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Methodenartikel

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

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DOI:

10.3791/54421

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18. September 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Antigen-getriebenen Colitis-Modell wurden OT-II CD4+ T-Zellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren, adoptiv in RAG-/- Mäuse übertragen, die ein grün fluoreszierendes Protein in mononukleären Phagozyten (MPs) exprimieren. Die Wirte wurden mit Escherichia coli (E.coli) konfrontiert, die das Ovalbuminprotein (OVA) exprimierten, das mit einem cyanfluoreszierenden Protein (CFP) fusioniert war.

Zusammenfassung

Entzündliche Darmerkrankung (CED) ist eine chronische Entzündung, die den Magen-Darm-Trakt (GIT) betrifft. Eine der besten Möglichkeiten, die immunologischen Mechanismen während der Krankheit zu untersuchen, ist das T-Zell-Transfermodell der Kolitis. In diesem Modell werden immundefiziente Mäuse (RAG-/-Empfänger) mit naiven CD4+ T-Zellen aus gesunden Wildtyp-Wirten rekonstituiert.

Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der frühesten immunologischen Ereignisse, die zu Krankheiten und chronischen Entzündungen führen, wenn die Darmentzündung fortbesteht, aber nicht von einem definierten Antigen abhängt. Um die potenzielle Rolle von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) im Krankheitsprozess zu untersuchen, ist es hilfreich, ein antigengetriebenes Krankheitsmodell zu haben, in dem ein definiertes kommensales abgeleitetes Antigen zu Kolitis führt. Daher wurde ein Antigen-getriebenes Kolitis-Modell entwickelt. In diesem Modell werden OT-II CD4+ T-Zellen, die nur spezifische Epitope im OVA-Protein erkennen können, in RAG-/- Wirte transferiert, die mit CFP-OVA-exprimierenden E. coli belastet sind. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen APCs und T-Zellen in der Lamina propria.

Einleitung

Der Darm ist die größte Oberfläche des Körpers, die der äußeren Umgebung ausgesetzt ist. Große Arrays von resident Mikroben besiedeln den menschlichen Darm die intestinale Mikrobiota (oder Mikroflora) zu bilden. Dies wird geschätzt , von bis zu 100 Billionen mikrobiellen Zellen zu bestehen und ist eine der am dichtesten besiedelten bakterielle Lebensräume bekannt in der Biologie 1-3. Im GIT Bakterien besiedeln eine Darm-Nische , wo sie überleben und 4 multiplizieren. Im Gegenzug stiftet die Mikrobiota den Host mit zusätzlichen funktionellen Eigenschaften , die nicht auf ihrem Genom codiert 1. Zum Beispiel regt die Mikrobiota die Proliferation von Epithelzellen produziert Vitamine , die Gastgeber selbst nicht produzieren kann, reguliert den Stoffwechsel und schützt vor Krankheitserregern 4-6. Diese vorteilhafte Beziehung gegeben, haben einige Autoren vorgeschlagen , dass Menschen "Super-Organismen" oder "holobionts" sind , die eine Mischung aus Bakterien und menschlichen Genen 7,8 sind. In Anbetracht der positiven Auswirkungen der Mikrobiota auf der (menschlichen) host, muss der Darm-Immunsystem commensal Mikroben zu tolerieren ihre Existenz in das Lumen zu ermöglichen , sondern auch die Erreger abzutöten, 9-11 von luminalen Seite eindringen. Die intestinale Immunsystem Mechanismen zwischen harmlosen und potentiell schädlichen luminalen Mikroben zu unterscheiden entwickelt; jedoch sind diese Mechanismen noch nicht gut verstanden 12. Darm Aufrechterhaltung der Integrität erfordert eine streng reguliert Immunhomöostase 13 die Balance zwischen Toleranz und Immunität zu halten. Ein Ungleichgewicht in Immunhomöostase trägt zur Induktion von intestinalen Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 3,14.

Es gibt zwei Haupttypen von IBD: Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC). Bei Patienten mit diesen Erkrankungen leiden in der Regel von rektale Blutungen, schweren Durchfall und Bauchschmerzen 15,16. Die einzige Ursache von IBD ist nach wie vorunbekannt, aber eine Kombination von genetischen Faktoren, Umwelteinflüsse und dysregulated Immunreaktionen könnten das Schlüsselereignis für die Entwicklung der Krankheit 15 sein.

Tiermodelle für IBD sind seit über 50 Jahren verwendet. In den letzten Jahrzehnten neue IBD Modellsysteme wurden die verschiedenen Hypothesen über die Pathogenese von IBD 17,18 zu testen , entwickelt. Die am besten charakterisierte Modell der chronischen Kolitis ist die T-Zell - Transfer - Modell , das Störung der T-Zell - Homöostase 19,20 induziert. Dieses Modell beinhaltet naive T - Zellen von Mäusen immunokompetente in Wirte übertragen , die T- und B-Zellen (wie RAG - / - und SCID - Mäuse) fehlt 16,21. Die Entwicklung der Krankheit in diesem Modell wird durch die Auswertung der Anwesenheit von Durchfall, reduzierte körperliche Aktivität, und der Verlust von Körpergewicht für 3-10 Wochen überwacht. Dies wird so das Wasting - Syndrom 16 genannt. Im Vergleich zu den gesunden Mäusen die Kolon-Gewebe transplantiert Wirte ist thicker, kürzer und schwerer 16. Verwendung des T - Zellen - Übertragungsmodell ist es möglich , zu verstehen , wie verschiedene T - Zellpopulationen 22 zur Pathogenese von IBD beitragen kann. Die T-Zellen-Transfer-Modell analysiert nicht die Wechselwirkungen zwischen den APCs und T-Zellen im Krankheitsprozess in einer Antigen-spezifischen Weise. Es hat sich gezeigt , dass eine Wechselwirkung zwischen myeloiden Zellen und lymphoiden Zellen für die Entwicklung von Darmentzündungen 23 verantwortlich sein könnte. Obwohl viele Aspekte der IBD geklärt sind, die ersten Ereignisse, die noch an der Krankheitsentwicklung führen muss deutlich verstanden werden.

Es wurde in der Abwesenheit von Mikrobioten Übertragungs colitis gezeigt , dass nicht 24 festgelegt werden. Vor kurzem mehrere Theorien legen nahe , dass IBD 25 ein Ergebnis einer Immunantwort gegen kommensalen Bakterien sein könnte. Autoren haben auch vorgeschlagen, dass kommensalen Bakterien sind wesentliche Entzündung im distalen Darm zu induzieren26. In keimfrei (GF) Tiere , die intestinale Immunsystem 27,28 Regel beeinträchtigt, sondern eine Kolonisierung dieser Mäuse mit einem Gemisch aus specific pathogen free Bakterien führt zur Entwicklung des vollständig kompetenten intestinale Immunsystem 29. Daher scheint der Mikrobioten ein Schlüsselelement bei der Pathogenese von IBD zu sein, entweder als ein Mechanismus, der prädisponiert oder schützt gegen die Entwicklung von Darmentzündung 30,31. Aktuelle Theorien besagen , dass IBD ein Ergebnis der mikrobiellen Ungleichgewicht ist, genannt dysbiosis, in genetisch prädisponiert Patienten 32, aber es ist noch nicht klar , ob die Dysbiose ist die Ursache oder die Folge der Krankheit 12. Angesichts der Rolle von Mikroorganismen in der Entwicklung von IBD, zeigten in vitro - Experimente , dass CD4 + T - Zellen durch APCs gepulst mit Darmbakterien 33,34 aktiviert werden kann.

Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die aus Antigenenverschiedene commensal Bakterienarten, wie beispielsweise E. coli, Bacteroides, Eubacterium und Proteus der Lage sind, CD4 + T - Zellen 35 zu aktivieren. Dies zeigt, dass Präsentation von bakteriellen Antigenen an T-Zellen von Bedeutung für die Entwicklung von IBD ist. Abgeleitet Um die Komplexität von mehreren Antigenen zu reduzieren durch die Mikroflora im Krankheitsverlauf, ein E. coli - Stamm wurde erstellt, der die OVA - Antigen produziert. Transfer ulcerosa wurde durch Injizieren von OVA-spezifischen T - Zellen in RAG induziert - / - Tieren besiedelt mit OVA-exprimierenden E. coli.

Dieses Modell basiert auf den letzten Hinweise darauf , dass CX 3 CR1 + MPs, eine wichtige Zell - Untergruppe in der Kolon - Lamina propria (clp) 36, sind mit CD4 + T - Zellen während der Übertragung in Wechselwirkung Colitis 37. MPs Darmlumen für teilchenförmiges Antigen, wie Bakterien abzutasten, deren Dendriten unter Verwendung von 36, 38,39. Vorherige Studiengezeigt , dass die Abgeordneten wie OVA aufnehmen kann Lumen 40,41 in den Darm auch lösliche Antigene, eingeführt. Angesichts der Fülle von CX 3 CR1 + MPs im clp, ist es möglich , dass diese Zellen luminalen Bakterien probieren können und die Interaktion mit CD4 - T - Zellen. Konfokale Bildgebung von Mäusen transplantiert mit OVA-spezifischen CD4 + T - Zellen mit E. kolonisiert coli CFP-OVA, zeigen , daß CX 3 CR1 + MPs in Kontakt mit OT-II CD4 + T - Zellen während der Entwicklung von antigen-getrieben ulcerosa. Dieses Modell erlaubt die Untersuchung der Antigenpräsentation Prozess zwischen intestinalen APCs und T-Zellen spezifisch nur für bestimmte Antigen-exprimierenden Bakterien in das Darmlumen.

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Protokoll

Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierhaltung der Universität Ulm (Ulm, Deutschland) gezüchtet und gehalten. Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien des örtlichen Tier Verwendung und Pflege Ausschuss und die nationalen Tierschutzgesetz durchgeführt.

1. Aufbau des PCFP-OVA - Plasmid

  1. Amplify die volle Größe OVA - Gen die Primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') und Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 unter Verwendung von Plasmid pCI-OVA (Ampicillin - resistente) 42 als Vorlage verwendet wird . Klonierung des PCR - Produkts (dh die OVA - codierende Sequenz) in einen handelsüblichen Phagen - Mitte - Vektor unter Verwendung SpeI und ClaI - Restriktionsstellen der Primer und Vektor der spezifischen OVA-Plasmid zu ergeben.
  2. Amplify der GFP-kodierenden Gen zusammen mit dem starken konstitutiven Promotor P hyper unter Verwendung von Plasmid pAD 1 -cCFP (Chloramphenicol - resistent) 43 als Templat und Primer CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') und CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Klonen der GFP-kodierenden Gens in das spezifische OVA-Plasmid (Ampicillin - resistente) unter Verwendung der SpeI und SacI Restriktionsstellen der Primer und Vektor - 37. Dies führt einen Abstandhalter von 6 Glycinreste zwischen der GFP-Codierung von OVA-kodierenden Sequenz.

2. Konstruktion von E. coli PCFP-OVA

  1. Wachsen E. coli - Stamm DH10B in 100 ml Luria Bertani (LB) Medium aerob bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler über Nacht.
  2. Mischen Sie 800 ul Bakterienkultur mit 200 ul Glycerin zu Glycerin Lager und bei -80 ° C erzeugen.
  3. In 50 ul E. coli-Stamm DH10B aus Glycerin Lager in 5 ml LB-Medium und wachsen sie aerob bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler overnight.
  4. Übertragung der Kultur in einem Schikane 1 L Erlenmeyerkolben mit 250 ml LB-Medium bei 37 ° C in einem Rotations shake.
  5. Wachsen Bakterien bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,5 und dann kühlen die Kultur auf Eis für 30 min. Zentrifugiere die Bakterien bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
  6. Resuspendieren Bakterien mit 100 ml eiskaltem sterilem H 2 O und Zentrifuge die Bakterien bei 5000 × g für 10 min bei 4 ° C Resuspendieren Bakterien mit 100 ml eiskaltem 10% Glycerin und Zentrifuge die Bakterien bei 5000 × g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen zweimal letzten Schritt.
  7. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Bakterien in 700 ul 10% Glycerol. Frieren 50 ul Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.
  8. Tauen Sie ein 50-ul-Aliquot auf Eis und Transfer in ein vorgekühltes Elektroporationsküvette (2 mm Elektrodenabstand).
  9. Zugabe von 5 & mgr; l Plasmid - DNA (100 ng) in die 50 & mgr; l E. coli aliquots. Führen Sie die Elektroporation mit einem einzigen Impuls bei 25 & mgr; F, 200 Ohm (Ω) und 2,5 kV.
  10. Resuspendieren Bakterien in 1 ml vorgewärmtes SOC-Medium (5 g / l Hefeextrakt, 2 g / l Trypton, 10 mM Natriumchlorid, 2,5 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat) und inkubiere bei 37 ° C aerob für 1 Stunde.
  11. Platte Bakterien auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin 100 ug / ml (mit 100 ul einer 100 mg / ml Ampicillin Lager auf 100 ml LB-Agar), ergänzt und Inkubation über Nacht aerob bei 37 ° C.
  12. Wählen Sie einzelne Kolonien und Wiedersträhne sie in LB-Agar-Platten, ergänzt mit Ampicillin 100 ug / ml. Inkubieren über Nacht aerob bei 37 ° C.
  13. Wählen Sie einzelne Kolonien und wachsen sie über Nacht in 10 ml LB-Medium, ergänzt mit Ampicillin 100 ug / ml für Plasmidisolation. Verwenden Sie handelsübliche Plasmid - Mini Prep - Kit und eluieren Plasmid - DNA mit 30 & mgr; l dH 2 O (destilliertes Wasser) nach Hersteller; S-Protokoll. Überprüfen Plasmide durch Restriktionsanalyse und DNA - Sequenzierung 37,42,43.
  14. Stellen Sie eine Kultur der positiven Klone von E. up coli PCFP-OVA in 100 ml LB - Medium mit Ampicillin 100 & mgr; g / ml ergänzt. Wachsen aerob bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler über Nacht.
  15. Mischen Sie 800 ul Bakterienkultur mit 200 ul reines Glycerin und bei -80 ° C.
  16. Zentrifugieren Sie den Rest der Nacht-Kultur bei 5000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und das Pellet in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Platz 10 ul der Suspension auf Glasobjektträger und bedecken Sie es mit einem Deckglas.
  17. Beachten Sie die Proben in einem Standard-Fluoreszenzmikroskopie die Expression Fluoreszenz von GFP-OVA (CFP Anregung bei 450 nm, Emission bei 480 nm) zu bestätigen. Analysieren Sie die Bakterien mit einer Vergrößerung 400X beginnen.
  18. Zentrifuge 1 ml von Bakterien aus Übernacht-Kulturen bei 5.000 xg für 10 min, RT. Resuspendieren des Pellets in 40 ulPBS und sieden bei 95 ° C für 10 min.
  19. Zentrifugieren Sie die Proben bei 30.000 × g für 10 min und verwenden Sie die Überstände für Western - Blot - Analyse 37. Verwenden Sie die Kaninchen-raiste anti-OVA polyklonalen Antikörper, verdünnt 1: 400.

3. Erzeugung von OT-II / Red Mäuse

  1. Überqueren Sie eine männliche / weibliche OT-II - Maus mit einer weiblichen / männlichen Maus exprimieren , rot fluoreszierendes Protein (beide Stämme im Handel erhältlich), um die OT-II / Red Mäuse 37 zu erzeugen.

4. Spleen Zellisolierung

  1. Euthanize die OT-II / Red-Mäuse durch zervikale Dislokation nach der Narkose durch Inhalation von jedem halogenierten Ether (bis zu 5% für die Induktion) im Handel erhältlich.
  2. Mit einer Schere die linke überlegen Bauch Teil der Maus zu schneiden. Unter diesem Bauch Teil gibt es die Milz (ovale Form mit einem dunkelroten Farbe). Mit einer Schere und Pinzette zu entfernen.
    1. Extrahieren Sie die Milz der OT-II / Red Mäusen und führt es durch einen 100& mgr; m Zellsieb auf einem 50-ml-Röhrchen mit dem Kolben einer 1 ml Spritze, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, positioniert ist. Waschen das Sieb zweimal mit 10 ml PBS mit 1% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 390 g für 5 min bei RT. Das Pellet mit 5 ml vorgewärmtes Lysepuffer (144 mM NH 4 Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) , um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Inkubieren 10 min bei 37 ° C.
  4. Waschen Sie die Probe mit 25 ml PBS mit 1% FBS. Zentrifuge bei 390 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren des Pellets in 10 ml PBS mit 1% FBS ergänzt.
  5. Zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Mischen 10 ul der Zellen-Suspension mit 10 ul einer 0,4% Trypan-Blau-Lösung. Inkubieren für 1-2 min.
    1. Füllen Sie den Hemocytometer Kammer mit 10 & mgr; l von gefärbten Zellen. Zählen von Zellen unter dem Mikroskop in vier 1 × 1 mm 2 Quadraten einer Kammer und determine die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat. Lebensfähige Zellen erscheinen weiß, tote Zellen blau erscheinen. Um die Anzahl der Zellen bestimmen / ml Zellzahl um den Faktor der Verdünnung multiplizieren. Wenn 2-4 Quadranten gezählt werden, teilen Sie durch die Anzahl der Quadranten.

5. CD4 + CD62 L + T - Zell - Anreicherung

  1. Bereichern Milzzellen für CD4 + CD62L + T - Zellen über magnetische Isolierung Kit die Prinzipien der negativen oder positiven Selektion verwenden. Hier verwenden negative Selektion CD4 + T - Zellen zu isolieren und eine positive Selektion verwenden , um weiter bereichern die CD62L + Bevölkerung innerhalb der CD4 + T - Zell - Pool.
    HINWEIS: In der negative Selektionsverfahren, die Zellen, die nicht isoliert werden (hier: alle CD4-negative Zellen) mit spezifischen Antikörpern, gekoppelt mit magnetischen Mikrokugeln markiert sind. Während der Spalte Waschen der CD4 + T - Zellen , die Schritte werden durch die Säule passieren , so dass sie EASI sein kannly gesammelt. In den positiven Zellen Auswahlverfahrens werden mit entsprechenden Antikörper isoliert markiert gekoppelt mit magnetischen Mikrokügelchen. Während die Säule Waschen der markierten Zellen Schritte werden in der Säule bleiben, und sie können durch Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld und Spülung mit dem Puffer gesammelt werden.
  2. Für die negative Selektionsverfahren, resuspendieren 10 7 gesamt Milzzellen in 40 & mgr; l kaltem PBS , supplementiert mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA). Zugabe von 10 & mgr; l Biotin - markierten Antikörper - Cocktail mit dem magnetischen Isolation Kit geliefert (spezifische Antikörper die Bindung der nicht-CD4 + T - Zellen) und inkubiere 15 min auf Eis.
    1. Zugabe von 30 & mgr; l kaltem PBS mit 0,5% BSA ergänzt war, und 20 ul Anti-Biotin-Mikrokügelchen. Inkubieren 20 min auf Eis.
    2. In der Probe 10 ml PBS, ergänzt mit 0,5% BSA und Zentrifuge bei 390 × g für 5 min. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Resuspendieren der Zellen in 1 ml kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSEIN.
    3. Die Säule, spezifisch für den negativen Selektionsverfahren im Magnetfeld und Spülen mit 3 ml kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSA auf die Säule. Fügen Sie die Zellsuspension auf die Säule und wasche 3mal mit 3 ml kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSA.
    4. Zentrifugenzellen des Ausflusses bei 390 xg für 5 min. Abstrom , das durch die Spalte enthält unmarkierten CD4 + T - Zellen. Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS mit 0,5% BSA ergänzt war, und die Zellen zu zählen.
    5. Zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Mischen 10 ul der Zellen-Suspension mit 10 ul einer 0,4% Trypan-Blau-Lösung. Inkubieren für 1-2 min.
      1. Füllen Sie den Hemocytometer Kammer mit 10 & mgr; l von gefärbten Zellen. Zählen von Zellen unter dem Mikroskop in vier 1 x 1 mm 2 Quadrate einer Kammer und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat. Lebensfähige Zellen erscheinen weiß, tote Zellen blau erscheinen. Zur Bestimmung der Anzahl der Zellen / mL multiply cell Zahl mit dem Faktor der Verdünnung. Wenn 2-4 Quadranten gezählt werden, teilen Sie durch die Anzahl der Quadranten.
  3. Für die positive Auswahlverfahren, mit 10 & mgr; l von CD62L Mikrokügelchen pro 10 7 vorangereicherte CD4 + T - Zell - Fraktion. Inkubieren 15 min auf Eis.
    1. In der Probe 10 ml PBS, ergänzt mit 0,5% BSA und Zentrifuge bei 390 × g für 5 min. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Resuspendieren in 500 & mgr; l kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSA.
    2. Platzieren Sie die bestimmte Spalte für den negativen Selektionsverfahren im Magnetfeld und Spülen mit 500 ul kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSA auf die Säule. Hinzufügen Zellsuspension auf die Säule und wasche 3mal mit 500 ul kaltem PBS, supplementiert mit 0,5% BSA.
    3. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie es auf einem geeigneten Sammelröhrchen. 1 ml PBS mit 0,5% BSA auf die Säule und spülen CD4 + CD62L + T - Zellens in der Säule zurückgehalten, indem Sie den Kolben in die Säule schieben.
      HINWEIS: Die isolierten CD4 + CD62L + T - Zellen sind nun bereit für die Downstream - Anwendungen, wie beispielsweise in vivo - Experimenten. Nach den Anweisungen des Herstellers von der CD4 + CD62L + T - Zellen - Extraktions - Kit, sind die Mikrokügelchen nicht toxisch. Aufgrund der geringen Größe (etwa 50 nm), aktivieren sie keine Zellen und sie werden nicht Zelloberflächenepitope sättigen. Daher werden die isolierten Zellen können in immundefizienten Mäusen übertragen werden colitis 37,44,45 zu induzieren.
    4. Zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Mischen 10 ul der Zellen-Suspension mit 10 ul einer 0,4% Trypan-Blau-Lösung. Inkubieren für 1-2 min.
      1. Füllen Sie den Hemocytometer Kammer mit 10 & mgr; l von gefärbten Zellen. Zählen von Zellen unter dem Mikroskop in vier 1 x 1 mm 2 Quadrate einer Kammer und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat. Lebensfähige Zellen appear weiß, tote Zellen blau erscheinen. Um die Anzahl der Zellen bestimmen / ml Zellzahl um den Faktor der Verdünnung multiplizieren. Wenn 2-4 Quadranten gezählt werden, teilen Sie durch die Anzahl der Quadranten.

6. Induktion von Antigen-driven ulcerosa

  1. Injizieren intraperitoneal 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T - Zellen in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - Mäusen. Zur Induktion von antigen-spezifischen Kolitis, verabreichen E. coli PCFP-OVA jeden zweiten Tag mit einer Dosis von 1 x 10 8 koloniebildende Einheit (CFU) in 100 & mgr; l PBS pro Tier mittels Schlundsonde oder oral Instillation hinter den Schneidezähnen.
  2. Überwachen Sie zweimal wöchentlich das Körpergewicht von transplantierten Mäusen und ihren klinischen Zustand (Vorhandensein von Blut im Stuhl, Stuhlkonsistenz und die Aktivität der Mäuse).

7. Gewebeproben für eine histopathologische Untersuchung

  1. Nehmen Sie Gewebeproben von the Dickdarm von Mäusen, fix in neutral gepufferte Paraffin Formalin (10%) und die Einbettung in wie zuvor 36,46 beschrieben.
  2. Abschnitt die Paraffinproben auf einem Mikrotom, montieren Sie auf Objektträger und führen Sie die H & E Fleck 47,48.
  3. Kategorisieren der Histologie des Dickdarms wie zuvor 47,48 veröffentlicht: normal (Score 0); mild ulcerosa (Score 1), moderate ulcerosa (Score 2) und schwere Kolitis (Score 3).

8. Isolierung von Kolon Lamina Propria Zellen

  1. Euthanize transplantierten Mäuse durch zervikale Dislokation nach der Narkose durch Inhalation von jedem halogenierten Ether (bis zu 5% für die Induktion) im Handel erhältlich.
  2. Legen Sie das Tier nach unten mit dem Bauch nach oben zeigt. Verwenden einer Pinzette, um die Haut nach vorne in die Harnröhrenöffnung zu greifen. Mit einer Schere die Haut entlang der ventralen Mittellinie von der Leiste auf der Brust zu schneiden. Ziehen Sie die Haut an den Seiten zurück.
  3. Schnitt durch die transparente Wand Peritonealdialyse Muskel- undÖffnen der Körperhöhle nach oben. Identifizieren Sie den Doppelpunkt, der aus dem Anus zu Blinddarm 49 geht. Schneiden Sie die zwei Extremitäten und das Gewebe von jedem Fett befreien.
  4. Öffnen Sie die in Längsrichtung Kolon eine Dissektion Schere. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kolon Gewebe in einer Petrischale zu schütteln, die 25 ml PBS mit 1% FBS zu entfernen Schmutz und Schleim. Schneiden Sie den Doppelpunkt in 5 bis 8 mm große Stücke.
  5. Legen Sie die Kolonabschnitten in einem 50-ml-Röhrchen mit 20 ml des Waschpuffer. Der Waschpuffer enthält 500 ml DPBS, 10 mM Hepes und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
  6. Vortexen das Röhrchen für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit.
  7. Inkubieren des Röhrchens mit den Kolonabschnitten in einem Wasserbad bei 37 ° C mit 200 Upm für 10 min Schütteln.
  8. Nach der Inkubation vortexen das Röhrchen für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit.
  9. Die Überstände verwerfen und legen Sie die Gewebeproben in einem neuen 50-ml-Tube 20 ml des Waschpuffer enthält. Wiederholen Sie die Schritte 6-9 dreimal
  10. Entsorgen Sie die supernatants und legen die Gewebeproben in einer Petrischale 25 ml PBS enthielt. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Gewebeproben in der Petrischale zu schütteln für einige Sekunden Rest epithelialen Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  11. Schneiden colonic Gewebe in 2 x 2 mm 2 Stück und verdauen sie durch Inkubation in 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 0,5 mg / ml Kollagenase Typ VIII aus Clostridium histolyticum und 10 U / ml DNaseI.
  12. Vortexen das Röhrchen für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit.
  13. Inkubieren der Kolon-Fragmente in einem Wasserbad bei 37 ° C mit 200 Upm für 35 min Schütteln und das Röhrchen für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit alle 5 min vortexen.
  14. Am Ende der Inkubation vortexen das Röhrchen für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit.
  15. Sammeln Sie die verdauten Fragmente von ihnen durch einen 70 & mgr; m Zelle Sieb auf einem neuen 50-ml-Röhrchen positioniert vorbei.
  16. Waschen Sie die Probe mit 20 ml DPBS Zugabe und Zentrifuge bei 400 g für 5 min. Dann Resuspensierbereich ter Zellen in 1 ml DPBS.
  17. Zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Mischen 10 ul der Zellen-Suspension mit 10 ul einer 0,4% Trypan-Blau-Lösung. Inkubieren für 1-2 min.
    1. Füllen Sie den Hemocytometer Kammer mit 10 & mgr; l von gefärbten Zellen. Zählen von Zellen unter dem Mikroskop in vier 1 x 1 mm 2 Quadrate einer Kammer und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat. Lebensfähige Zellen erscheinen weiß, tote Zellen blau erscheinen. Um die Anzahl der Zellen bestimmen / ml Zellzahl um den Faktor der Verdünnung multiplizieren. Wenn 2-4 Quadranten gezählt werden, teilen Sie durch die Anzahl der Quadranten.

9. Die extrazelluläre Anfärbung für die FCM-Analyse

  1. Zentrifugieren Sie die clp Zellen 5 min bei 390 x g. Resuspendieren der Zellen in 1 ml FACS A (PBS, ergänzt mit 1% BSA und 0,1% Natriumazid)
    HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Es kann Hypotension, Hypothermie, Kopfschmerzen Krämpfe oder Tod führen. Verdünnte Lösungen von Natriumazid (00,1 bis 1,0%) in der Regel stellen kein außergewöhnlichen Gefahren für den Benutzer, aber sie sind Augen- und Hautreizstoffe. Daher ist nur Natriumazid in der chemischen Haube, während Sie ein Laborkittel und ein doppeltes Paar Einweg-Handschuhe zu tragen.
  2. Inkubieren der Zellen für 15 min bei RT mit dem monoklonalen Antikörper (mAb) 2.4G2 gerichtet gegen die FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug mAb / 10 6 Zellen) in FACS A. verdünnt
  3. In 200 ul FACS A zu den Zellen und Zentrifuge 5 min bei 390 x g. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Inkubieren der Zellen mit 0,5 ng / 10 6 Zellen des entsprechenden mAb für 20 min bei 4 ° C. Verdünnen Sie die Antikörper in FACS A.
  4. In 200 ul FACS A zu den Zellen und Zentrifuge 5 min bei 390 x g. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Resuspendieren der Proben in 100 ul FACS A.
  5. Analysieren T - Zellen aus CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - Mäuse rekonstituiert mit OT-II / Red CD4 T - Zellen am Durchflusszytometer 37.
  6. Analysieren von Daten im Handel erhältliche Software.

10. konfokale Mikroskopie Analyse

  1. Analysieren Sie den Doppelpunkt von CX 3 CR1 GFP / + Mäusen wiederhergestellt oder nicht mit OT-II / Red CD4 + CD62L + T - Zellen und oral jeden zweiten Tag gefüttert mit 1 x 10 8 KBE E. coli - Stamm DH10B PCFP-OVA.
  2. Entfernen Sie den Darm der Mäuse mit einer Schere und Pinzette. Öffnen Sie es in Längsrichtung eine Dissektion Schere.
  3. Schneiden Sie ein 5-8 mm großes Stück Kolon Probe mit einer Schere, setzen auf Glasobjektträger geben und mit Deckgläsern.
  4. Analysieren die Kolon-Proben mit einem konfokalen Mikroskop bei einer Vergrößerung von 40 / 1,30.
  5. Ermitteln Sie die CX 3 CR1 + MPs, beschriftet mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP), einen Filter mit einer Anregung bei 488 nm und Emission bei 509 nm verwendet wird .
  6. Detektieren die CD4 + T - Zellen exprimieren red Protein unter Verwendung eines Filters eingestellt mit einer Anregung bei 554 nm und Emission bei 586 nm.
  7. Detect E.coli PCFP-OVA einen Filter mit einer Anregung bei 450 nm und Emission bei 480 nm verwendet wird .
  8. Definieren Sie einen Bereich von Interesse und erzeugen Streudiagramme wie zuvor 50 beschrieben , um die Co-Lokalisierung Analyse durchzuführen. Verwenden Sie zwei verschiedene Formeln: die Overlap Koeffizient nach Manders und der Koeffizient Pearson.

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Ergebnisse

Ein Antigen-driven ulcerosa Modell zu etablieren ein E. coli - Stamm in welcher wurde konstruiert , das ein Plasmid enthält das Gen für GFP an die codierende Sequenz für das Hühner - Ovalbumin - Protein fusioniert ist und das Fusionskonstrukt unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotor P hyper (1A) ausgedrückt wird. Fluoreszenzmikroskopie zeigt , daß das rekombinante E. coli PCFP-OVA, jedoch nicht die elterliche...

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Diskussion

Wie bei jedem anderen Modell, das Antigen-driven oben kann beschrieben ulcerosa Modell einige Probleme präsentieren, die der Forscher die Technik der Durchführung bewusst sein müssen. Wenn die OT-II / Red + CD4 + T - CD62L + Zellen in den Rechner eingespritzt wird , muss der Prüfer sehr sanft und vorsichtig , um die Nadel in die Bauchhöhle einzuführen. Geschieht dies nicht, so kann es zu dem Zerreißen des Darms der Maus, die den Tod oder eine subkutane Verabreichung von Zellen führen kan...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

JHN wird vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (SNF 310030_146290).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Modell 3020 GFL
2 mm Spalt Couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell System BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation KitRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
EisessigSigma-Aldrich537020 
Gel-Kammer PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
LadefarbstoffThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Leiter Thermo FisherSM0312
Ethidiumbromid-LösungCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Foto-Dokumentationssystem Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA-Sequenzierung MWG-Biotech GmbH
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BiochromL182-50
Fluoreszenzmikroskop ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Vereinigtes Königreich
Nitrozellulose-Membran Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Elektro-LöschpapierBiometra GmbH846-015-600
Rinderserumalbumine (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumin-Antikörper Abcamab181688
Anti-Kaninchen-IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratPierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific08-771-2
AmmoniumchloridSigma-Aldrich254134-5G
TrisbaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T Isolationskit Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Säulen Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Säulen Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Zuführnadel 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinSigma-Aldrich1496904
HämatoxylinSigma-AldrichH9627
Eosin YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Kollagenase Typ VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) MediumAppliChemA2044, 9050
NatriumazidSigma-Aldrich438456
Maus BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-konjugierte mAb-Bindung Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-konjugierte mAb-Bindung CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 SoftwareDeNovo
Meta konfokales Rastermikroskop ZeissLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM Software Zeissv4.2.0.121
Maxisorp Immunplatten NUNC, Roskilde442404
Streptavidin konjugierte alkalische PhosphataseJackson Immuno Research016-050-084
Alkalisches Phosphatase-Substrat 4-Nitrophenylphosphat DinatriumsalzhexahydratSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN Mikrotiterplatten-ELISA-ReaderTecan
EasyWin SoftwareTecan
DNase I rekombinante4536282001

Referenzen

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Schlagwörter

T Zell Transfermodellkoloniale Lamina propriaOT II CD4 T ZellenCFP OVA exprimierende E colidurchflusszytometrische Analysekonfokale Mikroskopie BildgebungZellisolierungsprotokollGewebedigestionsmethode
Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren
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