Method Article

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

DOI:

10.3791/54429

⸱

September 20th, 2016

 ,  , 
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

In This Article

Summary

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Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

Abstract

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die frühen heterotypic Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der umgebenden Nicht-Krebs-Stroma zu verstehen ist wichtig, um die Ereignisse zu Aufklären Stromatumoren Aktivierung und Einrichtung des Tumor-Mikroumgebung (TME) führt. Mehrere in vitro- und in vivo - Modellen des TME entwickelt worden; im allgemeinen jedoch erlauben diese Modelle nicht ohne weiteres Isolierung einzelner Zellpopulationen, unter nicht-Stören Bedingungen für eine weitere Studie. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, haben wir ein in vitro TME - Modell unter Verwendung eines Zellwachstumssubstrat , bestehend aus einem durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz verwendet , die einfache Erzeugung von hoch angereicherten Zellpopulationen erlaubt innig gezüchtet, jedoch getrennt, auf jeder Seite der Membran des Einsatzes für längere co -Kultur mal. Durch die Verwendung dieses Modells sind wir stark angereicherte Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) Populationen von normalen diploiden humanen Fibroblasten erzeugen kann folgendeCo-Kultur (120 h) mit stark metastatischen Zellen menschlichen Brustkarzinom, ohne die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung. Zusätzlich wird durch die Porengröße des Einsatzes zu modulieren, können wir für den Modus der interzellulären Kommunikation steuern (zB Gap-Junction - Kommunikation, sezerniert Faktoren) zwischen den beiden heterotypic Zellpopulationen, die Untersuchung der Mechanismen , die die Entwicklung der Genehmigungen zugrunde liegenden TME, einschließlich der Rolle der Gap-Junction-Permeabilität. Dieses Modell dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis für die anfänglichen Ereignisse bei der Verbesserung, die zu Krebs-Stroma-Initiation, die frühe Entwicklung des TME und die modulierende Wirkung des Stroma auf den Antworten von Krebszellen zu therapeutischen Mitteln.

Introduction

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Der Tumor-Mikroumgebung (TME) ist ein hochkomplexes System von Karzinomzellen umfasst, die neben Wirts Stroma koexistieren und sich entwickeln. Diese stromalen Komponente besteht typischerweise aus Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, verschiedene Immunkomponenten sowie einer extrazellulären Matrix 1. Ein wesentlicher Bestandteil, oft die Mehrheit dieses Stroma aktiviert Fibroblasten, häufig als krebsassoziierte Fibroblasten oder Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAF) 2,3 bezeichnet. Im Gegensatz zu normalen, nicht aktivierten Fibroblasten, beitragen CAFs zu Tumor Initiation, Progression, Angiogenese, Invasion, Metastasierung und Wiederholung 4-11 in einer Vielzahl von Karzinomen, einschließlich Brust-, Prostata-, Lungen-, Pankreas-, Haut-, Darm-, Speiseröhren-, und Ovar 5,6,12-17. Doch die genaue Art des Beitrags von CAFs gesamten Krebs Pathogenese bleibt schlecht definiert. Darüber hinaus hat die klinische Evidenz einen prognostischen Wert von CAFs demonstriert, Ihre Anwesenheit zu hochwertigen malignen Erkrankungen, Therapieversagen, und die allgemeine schlechte Prognose 10,18,19 korreliert.

Offensichtlich unser Verständnis der auslösenden Ereignisse in CAF Entwicklung zu verbessern, sowie die interzelluläre Kommunikation, ihre Rolle innerhalb des TME Vermittlung kann spannende neue therapeutische Ziele und verbesserte Strategien, die Patientenergebnisse verbessern könnte. Zu diesem Ziel sind mehrere in vivo und in vitro - Modelle wurden entwickelt. Während in - vivo - Ansätzen mehr reflektierende der Patienten TME sind, besitzen sie Einschränkungen, einschließlich der immensen Komplexität und Heterogenität sowohl innerhalb als auch zwischen Tumoren. Weiterhin Tumorproben von menschlichen Probanden häufig darstellen TME hoch entwickelt und nicht das Verständnis der TME auslösenden Ereignissen ermöglichen. Tierexperimentelle Studien bieten einige Vorteile, aber Verallgemeinerung von Tierdaten auf den Menschen sollten aufgrund von Unterschieden in physi mit Vorsicht erfolgenLogie zwischen Menschen und Tieren, wie Nagetieren (beispielsweise Thiol - Chemie 20, die Stoffwechselrate 21, 22 Toleranz zu betonen, etc.). Außerdem, im Gegensatz zu der menschlichen Bevölkerung, die in der Natur genetisch heterogen ist, werden Labortiere typischerweise bis zur Homogenität gezüchtet. Auch ist es oft schwierig, transient physiologischen Variationen und Zellphänotyp Veränderungen zu untersuchen, sowie zur Kontrolle für bestimmte experimentelle Parameter Tiere wie Nagetieren verwenden. So wird in vitro 2- und 3-dimensionale (2D und 3D) Gewebekulturmodelle werden häufig das grundlegende Verständnis der TME Entwicklung voran verwendet. Trotz ihres Mangels einer genauen Darstellung der Komplexität der in vivo - Systeme bieten diese Modelle Vorteile, die sich stark mechanistische Untersuchungen zu erleichtern. In vitro - Modelle erlauben eine einfachere, konzentriert und kostengünstige Analyse des TME, wobei statistisch signifikante Daten können in erzeugt werdenZellen frei von systemischen Veränderungen, die bei Tieren entstehen.

Es gibt mehrere Arten von in - vitro - Systemen. Die beiden am häufigsten verwendeten TME in vitro - Modelle bestehen aus gemischten Monoschicht oder Sphäroid Zellkulturen. Beide Kulturverfahren vorteilhaft sind für die grundlegende Studien der interzellulären Wechselwirkungen (zB normale Zellen mit Tumorzellen) und für die Analyse verschiedener TME spezifischen Zellphänotyp Veränderungen (beispielsweise Entstehung von Krebs-assoziierten Fibroblasten von normalen Fibroblasten). Zusätzlich werden die Sphäroide Lage , eine reflektierende gewebeartige Struktur des TME zu schaffen, und kann von Tumor Heterogenität 23 repräsentativ sein. Jedoch Sphäroiden produzieren oft sehr unterschiedlichen Sauerstoffspannung Gradienten über Schichten, die 24 Versuchs Schlussfolgerungen erschweren. Leider sind beide Modelle extrem in ihrer Fähigkeit beschränkt, für die weitere Charakterisierung und Untersuchung folgende Ko- reinen Zellpopulationen zu isolierenKultur. Um dies zu tun würde mindestens ein Zelltyp erforderlich fluoreszenzmarkierten oder markiert mit einer identifiziere maker zu sein, und dann Unterwerfen des gemischten Kokultur umfangreiche Verarbeitung und Zellsortierung, die Zellpopulationen zu trennen. Während ein Zellsortierer eine ziemlich reine Zellpopulation zu isolieren kann, muss man sich bewusst zellulären Stress und eine mögliche mikrobielle Kontamination sein 25 - Risiken.

Zur Erleichterung haben das Verständnis der interzellulären Kommunikation, große Anstrengungen unternommen worden , an der Entwicklung und in vitro - Systemen zu optimieren , die eng an die in - vivo - Umgebung nachzuahmen, während eine vereinfachte Ansatz erlaubt. Ein solches Instrument ist die durchlässige mikroporöse Einlage, ein Membransubstrat , die zuerst im Jahre 1953 entwickelt wurde , 26 und anschließend angepasst für vielfältige Anwendungen und Studien (zB Zellpolarität 27, Endozytose 28, Drogentransport 29, Modellierung Gewebe 30, fertlisation 31, Bystander - Effekt 32,33, etc.). Dieses System ermöglicht das Wachstum von Zellen , die mit in vivo -ähnlichen anatomischen und funktionellen Differenzierung sowie die Expression von vielen in vivo - Marker 34,35 , die beobachtet werden , wenn nicht kultiviert auf undurchlässige Kunststoffgeschirr . Weiterhin erlaubt die äußerst dünne poröse Membran (10 & mgr; m dick) , eine schnelle Diffusion von Molekülen und Äquilibrierungszeiten, die die in vivo - Umgebung simuliert , und ermöglicht unabhängige zelluläre Funktion an den beiden apikalen und basolateralen Zelldomänen. Ein zusätzlicher Vorteil der Nützlichkeit des Einsatzes als TME Systems ist die physikalische Trennung von zwei Populationen heterotypic Zelle auf jeder Seite der Membran in den gleichen Umgebungsbedingungen wachsen gelassen, während verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation durch die Membranporen gehalten wird. Obwohl physikalisch getrennt sind, werden die beiden Zellpopulationen metabolisch gekoppelt via sekretiertes Elemente und als dehier, auch durch den Spalt-junctional Kanäle beschrieben. Zusätzlich wird durch die Einsätze bei in vivo partielle Sauerstoffspannung (PO 2) beibehalten wird , reduziert das Modell die Komplikationen von Sauerstoff und chemische in anderen Systemen beobachtet Steigungen. Vielmehr erhöht es das Verständnis der natürlichen Mechanismen der TME-Steuerung. Insbesondere können die beiden Zellpopulationen leicht mit hoher Reinheit, ohne Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung nach länger andauernder Kokultur isoliert werden.

Hier beschreiben wir ein in vitro - Protokoll TME bestehend aus menschlichen Brustkarzinomzellen und humanen Fibroblasten gezüchtet, die jeweils auf beiden Seiten einer durchlässigen mikroporösen Membraneinsatzes, aber dennoch im kontinuierlichen bidirektionale Kommunikation durch die Membranporen. Wir zeigen , dass durch Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen, der Beitrag einer bestimmten Art von interzellulären Kommunikation (beispielsweise sezernierte Faktoren gegen gap junctions) mit der Entwicklung mitkann der TME untersucht werden.

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Protocol

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1. Herstellung von Kulturmedien und Zellen

  1. Bereiten 500 ml Eagle-Minimalmedium, ergänzt mit 12,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml.
    HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden.
  2. Vorbereitung 70 & mgr; l Zellkulturmedium für jeden Einsatz (6-well Format insert): essentiellem Eagle-Minimalmedium mit 50% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS, supplementiert 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml.
    ANMERKUNG: Das Medium , das mit 50% FBS supplementiert ist Zellanheftung an der Unterseite (dh Unterseite) des Einsatzes zu erleichtern. Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden.
  3. Vorbereitung einer Zellsuspension der bestimmten Zellen auf der unteren Seite des Einsatzes zu plattierenden.
    HINWEIS: Hier wurden die Ergebnisse unter Verwendung von AG1522 normalen menschlichen Fibroblasten in 75 cm 2 Zellkulturflaschen, und diese Zellen werden daher im Mittelpunkt der Beschreibung der Suspensionszellzubereitung sein gezüchtet erhalten.
  4. Um Zellen zu sammeln, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellschicht 2x mit 5 ml 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
  5. Entfernen Sie die PBS und verteilt 1 ml 0,25% (vol / vol) mit 2,21 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Trypsin, vorgewärmt auf Raumtemperatur (RT) über die Zellen für 2 min bei RT (Raumtemperatur).
  6. Quenche die Trypsin-Aktivität mit 9 ml komplettem Wachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.1) und sammle die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren die Zellsuspension über die Oberfläche des Kolbens 10x.
  7. Bestimmen Sie die Zellkonzentration durch ein Hämozytometer oder elektronischen Zähler mit und die Zellsuspension Volumen Pipette, die anbietest wirde 250.000 Zellen pro Einsatz in eine sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen.
  8. Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation (800 · g, 2 min). Suspendiere das Zellpellet mit Wachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.2) mit einer Konzentration von 250.000 Zellen pro 70 & mgr; l zu erzeugen.
    HINWEIS: Zellkultur in permeable mikroporöse Membraneinsätze auf 2D Substrate basiert, wird Zellaussaat ähnlicher Weise durchgeführt, mit der Ausnahme sollten die Zellen zunächst in Medium, das 50% FBS enthält, ausgesetzt werden, (vol / vol) Befestigung zu erleichtern.

2. Herstellung von Inserts

HINWEIS: Um sterile Bedingungen, die Arbeit in einer laminaren Strömung biologischen Sicherheitsschrank gewidmet Zellkultur zu gewährleisten.

  1. Wählen Einsätze mit einer Membranporengröße von 0,4 & mgr; m, 1 & mgr; m oder 3 & mgr; m (von der experimentellen Interesse bestimmt (s), als die Porengröße kann verwendet werden, um die Rolle der verschiedenen Arten der interzellulären Kommunikation zu entdecken).
    HINWEIS: Die 0,4 um Poren ist Small genug zu begrenzen Bildung funktioneller gap junctions zwischen den Zellen auf jeder Seite des Einsatzes Membran und kann verwendet werden, die interzelluläre Kommunikation zu untersuchen sezerniert von Faktoren ab. Wohingegen sind die 1 um und 3 um Poren groß genug Bildung funktioneller gap junctions zu ermöglichen, und verwendet werden kann, die interzelluläre Kommunikation sowohl von gap junctions und sekretierten Faktoren zu untersuchen.
  2. Entfernen Sie einzelne Einsätze aus der Verpackung nehmen und in eine gleich große Multi-Well-Platte.
    HINWEIS: Die Einsätze sind mit verschiedenen Membranoberflächen spezifischen Anwendungsanforderungen zu passen (zB 6-Well, 12-Well und 24-Well - Einsätzen.). Hier wurden die Ergebnisse erhalten, die 6-Well-Einsatz mit und wird daher im Mittelpunkt der Modellbeschreibung sein.
  3. Decken Sie die Schale, enthält die Einsätze mit dem Schalendeckel. Die Multi-Well - Platte mit beiden Händen vorsichtig umdrehen die Schale , so dass die Einsatzböden (dh Unterseite) nach oben stehen nun vor.
  4. entfernen Sie the Boden der Multiwell-Schale, die Unterseite der Einsätze aussetzt. Arbeiten mit einem Einsatz in einer Zeit, eine sterile Pinzette und sanft halten Sie den Einsatz an Ort und Stelle. Mit der freien Hand, verwenden Sie eine Pipette mit einem Weithalsspitze 70 ul der Zellsuspension zu zeichnen (hergestellt in Schritten von 1,3 bis 1,8), mit 250.000 Zellen.
  5. Um die Zellen zu plattieren, legen Sie die Pipettenspitze leicht auf die Mitte der Membran des Einsatzes, und langsam die 70 & mgr; l der Zellsuspension pipettiert, während langsam die Pipettenspitze um die Oberfläche der Membran bewegt. Achten Sie darauf, nicht die Pipettenspitze und Zellsuspension an den Rand des Einsatzes zu erweitern.
    ANMERKUNG: Um den Rand des Einsatzes in Berührung Verlust der Kapillarspannung der Zellsuspension auf die Zellen während der Befestigung Austrocknung führt führen könnte.
  6. Wiederholen Sie für verbleibende Einsätze, mit Sorgfalt ausgeübt werden nicht direkt über die freiliegenden Einsätzen, um potenzielle mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
  7. Rückkehr vorsichtig die Multi-WellSchalenboden der Einsätze abzudecken. In einer befeuchteten Luftatmosphäre von 5% (vol / vol) CO 2 bei 37 ° C für 30-45 min halten die Schale mit Einsätzen invertiert, inkubiert.
    HINWEIS: Wenn die Zellsuspension auf den Einsatz in Kontakt mit dem Boden des Bohrlochs, vorsichtig den Schalenboden anheben und auf den Rand der Schale oben ruhen, so dass es einen leichten Winkel bildet und schafft größere Trennung zwischen der Oberfläche der Schale und die untere Seite der Einsätze (wo die Zellen werden). Dadurch werden die Zellen von der Befestigung an der Oberfläche der Vertiefungen anstelle des Einsatzes verhindern.
  8. Im Anschluss an die 30-45 min Inkubationszeit, entfernen Sie die Schale, die Einsätze und gibt ihn in der Laminar-Flow-biologischen Sicherheitsschrank.
  9. Mit zwei Händen zu halten und die Schalendeckel dicht, sanft wieder umkehren die Schale, so dass die Unterseite der Einsätze enthält nun die anhaftenden Zellen nach unten zeigt.
  10. Langsam und vorsichtig 2 ml (1 ml hinzufügen 3 um Poreneinsätze migrati zu vermeidenauf der Zellen durch die Poren Insert) Komplettmedium vorgewärmt (Schritt 1.1) in jede Vertiefung zu sehen, so dass der Boden des Einsatzes eingetaucht ist.
  11. Nach der Zugabe von Einsätzen Wachstumsmedium in alle Vertiefungen enthält, die Schale zurück in den befeuchteten Inkubator.
  12. Ermöglichen die Einsätze 48 h ungestört in den Inkubator zu bleiben. Nach 48 Stunden füttern die Zellen durch die 2 ml Medium aus dem Boden des Bohrlochs Absaugen und Zugabe von 2 ml frisches Wachstumsmedium.
  13. Nach der Zugabe von frischem Medium zu dem Boden des Bohrlochs, seed 1 ml der zweiten Zellpopulation Suspension (~ 250.000 Zellen / ml) auf der oberen Seite des Einsatzes, die bereits die erste Zellpopulation wächst auf der unteren Seite (für diese Experimente, AG1522 (Kontrolle) Zellen oder Krebs (experimentell) Zellen werden auf der Oberseite der Einsätze überzogen, die bereits AG1522 Zellen haben, die dazu bestimmt CAFs zu werden, auf der Bodenseite der Einsätze wächst). Die Schale zurück in den befeuchteten Inkubator.
    HINWEIS: Wenn Arbeiting mit Zellen, die auch des Einsatzes auf den Boden nicht einhalten, können diese Zellen alternativ auf der Oberseite des Einsatzes gewachsen.
  14. Ändern des Mediums bei 24, 72 und 96 Stunden nach der zweiten Population von Zellen auf der Oberseite des Einsatzes Animpfen durch Absaugen des Mediums von der Oberseite des Einsatzes und dem Boden des gut. Sanft 1 ml frisches Medium auf die Oberseite des auf dem Boden des Bohrlochs Einsatz und 2 ml hinzufügen. Ermöglichen die zwei Zellpopulationen in Co-Kultur auf beiden Seiten der mikroporösen permeablen Membran Einsatz für 120 Stunden bleibt.

3. Sammeln von Zellen aus Insert durch Trypsinisierung

HINWEIS: Zusätzlich zu der Leichtigkeit der angereicherten Zellpopulationen zu erhalten, wobei der Einsatz TME Modell ermöglicht auch für ähnliche experimentelle Behandlungen (beispielsweise Inkubation mit Chemikalien, Exposition gegenüber Sauerstoffbedingungen , die über oder unter Umgebungsatmosphäre sind, ionisierende Bestrahlung, etc.) als andere in vitro TME Co-Kultur-Modelle. Weiterhin kann die permeable Einsatz Kokultur Substrat durch Verfahren, die bereits für die Standard-2D-Gewebekulturmodelle entwickelt, analysiert werden. Beispielsweise können Zellen , die aus jeder Seite des Einsatzes Membran geerntet werden hoch angereicherten Populationen zu erhalten, die dann für die Analyse von Endpunkten verwendet werden kann (beispielsweise in situ Immundetektion, Western Blot) oder für nachfolgende Experimente 36 propagiert.

  1. Um Zellen zu sammeln, entfernen Sie den Einsatz aus dem Wachstumsmedium und legen Sie es in eine 35 mm Zellkulturschale mit 1 ml PBS. Waschen Sie den unteren und oberen Seiten des Einsatzes 1x mit 1 ml PBS.
  2. Entfernen Sie die PBS und 200 ul von 0,25% (vol / vol) Trypsin mit 2,21 mM EDTA, vorgewärmt auf RT.
    1. Wenn die Zellen auf der Unterseite des Einsatzes gewachsen zu sammeln, legen Sie die Trypsin-Lösung in das 35-mm-Schale und sanft den Boden des Einsatzes in die Trypsin-Lösung für 2 min bei RT statt.
    2. Wenn die Zelle zu sammelns auf der Oberseite des Einsatzes gewachsen, legen Sie den Einsatz in einer 35-mm-Schale und fügen Sie für 2 min bei RT an die Spitze des Einsatzes und brüten die Trypsin-Lösung.
  3. Quenche die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 800 ul komplettem Wachstumsmedium.
    1. Wenn die Zellen auf dem Boden des Einsatzes gewachsen sammeln, fügen Sie das Wachstumsmedium zu den 35 mm-Schale und sammle die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren die 1 ml der Zellsuspension über die Oberfläche des Einsatzes 10-fach, mit dem Insert in einem leichten gehalten wird Winkel, so daß die Zellsuspension in die Schale sammelt.
    2. Wenn das Sammeln der Zellen, die aus der Oberseite des Einsatzes, fügen Sie das Wachstumsmedium auf die Oberseite und vorsichtig 1 ml der Zellsuspension über die Oberfläche des Einsatzes 10x pipettieren.

4. Charakterisierung von Zell Reinheit durch Durchflusszytometrie

ANMERKUNG: Um die Fähigkeit der permeable mikroporöse Membraneinsätze charakterisieren die Reinheit von t zu haltener zwei Zellpopulationen (dh oben und unten) für bis zu 120 h, Abschnitte 1-3 wurden durchgeführt, mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) -markierte MDA-MB-231 - Zellen auf der Oberseite des Einsatzes überzogen wird und nicht-GFP-markierten AG1522 Zellen auf der Unterseite des 0,4 μm-, 1 μm- plattiert wird, oder 3 & mgr; m Poreneinsätzen.

  1. Sobald die Zellen von der Unterseite des Einsatzes gesammelt wurden (Verfahren in Abschnitt 3 beschrieben ist ), pelletieren Sie die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec).
  2. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in 400 ul Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 1% (Vol / Vol) FBS.
  3. Führen zytometrische Analyse auf einem Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser ausgestattet GFP und ein Bandpassfilter von 530/30 zu erregen GFP Photonenemission 37 zu detektieren.
  4. Für die Zellidentifikationszwecke verwenden AG1522 Kontrollzellpopulationen anzupassen Vorwärts- und Seitenstreuspannungen auf dem Durchflusszytometer. Einstellendie GFP Kanalspannung der zellulären Autofluoreszenz-Wert als die untere Nachweisschwelle für das GFP-Signal zu setzen.
  5. Bestimmen Schwellenanschnittsteuerung Zellen. Beurteilen Sie Reinheit jeder Zellpopulation auf der Basis der Anwesenheit von GFP-positiven Zellen im Vergleich zu Kontrolle.
    ANMERKUNG: Eine reine Population entdeckt von nicht GPF-positiven Zellen reflektierend sein würde.

5. Charakterisierung von Zellen durch In Situ Immunofluorescence

  1. Nach Trypsinisierung von Zellen aus dem Einsatz (siehe Abschnitt 3) Zellen, zu sammeln, Platte 5 x 10 4 Zellen in 250 & mgr; l Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.1) auf sterile Glasplättchen, und lassen für 1 Stunde in einer befeuchteten Luftatmosphäre zu befestigen 5% (vol / vol) CO 2 bei 37 ° C Inkubator.
  2. Am Ende der Inkubation vorsichtig entfernen das Gericht das Deckglas und gibt ihn in der Laminar-Flow-biologischen Sicherheitsschrank.
  3. Vorsichtig 2 ml vorgewärmtes vollständigen Medium (siehe Schritt1.1) zu jeder Schale, so dass das Deckglas eingetaucht.
  4. Nach der Zugabe von Wachstumsmedium zu allen Schalen mit Deckgläsern, kehren das Geschirr einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% (Vol / Vol) CO 2 bei 37 ° C in einem Inkubator für 48 Stunden.
  5. Nach der 48-stündigen Inkubation waschen Sie die Probe 3x mit PBS und fixieren mit 4% (wt / vol) Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT.
  6. Spülen 5x mit Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) und dann mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (wt / vol) Saponin für 5 min permeabilisieren bei RT.
  7. Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen mit 2% (vol / vol) normalem Ziegenserum (NGS), 1% (wt / vol) Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (Sperr Lösung) für 1 Stunde bei RT.
  8. Inkubieren mit dem primären Antikörper (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) über Nacht in Lösung bei 4 ° C blockiert.
  9. Abwaschen ungebundenen primären Antikörper (3x 5 min / Wäsche) mit 0,2% NGS (vol / vol), 1% (Gewicht / Volumen) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (Waschlösung).
  10. Inkubieren mit sekundärem Antikörper bei RT für 1 h in Blockierungslösung (siehe Abschnitt 5.4).
  11. Abwaschen ungebundenen sekundären Antikörper (3x 5 min / Wäsche) mit Waschlösung (siehe Schritt 5.6).
  12. Berg Deckgläser auf einem Schlitten mit einem anti-fade Eindeckmediums mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) und Dichtung mit Nagellack.
  13. Beobachten Zellen eine 63X Öl vergrößerndes Objektiv auf einem inversen Mikroskop mit einer externen Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung ausgestattet ist, und die Aufnahmen eine angeschlossene Digitalkamera zur nachfolgenden Analyse.

6. Charakterisierung von Zellen, die durch Western Blot

HINWEIS: Die Western - Blot - Verfahren wird an anderer Stelle 38 beschrieben. Eine kurze Übersicht ist hier beschrieben:

  1. Nach Ablösung von Zellen aus dem Einsatz durch Trypsinierung, Pellet, das die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec) (siehe Abschnitt 3).
  2. Überstand entfernen und setzt die Zellpellet 2 x mit 100 ul PBS.
  3. Überstand entfernen und lysieren Zellen in 50 & mgr; l von modifizierten Radioimmunpräzipitation Assays (RIPA) Puffer (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), Natriumdesoxycholat Monohydrat (DOC) 0,5% (vol / vol), Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% (vol / vol)), enthaltend Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail.
  4. Inkubieren für 20 min auf Eis und Zentrifugieren bei 19.000 g für 15 min bei 4 ° C.
  5. Die Konzentration der Proteine ​​in dem Überstand einen Protein optische Dichte Assay kompatibel mit den Waschmitteln in der RIPA Puffer.
  6. Getrennten Proteine ​​durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Elektroblot auf eine 0,2 & mgr; m Nitrocellulosemembran.
  7. Inkubieren Membranen in TBS, das 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) und 4% (Gew / Vol) Magermilch (Blockierungslösung) für 60 min und reagieren mit primärem Antikörper bei 4 ° C über Nacht (anti-CAV1, 1: 1000).
  8. Waschen Sie die Membran 3x mit TBST bei RT (5 min / Wäsche).
  9. Inkubieren Membranen für 30 min in Lösung eine blockierende anti-Maus-Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) (1: 5000) enthält.
  10. Waschen Sie die Membran 3x mit TBST bei RT (5 min / Wäsche).
  11. Visualisieren Reaktionsprodukte durch Chemilumineszenz eine Western-Blot-Detektionssystem verwendet wird.

7. Charakterisierung der interzellulären Kommunikation durch Durchflusszytometrie

ANMERKUNG: Um die Anpassungsfähigkeit der permeable mikroporöse Membran zu charakterisieren fügt verschiedene Modi der interzellulären Kommunikation (beispielsweise sezernierte Faktoren, gap junctions) zu untersuchen. Abschnitte 1 bis 2,12 wurden mit nicht-fluoreszierenden AG1522 Zellen durchgeführt, an der Unterseite von 0,4 μm-, 1 μm- plattiert wird, oder 3 & mgr; m-Poreneinsätzen.

  1. Kultur nicht markierten AG1522-Zellen in einer 35-mm-Schale auf 90% Konfluenz Medium in Abschnitt 1.1 beschrieben ist.
  2. Rinse Zellen 1x mit 1 ml HBSS.
  3. Wägezellen mit Calcein AM durch Zellen in HBSS Inkubation 30 & mgr; M Calcein AM enthält.
  4. Inkubieren für 15 min in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% (Vol / Vol) CO 2 bei 37 ° C.
  5. Wasche die Zellen 2x mit 1 ml HBSS.
  6. Trypsinize Zellen durch Zugabe von 200 & mgr; l Lösung von 0,25% (vol / vol) für 2 min bei RT mit 2.21 mM EDTA Trypsin.
  7. Quenche die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 800 ul vollständigem Medium, das 12,5% (vol / vol) FBS.
  8. Bringen Sie Zellen in Suspension durch wiederholtes Pipettieren.
  9. Bestimmen Zellkonzentration von einer Zählkammer oder elektronischen Zähler mit und Platte mit Calcein AM beladen 250.000 Zellen an der Oberseite der Einsätze, die bereits AG1522 Zellen wachsen auf der Unterseite haben.
  10. Inkubiere die Einsätze in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 6 Stunden.
  11. Nach 6 h, sammelt Zellen von der Bodenseite der Einsätze, wie beschriebenin Abschnitt 3.
  12. Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec).
  13. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in 400 ul HBSS, ergänzt mit 1% (Vol / Vol) FBS.
  14. Analysieren Sie die Zellen auf einem Zytometer mit einem Laser ausgestattet und Filter der Lage, spannende und Erfassung der Emission von Calcein (496 nm und 516 nm, jeweils), pro Hersteller-Protokoll.
  15. Für die Zwecke Zellidentifikation, verwenden Sie einen ungefärbten Kontrollzelle AG1522 Bevölkerung Vorwärts- und Seitenstreuspannungen auf dem Durchflusszytometer einzustellen. Stellen Sie die Calcein Kanalspannung der zellulären Autofluoreszenz-Wert als die untere Nachweisschwelle für das Calcein Signal zu setzen.
  16. Bestimmen Sie den oberen Grenzwert mit Calcein belasteter Kontrollzellen. Beurteilen Sie die Kommunikation für jede Zelle Einsatz, basierend auf der Anwesenheit von Calcein-positiven Zellen im Vergleich zu Kontrolle.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angepasst hier wir einen durchlässigen Einsatz mikroporöse Membran eine in vitro Zell heterotypic Cokultur - System zu entwickeln, das die in vivo Tumor - Mikroumgebung (Abbildung 1) nachahmt. Dieses System ermöglicht es für zwei verschiedene Zellpopulationen, die auf beiden Seiten der porösen Membran für längere Zeiträume des Einsatzes angebaut werden (bis zu 120 Stunden, in unserer Anwendung). Wichtig ist das System in der Lage ist, die Reinheit der Z...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches, anpassungsfähig in vitro - Verfahren (Abbildung 1) , die eine durchlässige mikroporöse Membran verwendet Einsatz aus einer Co-Kultur von Zellen heterotypic hoch angereicherten einzelnen Zellpopulationen zu erzeugen. Bezeichnenderweise ist das Modell für verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation zu untersuchen. Die kritischen Schritte umfassen die geeignete Porengröße Einsatz für spezielle experimentelle Interesse (e) Auswahl der erst...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine oder widersprüchliche Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), der National Institutes of Health (CA049062) und der National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G) unterstützt.

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Materials

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Für Zellkultur
AG01522 (d.h., AG1522) humaner diploider FibroblastCoriell107661Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 Brust-Adenokarzinom-ZellliniePerkinElmer119261Elternlinie: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP Brust-Adenokarzinom-ZelllinieCell BiolabsAKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)Corning Cellgro15-010-CV
fötales Rinderserum (FBS), qualifiziertSigmaF6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin)Corning Cellgro25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Lösung, 100xCorning Cellgro30-002-Cl
Transwell-Einsatz (i., permeable mikroporöse Membraneinsatz) (0,4 μ m pore)Costar3450
Transwell Insert (i.e., durchlässige mikroporöse Membraneinlage) (1 μ m pore)Greiner bio-one657610
Transwell Insert (d.h., durchlässige mikroporöse Membraneinlage) (3 μ Costar3452
6-Well-KulturplatteGreiner Bio-One Cellstar657160-01
75 cm2 ZellkulturkolbenCellStar658 170
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1xCorning Cellgro21-040-CVohne Calcium &
Magnesium 0,25% (vol/vol) Trypsin, 2,21 mM EDTA, 1xCorning Cellgro25-053-Cl
15 ml ZentrifugenröhrchenCellTreat229411
35 mm x 10 mm ZellkulturschaleGreiner bio-one627 160
Name<strong>CompanyKatalognummerKommentare
Für die Immunfluoreszenzmikroskopie
Mouse Anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406In situ Immunfluoreszenz - 1:5.000
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatThermoFisher ScientificA-11029In situ Immunfluoreszenz - 1:2.000
Rinderserumalbumin - Fraktion VRocklandBSA-50Immunglobulin- und Proteasefrei
16% (wt/vol) FormaldehydlösungThermoFisher Scientific28908Auf 4% verdünnen mit 1x PBS
Premium Deckglas (22 mm x 22 mm Nr.1)Fisher12548B
Triton X-100SigmaT8787-50ML
SlowFade Gold Antifading-Reagenz mit DAPIInvitrogenS36938
Name<strong>UnternehmenKatalognummer<>strong>Kommentare
Für die durchflusszytometrische Analyse
C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-076
Name<>UnternehmenKatalognummer<>Kommentare
Für die Western-Blot-Analyse
Maus Anti-Caveolin 1BD Transduktionslaboratorien610406Western Blot - 1:1.000
Tween-20BioRad170-6531
Nitrozellulose-Membran (0,2 μ m)BioRad162-0112
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL104001EA
BioRad DC Protein AssayBioRad500-0116
Natriumdodecylsulfat (SDS)BioRad161-0302
Natriumdesoxycholat-Monohydrat (DOC)SigmaD5670
IGEPAL CA-630 (NP40)SigmaI8896
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1BioRad161-0158
Calcein, AM-Molekularsonden

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