Methodenartikel

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

DOI:

10.3791/54426

⸱

27. September 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein kostengünstiges, konfigurierbares Morbidostat, das die Charakterisierung von Antibiotikaresistenzen durch dynamische Anpassung der Wirkstoffkonzentration ermöglicht. Das Gerät kann mit einer gemultiplexten mikrofluidischen Plattform integriert werden. Der Ansatz kann für Laborstudien zur Antibiotikaresistenz skaliert werden.

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine kostengünstige, konfigurierbar morbidostat für den Evolutionsweges der Antibiotikaresistenz zu charakterisieren. Die morbidostat ist eine bakterielle Kulturvorrichtung, die kontinuierlich das Bakterienwachstum überwacht und reguliert dynamisch die Arzneimittelkonzentration, die Bakterien ständig herausfordern, wie sie Arzneimittelresistenz zu erwerben entwickeln. Das Gerät verfügt über ein Arbeitsvolumen von ca. 10 ml und ist voll automatisiert und mit Messung der optischen Dichte und Mikropumpen für mittlere und Medikamentenabgabe ausgestattet. Um die Plattform zu validieren, maßen wir die schrittweise Übernahme von Trimethoprim Resistenz in Escherichia coli MG 1655 und integriert , um die Vorrichtung mit einer Mikrofluidik - Multiplex - Plattform Zellmorphologie und Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Der Ansatz kann auf Laboruntersuchungen von Antibiotika-Resistenzen hochskaliert werden, und ist verlängerbar Evolution für Stamm Verbesserungen in Metabolic Engineering und andere Bakterienkultur Experimente adaptiv.

Einleitung

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Seit der Einführung des ersten Antibiotikums Penicillin hat mikrobielle Antibiotika - Resistenz in ein Problem der globalen Gesundheit entwickelt 1. Obwohl der Erwerb von Antibiotika - Resistenzen können nachträglich in vivo untersucht werden, werden die Bedingungen dieser Versuche häufig nicht während der gesamten Evolution 2 gesteuert. Alternativ können adaptive gerichtete Evolution offenbaren die molekulare Evolution einer mikrobiellen Spezies unter Umweltbelastungen oder Selektionsdruck aus einem Antibiotikum 3. In jüngster Zeit haben viele gut kontrollierten evolutionäre Experimente von Antibiotika-Resistenzen, die Entstehung von Antibiotika-Resistenzen aufgeklärt. Zum Beispiel zeigte Austin Gruppe rasche Entwicklung in einem richtig entwickelt mikrofluidische compartmented Umwelt 4. Die neu entwickelte morbidostat induziert systematische Mutationen unter Drogenselektionsdruck 5,6. Die morbidostat, eine mikrobielle selecGerät werden , die die Antibiotika - Konzentration kontinuierlich einstellt eine nahezu konstante Bevölkerung zu erhalten, ist ein großer Fortschritt von der Fluktuationstest in der Mikrobiologie verwendeten 7,8. Im Fluktuationstest, ein Antibiotikum Medikament wird in hoher Konzentration injiziert, und die überlebenden Mutanten werden gesiebt und gezählt. Stattdessen Mikroben in einem morbidostat werden ständig in Frage gestellt und mehrere Mutationen erwerben.

Die morbidostat arbeitet ähnlich der Chemostat, eine Kulturvorrichtung von Novick und Szliard 1950 erfunden , die Nährstoffe durch kontinuierliche Zufuhr während Verdünnen der Mikrobenpopulation 9 eine konstante Population aufrecht erhält. Seit seiner Einführung hat sich die Chemostat wurde weiterentwickelt und verbessert. Aktuelle mikrofluidischen Chemostate haben Nano- und Einzelzellen-Kapazitäten erreicht. Jedoch sind diese Vorrichtungen nicht für adaptive Evolutionsexperimenten, die eine große Zellpopulation mit vielen Mutationsereignisse 10,11 erfordern. Vor kurzem Mini-Chemostate mit einem Arbeitsvolumen von ca. 10 ml wurden ebenfalls entwickelt in den Spalt zwischen Liter Bioreaktoren und der mikrofluidischen chemostat 12,13 zu füllen.

Hier präsentieren wir das Design und die Verwendung eines Low-Cost, automatisierte morbidostat für ein Antibiotikum drug resistance Studie. Das vorgeschlagene Modul kann mit minimalen Hardware-Anforderungen in einem Schüttelinkubator in einem mikrobiologischen Labor eingesetzt werden. Die Open-Source - Firmware auch leicht an spezifische Anwendungen der adaptiven Evolution zugeschnitten, wie Metabolic Engineering 3. Schließlich wird die morbidostat in ein Multiplex - Mikrofluidik - Plattform integriert für die Antibiotika - Resistenzprüfung 14.

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Protokoll

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1. Montage und Vortests des Morbidostat Geräte

  1. Die Montage des Morbidostat
    1. Lochen 3 Löcher auf der Kappe des Kulturfläschchen mit einer 18 G Spritzennadel. Schneiden drei Stück Polyethylenschlauch ~ 7 cm in der Länge. Legen Sie diese drei Stücke aus Polyethylenschlauch auf der Kappe.
    2. Verwenden Sie Klebeband den Rand der Kappe zu wickeln, wie die Besetzung für das Polydimethylsiloxan (PDMS) Mischung zu dienen. Mischungs 5 ​​g A-Komponente und 0,5 g B-Komponente der PDMS in einem 150 ml Kunststoffbehälter durch manuelles Rühren mit einem Zahnstocher. Laden des Gemischs in eine 10 ml Spritze.
      1. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Kappe mit der Spritze. Backen Sie die gesamte Kappe die PDMS für 8 Stunden im Ofen bei 70 ° C zu heilen.
    3. Löten Sie die LED-Anode mit dem 24-Gauge-Kabel und LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mit einem Lötkolben. Dazu wird ein 680 Ω Kohlewiderstand mit 24 G Draht. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband.
    4. Damitlder dem Kollektor des Photodetektors mit dem 24 G Draht und dem Emitter des Photodetektors mit einem 100 k & OHgr Kohlewiderstand. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband.
    5. Setzen Sie die Leuchtdiode in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie die Leuchtdiode und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Stellen Sie sicher , dass die LED arbeitet mit einer Digitalkamera , die IR (zB ein Handy-Kamera) erkennen kann.
    6. Setzen Sie den Photodetektor in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie den Photodetektor und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Schließen Sie das Kabel an beiden Seiten der Photowiderstände , die Spannung über die elektronische Steuerkarte zu messen.
    7. Kleben Sie einen Magneten an der Welle des Lüfters, der als Magnetrührer Einheit dient. Beachten Sie, dass die alignment der Welle des Gebläses zu dem Kulturfläschchen, und der Abstand zwischen der Phiole der Kultur und dem Magneten ist für die ordnungsgemäße Funktion der magnetischen Rühreinheit sehr kritisch.
    8. Schließen Sie jedes Stück Polyethylenschlauch des Kulturfläschchen in das entsprechende Stück Silikonschlauch für die Mikropumpen, mittlere Flaschen und Abfallflasche. Schalten Sie die Pumpe für 1 Stunde und messen das Gesamtvolumen der Mittelflasche in die Kulturfläschchen, die Pumprate zu bestimmen, gepumpt wird. Beachten Sie, dass die typische Pumprate sollte ~ 4 ml / h, die D = 0,33 h dem Verdünnungsrate entspricht -1 für eine 12 ml Arbeitsvolumen der Kulturfläschchen.
    9. Legen Sie die gesamte Baugruppe auf einem mittelgroßen (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Schüttelinkubator.
  2. Vortests die Morbidostat
    1. Set Versorgungsspannung von kühlem Ventilator bis 5 V seinen Motor zu starten, die magnetischen Rührstab zu testen. Beachten Sie, dass die Rührwirkung visuell inspiziert werden kann. Die Spannung, die fahrens der Lüftermotor wird durch Pulsweitenmodulation (PWM) präzise gesteuert werden.
    2. Bereiten Sie eine Reihe von Wildtyp E. coli Proben mit optischen Dichten bei 600 nm typischerweise im Bereich von 0,07 bis 0,3 für die Kalibrierung. Legen Sie einen Test E. coli Probe in der Kulturfläschchen und notieren Sie die Photospannung.
      1. Platz ~ 100 & mgr; l der gleichen Probe in dem Plattenleser und notieren Sie die optische Dichte. Verwenden Sie die Photospannung gegenüber der optischen Dichtedaten der Eichkurve zu zeichnen. Beachten Sie, dass typischerweise in der optischen Dichte einer Einheitsänderung mit dem Bias-Schema hier verwendet, um ~ 7,6 V Änderung der Photodetektor entspricht.

2. Ausführen des Morbidostat

  1. Vorbereitung vor dem täglichen Experiment starten
    1. Bereiten Sie die Kulturfläschchen mit drei extrem chemikalienbeständige Tygon Schläuche mit Innendurchmesser 1/32 Zoll und Außendurchmesser 3/32 Zoll für Einlässe, wie in Abschnitt der Vorrichtung zu bilden1.1 und in Ergänzungs 1.
    2. Bereiten Sie die M9-Minimalmedium (0,2% Glucose) und Trimethoprim (TMP) Arzneimittel enthaltenden Medium. Sterilisieren des Mediums, das Medium Flasche, das Medikament Mittelflasche, die Abfallflasche, und die Kulturfläschchen in einem Autoklaven bei 121 ° C.
      HINWEIS: Der TMP ist eine Stammlösung , die später verwendet wird , um die Konzentrationen in Tabelle 1 und das Medikament dem Medium autoklaviert wird enthaltende TMP erreichen nicht.
  2. Das Ausführen des Morbidostat
    1. Am ersten Tag des Experiments, tauen 1 ml der gefrorenen Wildtyp E. coli MG1655 - Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und Übertragung 120 ul der Zellen zu dem Kultur Durchstechflasche mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. Nach dem ersten Tag auftauen 1 ml der gefrorenen E. coli - Zellen aus dem vorherigen Tag für 5 min und Übertragung 120 ul der Zellen zu einer neuen Kultur Fläschchen mit ~ 12 ml M9 Nährmedium.
    2. Schalten Sie den Schüttelinkubator und stellen Sie die tempe rature bis 30 ° C ohne Schütteln inkubiert.
    3. Starten Sie die morbidostat Operation durch auf der Mikropumpe dreht, die magnetische Rühreinheit und der optische Dichtemessung.
      HINWEIS: Während des Betriebs wird ein Rückkopplungs Schwellwert-Algorithmus wird verwendet, um die Arzneimittelinjektion zu steuern. Wenn die gemessene optische Dichte einen voreingestellten Schwellenwert überschreitet, würde die Arzneimittelinjektionspumpe eingeschaltet und der Mittelpumpe ausgeschaltet werden würde. Andernfalls bleibt die Droge Einspritzpumpe ab und die Mittelpumpe eingeschaltet ist.
    4. Überwachen der Spannung von Zeit zu Zeit, um sicherzustellen, dass das mikrobielle Wachstum ist.
      Hinweis: Wegen der Frost-Tau - Zyklus, E. coli - Zellen zeigen eine Verzögerung von ca. 4 h während jedes Wachstum des Tages.
    5. Nach ca. 23 h, stoppen Sie die Mikropumpe durch seine Versorgungsspannung ausgeschaltet und die Kulturfläschchen herausnehmen. Hinzufügen 15% Glycerin in die Kulturfläschchen und gefrier die Probe bei -80 ° C zur Lagerung.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.5.
le "> 3. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in 96-Well-Format

HINWEIS: Führen Sie die Wachstumsrate Messung in einem Plattenlesegerät mit einer 96-Well-Format, um die Antibiotikaresistenz Ebene zu bestimmen.

  1. Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und übertragen 15 ul der Zelle in das Kulturfläschchen ~ 15 ml M9-Medium enthält. Es ihnen ermöglichen, bis die optische Dichte bei 600 nm wachsen ~ 0,1 erreicht. Teilen Sie die 15 ml in 1 ml Flaschen und fügen Sie die TMP - Medikament bei diesem Schritt die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erhalten , wie in Tabelle 1 gezeigt.
  2. Nehmen Sie 200 ul der Probe aus Schritt 3.1 und Platz in jede Vertiefung in dem Plattenleser und es ihnen ermöglichen, für 12 Stunden 5 zu wachsen. Die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm wird automatisch während der Messung aufgezeichnet.
    HINWEIS: Für jeden Datenpunkt werden drei Messungen aufgezeichnet und gemittelt, um die Konsistenz der Daten zu gewährleisten. Die Daten auf der optischen Dichte gegen die Zeit kann be verwendet, um die Wachstumsrate zu erhalten.
  3. Zeichnen Sie die Wachstumsrate Daten in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration IC 50 zu erhalten. Beachten Sie, dass IC 50 als die Arzneimittelkonzentration definiert , bei der die Wachstumsrate fünfzig Prozent der maximalen Wachstumsrate beträgt 5.

4. Einzelzellmorphologie und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in Mikrofluidiksysteme

  1. Führen Sie die Herstellung der mikrofluidischen Geräte über mehrschichtige weiche Lithographie von PDMS wie an anderer Stelle 15 beschrieben.
    1. Verwenden photolithographischen der Photoresistform für die Steuer- und Strömungsschichten zu machen. Beachten Sie, dass für die Steuerschicht, haben negative Photoresist (~ 15 & mgr; m Höhe) und positive Photoresist (~ 8 & mgr; m Höhe) eine Form auf einer blanken Siliziumwafer herzustellen.
    2. Bereiten PDMS-Mischungen mit Vernetzungsverhältnisse von 5: 1 und 20: 1 für die Steuerschicht und die Strömungsschicht. Setzen Sie die Mischungen in einem Exsikkator unter Vakuum keine Luftblasen zu entfernenFür 1 Std.
    3. Setzen Sie die Steuerschicht Photoresist Formen auf Siliziumwafer Trimethylchlorsilan (TMCS) Dampf. Sprechen Sie die Kontrollschicht von ca. 6 mm Dicke, die durch die PDMS-Mischung Gießen (mit Vernetzungs Verhältnis 5: 1) auf dem Siliziumwafer auf der Steuerschicht Photoresist-Form. Backen Sie die Steuerschicht für 40 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen.
    4. Bilden die Strömungsschicht durch Rotationsbeschichtung eines PDMS-Mischung (mit Vernetzungsverhältnis 20: 1, Schleuderdrehzahl 3000 Upm für 60 sec) auf eine Strömungsschicht Photoresistform. Backen Sie die Strömungsschicht für 30 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen.
    5. Verwenden Sie eine Rasierklinge die Steuerschicht in die gewünschte Chipgröße zu schneiden (in der Regel 3 cm x 2 cm) und abziehen manuell die Steuerschicht. Legen Sie die Steuerschicht auf der Oberseite der Strömungsschicht und richten sie unter einem Stereomikroskop. Cure die ausgerichtete Montage bei 80 ° C im Ofen über Nacht. Danach 5 h die Montage in 250 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter tränken das Rest TMCS auflösen.
    6. Anschließend werden die Einlaßlöcher mit 20 G Nadeln stanzen und das gesamte Elastomer an einem Glasobjektträger mit einer leeren PDMS-Schicht (PDMS Quer Verhältnis Verknüpfung 5: 1, 2,000 Schleuderdrehzahl rpm für 30 sec) beschichtet bonden für 40 sec durch Luftplasmabehandlung bei 1,2 Torr Luftdruck.
    7. Durchführung umfassende Backen für 36 h bei 80 ° C, um die zytotoxischen Wirkungen von PDMS zu reduzieren. Beachten Sie, dass diese Backschritt kritisch ist die Toxizität für die Bakterienzellen zu minimieren.
  2. On Chip Growth Experiment
    1. Bevor in die Mikrofluidik-Vorrichtung geladen wird, spülen Sie es mit entsalztem Wasser für 1 Stunde und M9-Medium für 1 Stunde.
    2. Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und inokulieren Medium ein neues Reagenzglas mit frischem M9. Die Probe wird in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C über Nacht.
    3. Verdünnen Sie die mikrobielle Probe 10-fach mit M9-Medium und laden Sie es in die Mikrofluidik-Vorrichtung durch die mikrobielle Probenbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Dann laden Sie die TMP-DrogeMedium in den Chip durch das Medikament Mittelbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Führen Sie die Vermischung zwischen der Mikrobe und Drogen durch Betätigung des mikromechanischen Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 min.
    4. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip im Mikroskop-Inkubator auf dem inversen Mikroskop angebracht. Erwerben das Zellbild in der Wachstumskammer auf dem umgekehrten Mikroskop jede hr für 8 h mit der CCD-Kamera angebracht ist.
    5. Verwenden Sie das benutzerdefinierte Programm Skript , um die Zellzahlen über einen Schwellenwert - Algorithmus auf den Zellenbilddaten 18 zu berechnen. Beachten Sie, dass die Zellzahldaten werden gemittelt, typischerweise über drei mikrofluidischen Kammern.

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Ergebnisse

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Die oben beschriebene morbidostat ist in 1. Die gemeinsamen morbidostat Operationen, einschließlich der experimentellen Entwicklung, antibiotische Empfindlichkeitstest und Zellmorphologie Prüfung, validiert wurden in einem E. schematisierte coli MG1655 Kultur Trimethoprim (TMP) ausgesetzt, ein häufig verwendetes Antibiotikum 5,6. TMP induziert sehr ausgeprägte schrittweise Erhöhungen der Arzneimittelresistenz und die Mutationen sind um die Di...

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Diskussion

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Ein Low-Fußabdruck morbidostat Gerät von Low-Cost-Komponenten demonstriert. Der Anstieg der Widerstandsniveau Medikament vom Gerät registriert sind konsistent mit denen früherer Berichte 5. Entwickelt für evolutionäre Studien der Arzneimittelresistenz ist das Gerät möglicherweise auf viele andere Experimente. Zunächst wird eine umfassende Datenbank von Medikamenten-induzierten Mutationen können für einen großen Satz von klinisch relevanten Antibiotika hergestellt werden. Zum Beispiel kann die evolutionäre Weg...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Prof. Sze-Bi Hsu und Frau Zhenzhen für die nützlichen Diskussionen und die Hilfe bei der theoretischen Analyse und numerischen Simulation. Y. T. Y. möchte sich für die finanzielle Unterstützung durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie unter den Fördernummern MOST 103-2220-E-007-026 und MOST 104-2220-E-007-011 und durch die National Tsing Hua University unter den Fördernummern 103N2042E1 bedanken, 104N2042E1 und 105N518CE1.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Umwelt-Shaker-InkubatorBioSanES-20
Arduino Leonardo-PlatineArduinoLeonardo
680 Ohm KohlenstoffwiderstandDigikeyBias-Widerstand für LED
100k Ohm KohlenstoffwiderstandDigikeyBias-Widerstand für Fototransistor
940 nm LeuchtdiodeHelle LED ElektronikBIR-BM13E4G-2Optische Dichtemessung
940 nm FototransistorKodenshi ST-2L2BOptische Dichtemessung
Darlington-Paar-IC ToshibaMouserULN2803APGdiesem IC treibt Mikropumpen und Magnetrührwerk
an 5 V DC bürstenloser LüfterADDAAD0405LX-G70Spezifikation: 5 V Versorgungsspannung und 80  Mutti; verfügbar www.jameco.com
Piezoelektrische MikropumpeCurieJetPS15I-FT-5LDruck > 3  kPa; Durchflussrate >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'  
MagnetrührstabCOWIEkonische Form Maße: 10  mm x 4 mm
Glasszintillation 20 ml FläschchenDGSPyrexglas 28 mm (Durchmesser) x 61 mm (Höhe)
für KulturfläschchenSonderanfertigung aus Polyformaldehyd 
SilikonDow CorningSylgald 184zum Verschließen des Glasfläschchens
Medium FlascheVWR66022-065
Difco M9 minimales Salz 5xBDMedium
Cadamino AcidBDMedium
Glucose Sigma
Agar BateriologicalOxoidfür Agarplatte
Luria Bertani Medium
Inverses MikroskopLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDfür mikrofluidische Messungen Verwendung 40X Objektiv NA = 0,55
Mikroskop InkubatorLebendzellinstrumentCU-109für mikrofluidische Messung
MagnetventilePneumadyneS10MM-31-12-3Schließer 1,3 Watt 12 VDC
USB-SchnittstellenkarteHobby EngineeringUSBIO24-R Digitales I/O-Modul für mikrofluidische Messung
LuftkompressorRocker ScientificROCKER 440Druckquelle für Mikrofluidik; Max. Druck 80 psi
Luer-Lock-Anschlüsse auf 1/8" WiderhakenValuePlastics.comMTLL230-1für die mikrofluidische Steuerung
1/8" Widerhaken auf 10-32 GewindeanschlussValuePlastics.comB-1für die mikrofluidische Steuerung
Luer-Lock-Innengewindeanschlüsse auf 10-32 GewindeanschlussValuePlastics.comKFTL-1für die mikrofluidische Steuerung
NPN Darlington-Transistor 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDfür die mikrofluidische Regelung
10 kOhm, Kohlefilmwiderstand, 0,25 WDigiKey.comP10KBACT-NDfür die mikrofluidische Regelung
Tantalkondensator, 10  μ F, 25 V, 10DigiKey.com478-1841-NDfür die mikrofluidische Steuerung
Andor CCD-KameraAndorZyla 4.2 Plus SCMOSfür mikrofluidische On-Chip-Bildgebung
ELISA-Plattenleser
Zweikomponenten-SilikonMomentiveRTV 615für die Herstellung von mikrofluidischen Chips
SU-8 FotolackMicrchemSU8 2015für die Herstellung von mikrofluidischen Chips
AZ4620 FotolackClariantAZ 4620für die Herstellung von mikrofluidischen Chips
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC 32Gfür die Herstellung von mikrofluidischen Chips
20 Gauge SpritzennadelBDfür die Herstellung von mikrofluidischen Chips
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA-PolymeraseToyoboKDO PlusPCR-Amplifikation
TrimethoprimSigma
Plate ReaderBiotekSynergy H1 hybridMessung der Antibiotikaresistenz
Halter %

Referenzen

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