Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.
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Methodenartikel
Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
die frühen heterotypic Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der umgebenden Nicht-Krebs-Stroma zu verstehen ist wichtig, um die Ereignisse zu Aufklären Stromatumoren Aktivierung und Einrichtung des Tumor-Mikroumgebung (TME) führt. Mehrere in vitro- und in vivo - Modellen des TME entwickelt worden; im allgemeinen jedoch erlauben diese Modelle nicht ohne weiteres Isolierung einzelner Zellpopulationen, unter nicht-Stören Bedingungen für eine weitere Studie. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, haben wir ein in vitro TME - Modell unter Verwendung eines Zellwachstumssubstrat , bestehend aus einem durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz verwendet , die einfache Erzeugung von hoch angereicherten Zellpopulationen erlaubt innig gezüchtet, jedoch getrennt, auf jeder Seite der Membran des Einsatzes für längere co -Kultur mal. Durch die Verwendung dieses Modells sind wir stark angereicherte Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) Populationen von normalen diploiden humanen Fibroblasten erzeugen kann folgendeCo-Kultur (120 h) mit stark metastatischen Zellen menschlichen Brustkarzinom, ohne die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung. Zusätzlich wird durch die Porengröße des Einsatzes zu modulieren, können wir für den Modus der interzellulären Kommunikation steuern (zB Gap-Junction - Kommunikation, sezerniert Faktoren) zwischen den beiden heterotypic Zellpopulationen, die Untersuchung der Mechanismen , die die Entwicklung der Genehmigungen zugrunde liegenden TME, einschließlich der Rolle der Gap-Junction-Permeabilität. Dieses Modell dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis für die anfänglichen Ereignisse bei der Verbesserung, die zu Krebs-Stroma-Initiation, die frühe Entwicklung des TME und die modulierende Wirkung des Stroma auf den Antworten von Krebszellen zu therapeutischen Mitteln.
Einleitung
Der Tumor-Mikroumgebung (TME) ist ein hochkomplexes System von Karzinomzellen umfasst, die neben Wirts Stroma koexistieren und sich entwickeln. Diese stromalen Komponente besteht typischerweise aus Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, verschiedene Immunkomponenten sowie einer extrazellulären Matrix 1. Ein wesentlicher Bestandteil, oft die Mehrheit dieses Stroma aktiviert Fibroblasten, häufig als krebsassoziierte Fibroblasten oder Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAF) 2,3 bezeichnet. Im Gegensatz zu normalen, nicht aktivierten Fibroblasten, beitragen CAFs zu Tumor Initiation, Progression, Angiogenese, Invasion, Metastasierung und Wie....
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Protokoll
1. Herstellung von Kulturmedien und Zellen
- Bereiten 500 ml Eagle-Minimalmedium, ergänzt mit 12,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml.
HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden. - Vorbereitung 70 & mgr; l Zellkulturmedium für jeden Einsatz (6-well Format insert): essentiellem Eagle-Minimalmedium mit 50% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS, supplementiert 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin....
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Ergebnisse
Angepasst hier wir einen durchlässigen Einsatz mikroporöse Membran eine in vitro Zell heterotypic Cokultur - System zu entwickeln, das die in vivo Tumor - Mikroumgebung (Abbildung 1) nachahmt. Dieses System ermöglicht es für zwei verschiedene Zellpopulationen, die auf beiden Seiten der porösen Membran für längere Zeiträume des Einsatzes angebaut werden (bis zu 120 Stunden, in unserer Anwendung). Wichtig ist das System in der Lage ist, die Reinheit der Z.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches, anpassungsfähig in vitro - Verfahren (Abbildung 1) , die eine durchlässige mikroporöse Membran verwendet Einsatz aus einer Co-Kultur von Zellen heterotypic hoch angereicherten einzelnen Zellpopulationen zu erzeugen. Bezeichnenderweise ist das Modell für verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation zu untersuchen. Die kritischen Schritte umfassen die geeignete Porengröße Einsatz für spezielle experimentelle Interesse (e) Auswahl der erst.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine oder widersprüchliche Interessen haben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), der National Institutes of Health (CA049062) und der National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Für Zellkultur | |||
| AG01522 (d.h., AG1522) humaner diploider Fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 Brust-Adenokarzinom-Zelllinie | PerkinElmer | 119261 | Elternlinie: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP Brust-Adenokarzinom-Zelllinie | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| fötales Rinderserum (FBS), qualifiziert | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Lösung, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell-Einsatz (i., permeable mikroporöse Membraneinsatz) (0,4 μ m pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., durchlässige mikroporöse Membraneinlage) (1 μ m pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (d.h., durchlässige mikroporöse Membraneinlage) (3 μ Costar | 3452 | ||
| 6-Well-Kulturplatte | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 Zellkulturkolben | CellStar | 658 170 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | ohne Calcium & |
| Magnesium 0,25% (vol/vol) Trypsin, 2,21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Zellkulturschale | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name< | strong>Company | Katalognummer | Kommentare |
| Für die Immunfluoreszenzmikroskopie | |||
| Mouse Anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunfluoreszenz - 1:5.000 |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunfluoreszenz - 1:2.000 |
| Rinderserumalbumin - Fraktion V | Rockland | BSA-50 | Immunglobulin- und Proteasefrei |
| 16% (wt/vol) Formaldehydlösung | ThermoFisher Scientific | 28908 | Auf 4% verdünnen mit 1x PBS |
| Premium Deckglas (22 mm x 22 mm Nr.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold Antifading-Reagenz mit DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name< | strong>Unternehmen | Katalognummer | <>strong>Kommentare |
| Für die durchflusszytometrische Analyse | |||
| C3100MP | |||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | <>Unternehmen | Katalognummer | <>Kommentare |
| Für die Western-Blot-Analyse | |||
| Maus Anti-Caveolin 1 | BD Transduktionslaboratorien | 610406 | Western Blot - 1:1.000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrozellulose-Membran (0,2 μ m) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Natriumdesoxycholat-Monohydrat (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1 | BioRad | 161-0158 |
Referenzen
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009)....
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Nachdrucke und Genehmigungen
