitte Hirngewebe fixiert mit entweder 4% Formaldehyd (FA) oder 4% Paraformaldehyd (PFA) für ²⁵ Verfahren immunostaining.
   HINWEIS: Die Verwendung von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten erfordert Entparaffinierung vor der Antikörpermarkierung. Da die Behandlung mit 2 bis 4 M Salzsäure (HCl) in das Protokoll für die DNA-Denaturierung eingesetzt ist nicht kompatibel mit den meisten Antigen-Retrieval-Strategien, empfehlen wir die Verwendung von entweder Kryo- oder Mikrotomschnitten für die Co-Detektion von 5mC Oxidationsderivate mit Protein Marker.

2. Entwachsen Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten < / P>

1. In einer laufenden Klasse II Sicherheitsschrank, waschen Sie die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten in einem Glas Coplin mit Xylol gefüllt, 2-mal für jeweils 10 Minuten bei RT.
   HINWEIS: Es ist wichtig , frisches Xylol zu verwenden , da unvollständige Paraffin Entfernung zu inkonsistenten Färbemustern führen kann.
2. Nach Entparaffinierung, Rehydrierung schnell die Gewebeschnitte durch Waschen nacheinander in 95, 75 und 50% Ethanol für jeweils 10 min bei RT.

3. Fixierung und Permeabilisierung von Kryo- und Mikrotomschnitten

1. Befestigen Sie die rehydratisierten Gewebeschnitte von ihnen in entweder eiskalt 4% PFA oder 4% FA für 15 min bei RT platzieren.
2. (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) für 5 min bei RT Entfernung von überschüssigem Fixativ indem die Sektionen in PBS gewaschen.
3. Permeabilisierung die Gewebeschnitte von in einer Glasküvette mit PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) bei RT für 30 min gefüllt platzieren. Überschüssiges PBX durch die Abschnitte kurz in PBT Waschen (0,01% Tween 20 in PBS).

jove_title "> 4. Immunostaining für Oxi-5mC Derivate

1. Platzieren Sie die permeabilisierten Schnitte in 2 N HCl für 60 min bei RT Depurinierung der DNA.
   Hinweis: Obwohl höhere Konzentrationen von HCl (beispielsweise 4 N) führen zu einer effizienteren DNA denaturierenden, sie sind nicht kompatibel für die Co-Detektion von oxi-mCs mit DAPI.
2. Platzieren Sie die Abschnitte in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) für 30 min bei RT, um das HCl zu neutralisieren. Alternativ waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 Minuten jeweils in PBS. Inkubieren der Abschnitte in PBT für 5 min bei RT.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit aus dem Bereich der Gewebeschnitt umgibt, ohne den Gewebeschnitt zu lassen Sie die Folie vollständig in jedem Schritt zum Trocknen durch leichtes Schütteln. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift, um den Abschnitt zu umgeben, ohne den Abschnitt zu berühren.
   HINWEIS: Die hydrophobe Barriere Stift das Volumen der Antikörper reduziert erforderlich , um das Gewebe zu färben und mehrere Abschnitte werden gefärbt mit differen zulassent-Antikörper auf derselben Folie.
4. Inkubieren Abschnitte in 100 & mgr; l-Lösung (10% Rinderserumalbumin in PBS) für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert.
   HINWEIS: die Effizienz der Färbung der modifizierten Cytosin - Basen beeinflussen würde diesen Schritt überspringen.
5. Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 5.000-Verdünnung von monoklonalem Maus-anti-5hmC und einer 1: 1.000-Verdünnung von polyklonalem Kaninchen-anti-5caC primäre Antikörper in Lösung für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. Alternativ führen die Inkubation über Nacht bei 4 ° C, wenn nötig.
   HINWEIS: Abschnitte ohne primären Antikörper verarbeitet als geeignete Negativkontrollen für das Färbeverfahren dienen. 12,5 Tage post coitum murinen embryonalen Hirnschnitten angereichert in 5caC, 5FC und 5hmC ²⁰ kann als positive Kontrolle verwendet werden.
6. Entfernen Sie überschüssige Antikörper durch die Abschnitte in einer Glasküvette mit PBT dreimal für jeweils 5 min in einem Cop gefüllt Waschenlin Glas bei RT.
   HINWEIS: das Volumen der Waschlösungen Erhöhung kann die Hintergrundfärbung zu reduzieren.
7. Überschüssiges PBT und, falls erforderlich, umkreisen die Abschnitte wieder mit dem hydrophoben Barriere Stift als PBT Reinigungsmittel enthalten, die die hydrophobe Barriere schwächen können.
8. Machen Sie eine 1: 400-Verdünnung von Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierte Antikörper und eine 1: 400-Verdünnung von Esel-anti-Maus-555-konjugierte Antikörper in Lösung zu blockieren.
9. Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 & mgr; l sekundärem Antikörper Mischung aus Schritt 4.9 für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer.
10. Waschen Sie die Gewebeschnitte in eine Coplin-Gefäß gefüllt mit PBT dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT.
11. Platzieren Sie die Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 200 Verdünnung von Tyramid in dem Tyramid Signalverstärkungspuffer für 2 min bei RT.
12. Sofort entfernen überschüssige Tyramidesters Lösung durch die Dias dreimal für jeweils 5 Minuten in PBT Waschen.
13. vorsichty entfernen überschüssiges PBT und sofort , die Abschnitte mit einem Tropfen einer Mounting Medium (siehe Materialliste).
14. Sanft legen Sie ein Deckglas auf den Gewebeschnitten und sofort das Deckglas mit Nagellack versiegeln.
15. Speichern der Gewebeschnitte bei 4 ° C für mehrere Stunden vor der mikroskopischen Untersuchung. Untersuchen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 405, 488 und / oder 555 nm (10 - 40-facher Vergrößerung).

Results

Um die Verteilung der 5hmC in Hirngewebeschnitten bestimmen, führten wir co-Detektion dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für die post-mitotischen Neuronen, NeuN, kommerziellen anti-5hmC Antikörper verwendet wird, der spezifisch mit dieser Markierung in Wechselwirkung tritt, aber nicht mit anderen Formen von modifiziertem Cytosin ^{20, 25.} Immunhistochemische Analyse von 5hmC und 5caC Verteilungen im erwachsenen Gehirn zeigten , dass während der prominente 5hmC Färbung co-lokalisiert mit NeuN - positiven Zellen, NeuN-negativen Gliazellen besitzen geringere Mengen genomischer 5hmC (Abbildung 1) ^20.

Wir haben kürzlich gezeigt , dass Tet-abhängige 5mC Oxidation während der Abstammungslinie Spezifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) ²⁰ in Betrieb ist. Trotz in NSCs immunochemisch nicht nachweisbar ist, zeigen 5FC und 5caC prominente Immunfärbung in frühen Stadien der NSCs Differenzierung zu neuronalen ein nd Glia-Abstammungslinien. Diese beiden Marken transient akkumulieren gleichzeitig mit dem Erscheinen der Marker der frühen neuronalen und glialen Differenzierung ^20. Zur Bestimmung der Verteilung von 5caC bei der Differenzierung von NSCs wir Co-Färbung dieser Marke mit einem Glia Marker GFAP auf den festen Kulturen von NSCs an 3 Tagen nach der Induktion von Glia-Differenzierung durchgeführt. Anders als in NSC oder reifen Astrozyten (Daten nicht gezeigt), beobachteten wir starke 5caC Signal in relativ großen Anteil der Zellen, die GFAP in diesen Kulturen (Figur 2) ^20.

Abbildung 1. Co-Immunfärbung von 5hmC (grün) mit NeuN (rot) im Gewebe erwachsenen Gehirn counterstained mit DAPI (blau). Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 25 & mgr; m.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Co-Immunfärbung von 5caC mit GFAP in der Kultur von NSC an Tag 3 von Gliazellen Differenzierung. Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Obwohl der gemeldete geringe Häufigkeit von 5mC Oxidationsderivate, 5FC und 5caC in einigen Geweben erhebliche Einschränkungen für ein Standard - Immunochemie Protokoll darstellen würde der Einbau von Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper erlaubt den Nachweis dieser Cytosin Modifikationen in festen Geweben und Zellen (Figur 2) . Jedoch sollte die optimale Inkubationszeit mit dem Tyramid Lösung optimiert werden experimentell für jede einzelne Charge von Tyramid Signalverstärkungs Kit , wo eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und die Dauer der Tyramid basierten Signalverstärkung beobachtet wird, für Details siehe Almeida et al. 2012 ²⁶ . Zusätzlich kann das Signal / Hintergrund-Verhältnis signifikant durch die Durchführung der Waschungen in einem Coplin jar verbessert werden effiziente Entfernung von überschüssigem Antikörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation mit Tyramidesters Lösung ist es wichtig, die Reaktion durch Waschen in PBT-Lösung d sofort zu beendenecrease Hintergrundfärbung. Es ist wichtig, nicht die Abschnitte zu erlauben, an jedem beliebigen Punkt während des Verfahrens, um zu trocknen.

Die Effizienz der DNA Depurinierung kann durch Ausführen der Depurinierung Reaktion bei 37 ° C verbessert werden. Bei der Verwendung von 4 N HCl anstelle von 2 N verstärkt die Färbung der modifizierten Formen von 5mC unter Verwendung von 4 N HCl für DNA Depurinierung würde mit DAPI nicht zulassen Co-Färbung, wie sie ausschließlich mit doppelsträngiger DNA interagiert.

Obwohl diese Technik robust semi-quantitative Beurteilung der modifizierten Formen von Cytosin-Basen in dem detektierbaren bereitstellen kann, kann sie nicht für die Bewertung der absoluten Niveaus der 5mC oder dessen Oxidationsderivaten verwendet werden. Daher empfehlen wir die Verwendung von anderen ergänzenden , aber quantitative Ansätze ^{16, 19 -24.} Seit der Entdeckung von 5mC Oxidationsderivate in Säugergenomen wurden mehrere Ansätze entwickelt worden , deren biologische Rollen zu studieren ^{16, 19-24.} Obwohl diese approaCHES kann bei der Bestimmung der absoluten Mengen an 5mC Oxidationsderivate wertvoll sein, bieten sie keine Informationen über ihre räumliche Verteilung ^{20, 26.} Wir haben erfolgreich die hier beschriebenen Verfahren verwendet , um die räumliche Verteilung und Lokalisierung von 5mC Oxidationsderivate in verschiedenen Zelltypen zu kartieren der entwickelnden und adulten Gehirn ²⁰

Durch die Offenbarung ihrer räumlichen Verteilung ²⁰ kann diese Technik entscheidend sein , um die biologischen Implikationen für das Verständnis und das Schicksal von oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen biologischen Kontexten , in denen diese modifizierten Derivaten von 5mC können einschließlich zelluläre Differenzierung, Entwicklung und Krankheit nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann die Methode, die wir hier beschreiben, geben semi-quantitative Abschätzungen der oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen Geweben durch die Kinetik der Peroxidase-Reaktion Beurteilung (die der Färbungsintensität proportional ist) bei unterschiedlichen Inkubationszeiten mit tyramide ^26.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coplin Glas	Cole-Parmer	UY-48585-30	Glas hergestellt
Xylol			Nur in Sicherheitswerkbank der Klasse II verwenden
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	12821680	pH 7,5, vor Gebrauch gefiltert
4% Paraformaldehyd (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Nach der Herstellung kann bei -20 & deg gelagert werden; C in Aliquoten für mehrere Monate
4% Formaldehyd  (FA) Herr Präsident!	Sigma Aldrich	F8775	Einmal hergestellt kann bei -20 & Grad gelagert werden; C in Aliquoten für mehrere Monate
Ethanol, wasserfrei denaturiert, histologische Qualität	Sigma Aldrich	64-17-5	95, 75, 50% in PBS
0,01% Tween 20 in PBS	Sigma Aldrich	P9416	PBT
0,5% Triton X-100 in PBS	Sigma Aldrich	X100	PBX
2 N HCl	Sigma Aldrich	71826	Vorsicht extrem giftig
100 mM Tris-HCl	Promega	H5121	pH-Wert angepasst an 8,5
hydrophobe Barriere Stift	Abcam	ab2601	für Immunhistochemie
Objektträger Feuchtigkeitskammer	Scientific Device Laboratory	197-BL
Anti-5mC-Maus-Antikörper	Diagenode	C15200081	monoklonaler primärer Antikörper
Anti-5hmC-Antikörper	Aktiver Motif	39791	Kaninchen polyklonal Primärantikörper
Anti-5caC-Antikörper	Aktives Motiv	61225	polyklonaler Kaninchen-Primärantikörper
Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper	Dako	K1497
555-kongjuierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper	Molekulare Sonden	A-11005	Sekundärantikörper
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	Blockierungslösung
22 x 32 mm Deckgläser	BDH	406/0188/24
Tyramide Signal Amplification System	Perkin Elmer	NEL741001KT	Andere Fluorochom-konjugierte Sekundärantikörper können für den Co-Nachweis von Oxi-5mC
Eindeckmedium mit DAPI	Vector Labs	H-1200
Farbloser Nagellack
Huhn polyklonaler Anti-GFAP-Antikörper	Thermo Scientific	PA5-18598	:400 Verdünnung
anti-NeuN Maus monoklonaler Antikörper	Merck Milipore	MAB377B	1:400 Verdünnung