Method Article

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

DOI:

10.3791/54421

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September 18th, 2016

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1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

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In diesem Antigen-getriebenen Colitis-Modell wurden OT-II CD4+ T-Zellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren, adoptiv in RAG-/- Mäuse übertragen, die ein grün fluoreszierendes Protein in mononukleären Phagozyten (MPs) exprimieren. Die Wirte wurden mit Escherichia coli (E.coli) konfrontiert, die das Ovalbuminprotein (OVA) exprimierten, das mit einem cyanfluoreszierenden Protein (CFP) fusioniert war.

Abstract

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Entzündliche Darmerkrankung (CED) ist eine chronische Entzündung, die den Magen-Darm-Trakt (GIT) betrifft. Eine der besten Möglichkeiten, die immunologischen Mechanismen während der Krankheit zu untersuchen, ist das T-Zell-Transfermodell der Kolitis. In diesem Modell werden immundefiziente Mäuse (RAG-/-Empfänger) mit naiven CD4+ T-Zellen aus gesunden Wildtyp-Wirten rekonstituiert.

Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der frühesten immunologischen Ereignisse, die zu Krankheiten und chronischen Entzündungen führen, wenn die Darmentzündung fortbesteht, aber nicht von einem definierten Antigen abhängt. Um die potenzielle Rolle von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) im Krankheitsprozess zu untersuchen, ist es hilfreich, ein antigengetriebenes Krankheitsmodell zu haben, in dem ein definiertes kommensales abgeleitetes Antigen zu Kolitis führt. Daher wurde ein Antigen-getriebenes Kolitis-Modell entwickelt. In diesem Modell werden OT-II CD4+ T-Zellen, die nur spezifische Epitope im OVA-Protein erkennen können, in RAG-/- Wirte transferiert, die mit CFP-OVA-exprimierenden E. coli belastet sind. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen APCs und T-Zellen in der Lamina propria.

Introduction

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Der Darm ist die größte Oberfläche des Körpers, die der äußeren Umgebung ausgesetzt ist. Große Arrays von resident Mikroben besiedeln den menschlichen Darm die intestinale Mikrobiota (oder Mikroflora) zu bilden. Dies wird geschätzt , von bis zu 100 Billionen mikrobiellen Zellen zu bestehen und ist eine der am dichtesten besiedelten bakterielle Lebensräume bekannt in der Biologie 1-3. Im GIT Bakterien besiedeln eine Darm-Nische , wo sie überleben und 4 multiplizieren. Im Gegenzug stiftet die Mikrobiota den Host mit zusätzlichen funktionellen Eigenschaften , die nicht auf ihrem Genom codiert 1. Zum Beispiel regt die Mikrobiota die Proli....

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Protocol

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Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierhaltung der Universität Ulm (Ulm, Deutschland) gezüchtet und gehalten. Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien des örtlichen Tier Verwendung und Pflege Ausschuss und die nationalen Tierschutzgesetz durchgeführt.

1. Aufbau des PCFP-OVA - Plasmid

  1. Amplify die volle Größe OVA - Gen die Primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') und Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 unter Verwendung von Plasmid pCI-OVA (Ampicillin - resistente) 42 als Vorlage verwendet wird .....

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Results

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Ein Antigen-driven ulcerosa Modell zu etablieren ein E. coli - Stamm in welcher wurde konstruiert , das ein Plasmid enthält das Gen für GFP an die codierende Sequenz für das Hühner - Ovalbumin - Protein fusioniert ist und das Fusionskonstrukt unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotor P hyper (1A) ausgedrückt wird. Fluoreszenzmikroskopie zeigt , daß das rekombinante E. coli PCFP-OVA, jedoch nicht die elterliche.......

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Discussion

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Wie bei jedem anderen Modell, das Antigen-driven oben kann beschrieben ulcerosa Modell einige Probleme präsentieren, die der Forscher die Technik der Durchführung bewusst sein müssen. Wenn die OT-II / Red + CD4 + T - CD62L + Zellen in den Rechner eingespritzt wird , muss der Prüfer sehr sanft und vorsichtig , um die Nadel in die Bauchhöhle einzuführen. Geschieht dies nicht, so kann es zu dem Zerreißen des Darms der Maus, die den Tod oder eine subkutane Verabreichung von Zellen führen kan.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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JHN wird vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (SNF 310030_146290).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Modell 3020 GFL
2 mm Spalt Couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell System BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation KitRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
EisessigSigma-Aldrich537020 
Gel-Kammer PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
LadefarbstoffThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Leiter Thermo FisherSM0312
Ethidiumbromid-LösungCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Foto-Dokumentationssystem Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA-Sequenzierung MWG-Biotech GmbH
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BiochromL182-50
Fluoreszenzmikroskop ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Vereinigtes Königreich
Nitrozellulose-Membran Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Elektro-LöschpapierBiometra GmbH846-015-600
Rinderserumalbumine (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumin-Antikörper Abcamab181688
Anti-Kaninchen-IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratPierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific08-771-2
AmmoniumchloridSigma-Aldrich254134-5G
TrisbaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T Isolationskit Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Säulen Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Säulen Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Zuführnadel 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinSigma-Aldrich1496904
HämatoxylinSigma-AldrichH9627
Eosin YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Kollagenase Typ VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) MediumAppliChemA2044, 9050
NatriumazidSigma-Aldrich438456
Maus BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-konjugierte mAb-Bindung Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-konjugierte mAb-Bindung CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 SoftwareDeNovo
Meta konfokales Rastermikroskop ZeissLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM Software Zeissv4.2.0.121
Maxisorp Immunplatten NUNC, Roskilde442404
Streptavidin konjugierte alkalische PhosphataseJackson Immuno Research016-050-084
Alkalisches Phosphatase-Substrat 4-Nitrophenylphosphat DinatriumsalzhexahydratSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN Mikrotiterplatten-ELISA-ReaderTecan
EasyWin SoftwareTecan
DNase I rekombinante4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

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Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

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