Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in E. coli Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Summary

Wir beschreiben hier ein System, das einen ortsspezifischen, reversiblen in vivo Proteinblock verwendet, um Replikationsgabeln in Escherichia coli zu blockieren und zu kollabieren. Die Etablierung des Replikationsblocks wird durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert und die neutral-neutrale 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese wird zur Visualisierung von Replikationszwischenprodukten verwendet.

Abstract

Hindernisse, die auf DNA, einschließlich fest gebundene Proteine ​​und verschiedene Läsionen, kann das Fortschreiten der Zelle Replikationsmaschinerie stark hemmen. Das Abwürgen eines replisome kann aus dem Chromosom zu seiner Dissoziation führen, entweder teilweise oder vollständig, um den Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Die Erholung von diesem Zusammenbruch ist eine Notwendigkeit für die Zelle genau vollständige Chromosomen Vervielfältigung und anschließend unterteilen. Daher wird, wenn der Zusammenbruch auftritt, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt, die stattfinden, um die DNA Gabel und erlauben die Replikation wiederherzustellen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Zuvor wurden diese Replikationsreparaturwege in Bakterien unter Verwendung von UV-Schäden untersucht, was den Nachteil hat, nicht auf einen bekannten Ort lokalisiert ist. Dieses Manuskript beschreibt ein System mit einem Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS) unter Verwendung eines ortsspezifischen Protein Block zu erstellen, die ein Abwürgen und Zusammenbruch der Replikation induzieren kann foRKS in Escherichia coli. Protokolle Detail, wie der Status der Replikation kann in einzelnen lebenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Replikationszwischenprodukte dargestellt werden kann durch 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Temperaturempfindlichen Mutanten von replisome Komponenten (zB DnaBts) können in das System eingebaut werden , um einen synchronen Kollabieren der Replikationsgabeln zu induzieren. Ferner sind die Rollen der Rekombinationsproteine ​​und Helikasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, können unter Verwendung von genetischen Vorprägungen in diesem System untersucht werden.

Introduction

Während der DNA-Replikation, steht die replisome Hindernisse auf der DNA, die ihr Fortschreiten beeinträchtigen. DNA - Schäden , einschließlich Läsionen und Lücken sowie anomale Strukturen können die replisome , fortzusetzen ¹ zu verhindern. Vor kurzem wurde gefunden , dass an die DNA gebundenen Proteine ​​die häufigste Quelle für Hindernis sind ² fork Progression Replikation. Das Wissen über die Ereignisse im Anschluss an die Begegnung der replisome mit einem Nukleoprotein Block an einem bekannten Ort durch die Unfähigkeit beschränkt zu induzieren einen solchen Block in das Chromosom einer lebenden Zelle vorher. In - vitro - Analyse unser Verständnis der kinetischen Verhalten wurde verbessert einer aktiven replisome , wenn es eine Verstopfung Nukleoprotein ^3, sowie die mechanistischen Details der replisome selbst ^4,5 erfüllt. Das aktuelle Verständnis der Reparatur der Replikation wird in der Regel mit UV als schädigende Mittel vorgenommen und untersucht in vivo unter Verwendung von Plasmid - DNA ^6-8 . Während die Proteine ​​, die in der Reparatur von DNA beteiligt sein können , nachdem er eine in vivo - Nukleoprotein Block begegnet werden in der Regel aus diesen Studien verstanden, ob es Unterschiede in den molekularen Vorgänge innerhalb der Reparaturwege aufgrund der deutlichen Ursache in der Replikationsblock sind noch noch ist bestimmt werden.

Hier beschreiben wir ein System, das ein Nukleoprotein Block ermöglicht in einer bestimmten Stelle des Chromosoms hergestellt werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS). Wir verwenden einen Stamm von E. coli , das ein Array von 240 tetO - Stellen in das Chromosom eingebaut ⁹ hatte. Jede tetO - Stelle innerhalb des Arrays hat eine 10 bp Zufallssequenz flankieren sie die Stabilität der Anordnung zu erhöhen durch RecA-vermittelte Rekombination innerhalb des Arrays zu verhindern. Dieses Array, und Variationen davon, wurden ursprünglich verwendet , um E. verstehen coli Chromosom Dynamik ^10,11 aber wurden dann preve angepaßtnt in vivo - Replikation ^12. Das Array wurde gefunden, stabil aufrechterhalten werden und nahezu 100% der Replikationsgabeln zu blockieren , wenn sie von TetR ^10,12 gebunden. Die Verwendung des ähnlichen lacO Array in vitro hat , so wenig wie 22 gefunden Seiten ausreichend waren 90% der Replikation zu blockieren, obwohl dies kürzere Anordnung weniger effektiv war in vivo ^13. Um das Array anzupassen eine Nukleoprotein Blockade zu schaffen, muss das Repressor-Protein hoch werden unter optimierten Bedingungen überproduzierte wo es dann an das Array bindet eine Straßensperre zu schaffen. Die Bildung der Blockade, und seine anschließende Freisetzung können durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, wenn ein fluoreszierend markiert Variante des Tet-Repressor verwendet wird. Der Status der Replikation in jeder Zelle wird durch die Anzahl der Foci gesehen angedeutet, wo ein einzelner Brennpunkt bedeutet nur eine Kopie des Arrays innerhalb der Zelle vorhanden ist und mehrere Brennpunkte sind kennzeichnend für aktive Replikation. Diese aktive Wiederdung wird aktiviert, wenn das Nukleoprotein Blockierung durch die Zugabe des gratuitous Induktor umgekehrt wird, die die Bindungsaffinität von TetR für die Operatorstelle abnimmt ausreichend für die replisome durch das Array fortzufahren. Das Repressor-Protein ist noch in der Lage mit einer ausreichend hohen Affinität an die DNA zu binden, die nun mehrere Kopien der Array sichtbar gemacht werden kann.

Weitere komplizierten Details der Ereignisse können an der Nukleoprotein Blockade ^14-16 mit neutral-neutral zweidimensionalen Agarose - Gelelektrophorese und Southern - Hybridisierung werden entdeckt. Diese Techniken erlauben die Analyse von DNA-Strukturen in der Bevölkerung. Die Replikationszwischenprodukte, die während des Ereignisses gebildet sind und bleiben potentiell unrepaired können visualisiert werden. Durch Variation der Restriktionsenzym und die Sonde verwendet wird , können die Zwischenprodukte dargestellt werden , nicht nur in dem Feldbereich , sondern auch stromaufwärts des Arrays , wenn der Replikationsgabel ^17,18 zurückbildet. DasRegression nimmt an den replisome Dissoziation nachfolgenden platzieren; die führenden und hinken im Entstehen begriffenen Stränge getrennt von den Template-Stränge und Ausheilen miteinander, wie die Template-Stränge gleichzeitig erneut Glühen in einer DNA-Struktur Vier-Wege resultierende (a Holliday).

Unter Verwendung dieses Systems hat sich gezeigt , dass der Replikationsgabel nicht stabil ist , wenn es diesen Block ¹⁸ stößt. Darüber hinaus können Derivate von replisome Komponenten empfindlichen Temperatur Neuladen der Replikationsgabel zu verhindern, verwendet werden, wenn es zusammengebrochen ist. Sobald ein Block hergestellt wird, kann die Belastung auf eine nicht-permissive Temperatur verschoben werden, um ein synchrones Abschalten der replisome und eine kontrollierte Prävention Nachladen zu gewährleisten. Diese temperaturbedingten Deaktivierung gewährleistet alle der Gabeln in der Bevölkerung zu einer gegebenen Zeit zusammengebrochen sind und ermöglicht die Bewertung dessen, was geschieht, wenn der replisome kollabiert, wie die DNA verarbeitet wird, und dem, was erforderlich ist, um wiederden Prozess der DNA-Replikation starten.

Ein Vorteil der hier beschriebenen System ist, dass das Nukleoprotein Block vollständig reversibel ist; Daher wurde die Fähigkeit der Zellen aus dem Nukleoprotein Block wiederherzustellen der Lage ist, zu folgen. Die Zugabe von Anhydrotetrazyklin zu den Zellen wird die enge Bindung des Repressor entlasten, so dass eine Replikationsgabel zu gehen durch und die Lebensfähigkeit der Zellen wieder zu erlangen. Das Relief der Blockade kann durch neutrale neutralen zweidimensionalen Agarose-Gelelektrophorese nach 5 min, und durch Mikroskopie innerhalb von 10 min sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit Analyse die Fähigkeit des Stammes offenbaren aus der Replikations Blockade zu erholen und weiter zu vermehren.

Durch Veränderung des genetischen Hintergründe der in dem experimentellen Verfahren verwendeten Stämme hier beschrieben, können die Reparaturwege für diese Art von Blockierung erläutert.

Protocol

1. Sperrung Replikation mit FROS

1. Induzierung der Replikation Verstopfungs
   1. Verdünnen Sie eine frische über Nacht Kultur eines E. coli Stamm , der ein tetO - Array und PKM1 ¹⁸ bis OD _{600 nm} = 0,01 in einer verdünnten komplexen Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO ₄₎ mit Antibiotika Durchführung nach Bedarf zur Auswahl.
      Hinweis: Fügen Sie nicht Tetracyclin zur Auswahl, da es nicht mit diesem System kompatibel ist. Machen das Volumen der Kultur entsprechend 10 ml pro Probe erforderlich. Zum Beispiel ist das Kulturvolumen für die Versuchsplanung in 1 60 ml.
   2. Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln , bis die OD _{600 nm} = 0,05-0,1. Entfernen Sie eine 10-ml-Probe als nicht-induzierten Kontrolle zu dienen und mit 0,1% Arabinose zu der verbleibenden Kultur die Produktion von TetR-YFP von PKM1 zu induzieren. Weiter wachsen sowohl die nicht-induzierten und veranlaßteKulturen. Nach 1 Stunde überprüfen auf das Vorhandensein eines einzigen Brennpunkt innerhalb jeder Zelle der induzierten Kultur unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (siehe Abschnitt 2).
   3. Wenn die induzierten Zellen bestätigt blockiert sind (mehr als 70% der Zellen einen einzigen Fokus), notieren Sie die OD _600nm und nehmen Sie eine 7,5 ml Probe für die Analyse von 2-D - Gelen (siehe Abschnitt 3). Nehmen Sie eine äquivalente Probe von der nicht-induzierten Kontrollkultur.
2. Durch Loslassen der Replikation Verstopfungs
   1. Zum Lösen der Replikation Block, 100 ng ml ^-1 des unentgeltlichen Induktor Anhydrotetrazyklin (AT) zu einer 10 - ml - Probe der blockierten Zellen. Weiterhin bei 30 ° C für 10 min zu wachsen und Proben für die Zelldichte (1 ml), Mikroskopie-Analyse (10 ul) und neutral neutral 2-dimensional Agarose-Gelen (7,5 ml).
3. Induzierende Zusammenbruch der replisome
   1. Wenn die Zellen ein temperaturempfindliches Allel wie dnaB ts oder dnaC ts enthalten, erfordert deactivation, bewegen Sie den Kolben, die blockierten Zellen auf 42 ° C enthält. Proben für Analyse zu Zeitpunkten erforderlich (beispielsweise 1 Stunde nach Inkubation). Nachdem die Zellen bei 42 ° C für 1 Stunde inkubiert wurden, verschieben sich die Zellen auf 30 ° C für 10 min (siehe Abbildung 1).
      Anmerkung: Die Zellen können auf 30 ° C für restart Analyse verschoben werden.

Abb . 1: Übersicht über die FROS Replikation blockieren und Freigabe Experimentelles E. coli - Stämme , die tetO - Array tragen , werden bei 30 ° C gezüchtet. Wenn die Zellen eine OD _600nm von über 0,05 zu erreichen, wird TetR-YFP Produktion mit Arabinose induziert (ara; 0,1%). Weiter eine Subpopulation von nicht-induzierten Zellen wachsen zu lassen als Kontrollen bei 30 ° C zu handeln. 2 Stunden (siehe 2.1) - Eine Probe der induzierten Zellen wird nach 1 über Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wenn die Replikation istbestätigt blockiert werden, werden die Proben für die Reagenzgläser angezeigt 2-D-Gel-Analyse entnommen (siehe 3.1) und für Vitalitätstests (optional). Die Replikations Blockade kann mit Anhydrotetracyclin entfernt werden (AT; 0,1 & mgr; g / ml) und die Zellen 10 min später analysiert. Wenn Zellen ein temperaturempfindliches Allel (zB dnaB ts) tragen, kann dies durch Verschieben der blockierten Zellen auf 42 ° C für eine angemessene Analyse inaktiviert werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Fluoreszenzmikroskopie

1. Bereiten Sie eine Agarose-Pad durch Pipettieren von 500 ul geschmolzene Agarose (1% in Wasser) auf einen Objektträger; Overlay das Deckglas unmittelbar vor den Agarose verfestigt. Lagern Sie den Schieber (s) in feuchten Tüchern bei 4 ° C bis benötigt.
2. Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas aus dem Agarose-Pad und Pipette 10 ul BakterienKultur auf die Mitte des Kissens die Bewegung der Zellen während der Sichtbarmachung zu verhindern. Sobald die Probe (ca. 5 min) getrocknet ist, ersetzen Sie das Deckglas. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas und legen Sie die Folie unter der Optik.
3. Visualisieren Sie die Zellen unter Verwendung von Phase-Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung.
   1. Auf der Acquire Dialogfeld innerhalb der Imaging-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms. Nehmen Sie das Bild von Acquire auswählen. Sie nicht auf die Bühne zu bewegen. Im Dialogfenster Acquire, wählen Sie YFP als Beleuchtung für den Außen Shutter-Kamera verbunden ist. Stellen Sie die exporsure Zeit bis 1000 ms. Schalten Sie das Bühnenlicht. Nehmen Sie das Fluoreszenzbild von Acquire auswählen.
      Hinweis: Zeit kann je nach Lichtquelle, Mikroskop und verwendeten Kamera.
   2. Um die Phase und fluoreszierenden Bildern überlagern, wählen Sie Farbe aus dem Display-Menü zu kombinieren. Im Farb Kombinieren Dialogfeld wählen Sie das YFP Bild als grüne Komponente und dem Phasenbild als blue Komponente. Klicken Sie auf Farbe kombinieren. Bestimmen Sie, ob die Bevölkerung hatte die Replikation erfolgreich blockiert durch die Festlegung, ob die Mehrheit der Zellen pro Zelle ein Fokus haben.
      Anmerkung: Vergleich zu einer Probe von der Steuerung ohne Zusatz von Arabinose nützlich ist, um visuell den Unterschied in eYFP Produktion zu identifizieren.

3. DNA-Extraktion / Agarose-Stecker

1. Hinzufügen Natriumazid (Endkonzentration von 0,1%) zu den 7,5 ml Kulturproben aus den Schritten 1.1.3 und 1.2.1. Inkubieren auf Eis für mindestens 5 min.
   Hinweis: Natriumazid extrem giftig ist. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen 5000 × g für 10 min Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul Pett IV (PIV) -Puffer (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrozentrifuge (13 000 × g für 2 min) Zellen zu pelletieren. DiSCARD den Überstand. In diesem Stadium des Verfahrens die Pellets weiter oder bei -20 ° C.
3. Resuspendieren der Zellen mit der niedrigsten Zelldichte in 50 ul PIV und bei 50 ° C. Bei allen anderen Proben, die Volumina der PIV einzustellen, die endgültige Zelldichte die gleiche in jedem Röhrchen (zB Probe 1 (OD _600nm = 0.128) in 50 & mgr; l resuspendiert, Probe 2 (OD _{600 nm} = 0,138) resuspendiert in 54 & mgr; l).
   1. Fügen Sie ein gleiches Volumen von frisch hergestellten 0,8% igen Lösung in PIV (Endkonzentration 0,4%; , z. B. Probe 1 50 ul Probe 2 54 ul). Stellen Sie sicher, dass die Proben, Agarose und PIV über 50 ° C sind Erstarrung zu verhindern.
4. Behandeln eines Mikroskop-Objektträger mit 40 ul einer geeigneten Glas Wasser abweisend oder Silikonlösung. Reiben Sie die Folie mit einem Gewebe, bis es trocken ist.
   Hinweis: Dies kann im Voraus und die behandelten Folien gespeichert langfristig bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
5. Legen Sie 20 ul Tropfen ter Zelle / Agarosesuspension auf der Folie Stecker zu produzieren, die halbkugeligen sind.
   Hinweis: Die erste Probe (resuspendiert in 50 & mgr; l PIV) 5 Stecker auf einer Folie erzeugt.
6. Wenn die Pfropfen verfestigt haben, schieben sie sanft in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ml Zell-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,2% Natriumdesoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 100 ug ml ^{- 1} Lysozym, 50 ug ml ^{- 1} RNase A). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden.
7. Entfernen Sie die Zell - Lyse - Puffer und 1 ml EDTA / Sarkosyl / Proteinase K (ESP) -Lösung (0,5 M EDTA, 1% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 1 mg ml ^{- 1} Proteinase K). bei 50 ° C inkubieren sind über Nacht oder bis die Stecker transparent. Wenn eine zweite Inkubation über Nacht erforderlich ist, ersetzen Sie die ESP-Lösung mit frischem Puffer nach etwa 18 Stunden.
8. Entferne dasESP-Puffer und die Stecker 5 mal mit 12 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) waschen 30 min Äquilibrierung mit jeder Wäsche ermöglicht. Lagerung bei 4 ° C in 1 ml TE-Puffer.

4. Neutral-neutral 2-dimensionale Gelelektrophorese

1. Übertragen Sie eine Agarose-Stecker aus Schritt 3.8 in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 150 ul Restriktionsenzym-Puffer (1x Konzentration). 25-100 Einheiten Restriktionsenzym (beispielsweise 60 Einheiten EcoRV; (siehe 3A)). Digest bei 37 ° C für 6-8 Stunden.
2. Bei 4 ° C, gießen Sie ein 0,4% Agarose-Gel (300 ml) in 1x Tris / Borat / EDTA (TBE) in einen Gelträger von ca. 25 x 25 cm. etwa die gleiche Breite wie der Durchmesser des Steckers Setzen Sie einen Kamm Brunnen zu machen. Wenn das Gel gesetzt ist, nehmen Sie den Kamm und das Gel auf Raumtemperatur bewegen.
3. Schieben Sie eine der verdauten Agarose-Stecker in einen Brunnen, die Positionierung des Flachschiebers des Steckers gegen die Seite des Bohrlochs, wobei ter DNA wird in das Gel eintreten. Legen Sie einen einzelnen Stecker auf die gleiche Weise in jeder Sekunde gut.
4. Pipettieren geschmolzene 0,4% Agarose in die Vertiefungen der Stecker in Position zu versiegeln.
5. Last 1 kb DNA-Leiter in einem leeren gut, so dass wieder eine Lücke zwischen dem Leiter und Proben, und über Nacht laufen, das Gel (16 h, 55 V) in 1x TBE bei Raumtemperatur.
6. Beflecken das Gel in einem Wasserbad enthaltend Ethidiumbromid (0,3 & mgr; g ml ^-1) für 20 min.
   Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und ein Toxin betrachtet wird. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen.
7. Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator langwellige und schneiden Sie jede Spur Fragment mit einer geraden, auch geschnitten, die Aufnahme von überschüssigem Agarose auf beiden Seiten der Bahn zu minimieren.
   Hinweis: Wenn beispielsweise das Fragment von Interesse 5,5 kb ist, geschnitten, um ein 7,5 cm-Fragment der DNA-Fragmente von 5 kb, umfassen approximately 12 kb (siehe 3A).
8. Legen Sie die ausgeschnittenen Gel Spur in einem Gelträger 90 ° zur Richtung der DNA-Migration.
   Hinweis: Zwei Reihen von 3 Gelfragmenten in einem 25 x 25 cm ² Geltablett passen. Die erste Reihe von Gelspuren ist an der Spitze der Schale, die zweite Reihe bei 12,5 cm.
9. Bereiten Sie 300 ml Agarose für die zweite Dimension Gel (0,9% in 1x TBE mit 0,3 ug ml ^-1 Ethidiumbromid). Wenn der Agarose auf 50 ° C abgekühlt wird, das geschmolzene Agarose pipettieren um die Gelscheiben ihre Position zu verfestigen. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale bis zu einer Tiefe, die zumindest in Höhe der Gelschnitten ist.
10. Sobald das Gel erstarrt ist, Elektrophorese bei 4 ° C in TBE 1x , enthaltend 0,3 & mgr; g ml ^-1 Ethidiumbromid bei 220 V , bis die DNA etwa 10 cm gewandert ist.
    Hinweis: 4 Stunden für ein 5,5-kb-Fragment ausreichend ist, aber ein kleineres Fragment wird weniger Zeit benötigen.
11. Excise die Blöcke, wo die genomische DNA vorhanden ist usingen den Rand eines Metalllineal, einschließlich dem Gel darüber die DNA enthalten , die nicht sichtbar sind (siehe Abbildung 3c).

5. Southern-Hybridisierung

1. Herstellung der Lösung
   1. Bereiten Sie Depurinierung Puffer (0,125 M HCl-Lösung).
      Anmerkung: Dieser Puffer wieder verwendet werden kann und ist stabil bei Raumtemperatur für bis zu 1 Monat.
   2. Bereiten Sie Denaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
      Anmerkung: Denaturierungspuffer wiederverwendet werden kann, sobald und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur.
   3. Bereiten Neutralisationspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Passen Sie auf pH 7,5 mit HCl.
      Anmerkung: Neutralisationspuffer einmal wiederverwendet werden kann und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur.
   4. Bereiten 10x Saline Sodium Citrate (SSC) Puffer (0,15 M Tri-Natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH-Wert 7 - 8) für die Verwendung in den Schritten 5.2.4 und 5.2.6. Von diesem Puffer, einen 2 × SSC Lager machen (für den Einsatz in Schritt 5.2.9).
      Hinweis: 10x SSC und 2x SSC einwieder stabil bei RT für 3 Monate.
   5. Bereiten Modifizierte Church und Gilbert Hybridisierungspuffer ¹⁹ (0,5 M Phosphatpuffer [pH 7,2], 7% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Lassen bei 65 ° C gründlich vor auflösen zu verwenden.
2. Übertragung
   1. Spülen Sie die ausgeschnittenen Gelblöcken in Depurination Lösung für 10 min bei RT auf einer Wippe oder Orbitalschüttler. Halten Sie die Bewegungsgeschwindigkeit niedrig zu vermeiden, die Agarose-Blöcke zu beschädigen.
   2. Spülen Sie die Gelblöcken kurz mit destilliertem Wasser und dann mit einer Denaturierung Puffer für 30 min. Spülen Sie nochmals kurz in destilliertem Wasser und dann brüten die Gelblöcken in Neutralisierungspuffer für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
   3. Schneiden Sie eine Nylonmembran auf die genaue Größe des Gels (s). Schneiden Sie ein Nick in der oberen rechten Ecke bei der Ausrichtung der Membran in Zukunft Schritte zu unterstützen.
      Anmerkung: Zwei Gelblöcke (6 Proben) auf eine Membran sichtbar gemacht werden.
   4. Gießen Sie genug 10x SSC in eine tray, so daß sie nicht über Nacht trocknen. Eine Plattform ca. 5 cm über dem Niveau des Puffers. Sättigen 3 Blatt 3 MM-Chromatographie-Papier mit 10x SSC und Platz auf der Plattform. Schneiden Sie die Chromatographie Papier so, dass es lang genug ist, an beiden Enden und breit genug, um in Puffer eingetaucht werden, um die Membran Gel zu passen.
   5. Legen Sie das Gel (n) auf der Oberseite des gesättigten Chromatographie-Papier. Rahmen Sie das Gel mit Plastikfolie den Puffer unter Umgehung des Gels während der Übertragung zu verhindern. Vorsichtig legen die Schnitt Membran auf der Oberseite des Gels (s). Entfernen Sie Luftblasen zwischen der Membran und Gel durch eine Flasche oder serologische Pipette vorsichtig über die Membran rollen.
   6. Schneiden drei Blatt 3MM Chromatographiepapier auf die gleiche Größe wie die Membran. Tränken Sie die Chromatographie Papierblätter mit 10x SSC und legen auf der Oberseite der Membran. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich gebildet haben.
   7. Stapel Papiertücher mindestens 5 cm hoch oben auf dem Löschpapier, gefolgt von einem festen Träger (approximate Gewicht von 1 kg für einen 23 x 16 cm-Membran). Lassen Sie den Transfer über Nacht ablaufen.
   8. Belichten der Membran (DNA Seite nach oben) zu 1,200 J / m ² UV die DNA an der Membran zu vernetzen. Sie nicht zu diesem Schritt vor spülen.
   9. Spülen Sie die Membran gründlich in 2 × SSC zu hohen Hintergrund auf dem Blot Bilder verhindern. Verwenden Sie den Fleck sofort für die Hybridisierung (siehe 5.3) oder bei RT trocknen, wickeln Sie in der Plastikverpackung und lagern bei 4 ° C.
3. Hybridisation
   1. Vorheiz Hybridisierungsofen und Flaschen auf 55 ° C.
   2. Füge 100 & mgr; g ml ^-1 Rinderserumalbumin (BSA) und 10 & mgr; g ml ^-1 unspezifische DNA (beispielsweise Lachssperma - DNA) mit dem vorgewärmten Hybridisierungspuffer.
   3. Um eine gleichmäßige Abdeckung des Hybridisierungspuffers ermöglichen, wenn die Membran aufgerollt wird, legen Sie den Fleck auf einen ähnlich großen Quadrat aus Nylon mit der DNA-gebundenen Seite der Membran Netz nach oben zeigt. Rollen Sie den Fleck entlang seiner langen Kante. Gleitender Blot / innen einer Hybridisierungsflasche ineinander greifen. Füge eine geeignete Menge vorgewärmten Hybridisierungspuffer des Blots (zB 30 ml für ein 23 x 16 cm ² Membran) zu entrollen.
   4. Inkubieren in einem vorgeheizten Ofen, um die Flaschen zu drehen, für 1 Stunde.
   5. Bereiten Sie die Sonde durch 50 ng gereinigte PCR - Produkt homolog zu der Region von Interesse Mischen, 150 ng von zufälligen Hexamer - Primern, Puffer für Klenow - Fragment und H ₂ O mit einem Volumen von 13 & mgr; l zu machen. Kochen für 3 Minuten dann sofort auf Eis legen. 1 ul 1 mM dCTP / dGTP / dTTP - Mix, 1 ul Klenow - Fragment (5U) und 50 uCi Desoxyadenosin - 5'-triphosphat radiomarkierten am alpha phosphat- (α ³² P-dATP).
   6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 1 ul 1 mM dNTP mischen und 1 ul Klenow-Fragment. Inkubiere 20 min bei RT.
   7. Boil-Sonde für 5 Minuten und fügen Sie sofort auf Hybridisierungsröhrchen. Hybridisierung über Nacht bei 55 ° C, mit einer Drehung.
   8. Umfüllen probe von Membran.
      Anmerkung: Die Sonde der Lage ist, einmal wiederverwendet zu werden.
   9. Spülen Sie die Membran kurz in vorgewärmten, niedriger Stringenz-Waschpuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). In frischen niedriger Stringenz-Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. Wiederholen.
   10. Zweimal waschen in mittlerer Stringenz-Waschpuffer (1x SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 10 min bei 55 ° C mit Rotation.
   11. Zweimal waschen in hoher Stringenz-Waschpuffer (0,1X SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 5 min bei 55 ° C mit Rotation.
   12. Entfernen Sie die Membran und tupfen mit Gewebe überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wickeln in Plastikfolie sicherzustellen gibt es keine verbleibende Feuchtigkeit auf der Plastikfolie und in Belichtungskassette mit einer vorgeblendeten Speicherleuchtstofffolie. Schließen Sie die Kassette und setzen mindestens 2 Stunden vor der Visualisierung für eine Phosphor-Imager verwendet wird.

Results

Die FROS ein induzierbarer, ortsspezifische Nukleoprotein Block, der Replikationszwischenprodukte ermöglicht ^12,18 in lebenden Zellen visualisiert werden. Eine allgemeine experimentelle Design für Zellen Abtasten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitpunkt der Probenahme und Variationen in der genetischen Hintergrund dieses machen ein vielseitiges System für die Reparatur eines solchen Blocks zu studieren. Die schematische veranschaulicht , wie temperaturemp...

Discussion

Während der Chromosomenduplikation stößt die Replikationsmaschinerie auf verschiedene Hindernisse, die ihren Fortschritt verhindern. Um sicherzustellen, dass das gesamte Single-Origin-Chromosom repliziert wird, haben Bakterien zahlreiche Wege zur Reparatur der DNA, die es dann ermöglicht, das Replisom neu zu laden^20,21. Läsionen, einzelsträngige Brüche, doppelsträngige Brüche und Proteine, die eng an die DNA gebunden sind, können jeweils über einen speziellen Weg behandelt werden, obwohl es wahrscheinlich zu e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypton	Sigma-Aldrich	16922	Komponente von Wachstumsmedien
Natriumchlorid	VWR	27810.364	Komponente von Wachstumsmedien
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	92144	Komponente von Wachstumsmedien
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P9791	Komponente von Wachstumsmedien; Kaliumpufferkomponente
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	P3786	Komponente des Wachstumsmediums; Kaliumpufferkomponente
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	Zur Induktion der TetR-YFP-Produktion
Anhydrotetracyclinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	37919	Freisetzung des Replikationsblocks
Axioskop 2 Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	452310	Visualisierung von Zellen
eYFP Filterset	Chroma Technology	41028	Visualisierung der YFP
CCD-Kamera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualisierung der Zellen
MetaMorph  Software (Molekulare Bauelemente)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0, die bei der Erstellung dieses Manuskripts verwendet wurde
Agarose	Bioline	BIO-41025	Für Agarose-Plugs und Gelelektrophorese
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Für die Herstellung von Agarose-Plugs
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE-Pufferkomponente
Ethylendiamintetraessigsäure	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M EDTA Dinatriumsalzlösung, eingestellt auf pH 8,0 mit NaOH.
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Bakteriostatikum
Salzsäure	Sigma-Aldrich	258148	TE-Pufferkomponente
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750	Zelllysepufferkomponente
N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Zelllyse- und ESP-Pufferkomponente
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Zelllyse-Pufferkomponente
Lysozym	Amresco	6300	Zelllyse-Pufferkomponente
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP-Pufferkomponente
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Elektrophorese-System
UV-Transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualisierung der DNA
Ethidiumbromid	BioRad	1610433	Visualisierung von DNA
Borsäure	VWR	PROL20185.360	FSME-Komponente
Hybond-XL Nylon Memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) kann auch verwendet werden
3MM Whatman Chromatographiepapier	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern Blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Vernetzung von DNA und Hybridisierung
Desoxyribonukleinsäure aus Lachsspermien	Sigma-Aldrich	31149	Hybridisierungspufferkomponente
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturierungspufferkomponente
Trinatriumcitratdihydrat	VWR	PROL27833.363	Transferpuffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Amresco	227	Waschpufferkomponente
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridisierungspufferkomponente
Random Hexamer Primer	Bioline	BIO-38028
Klenow-Fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosin 5'-triphosphat-< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E Mehrzweck-Standard 35 cm x 43 cm Screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualisierung der Blot-Hybridisierungsflasche
	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm