mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.
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Methodenartikel
Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Natürliche Evolution beinhaltet genetische Vielfalt wie Umweltveränderungen und eine Selektion zwischen kleinen Populationen. Adaptive Laborevolution (ALE) bezieht sich auf die experimentelle Situation, in der die Evolution mit lebenden Organismen unter kontrollierten Bedingungen und Stressoren beobachtet wird; Organismen werden dadurch künstlich zu evolutionären Veränderungen gezwungen. Mikroorganismen sind in der Umwelt einer Vielzahl von Stressoren ausgesetzt und in der Lage, bestimmte stressinduzierbare Proteine zu regulieren, um ihre Überlebenschancen zu erhöhen. Natürlich vorkommende spontane Mutationen führen zu Veränderungen im Genom eines Mikroorganismus, die seine Überlebenschancen beeinträchtigen. Eine langfristige Exposition gegenüber der Chemostat-Kultur provoziert eine Anhäufung spontaner Mutationen und macht den anpassungsfähigsten Stamm dominant. Im Vergleich zu den Methoden des Kolonietransfers und des seriellen Transfers weist die Chemostat-Kultur die höchste Anzahl von Zellteilungen und damit die höchste Anzahl verschiedener Populationen auf. Obwohl die Chemostat-Kultur für ALE kompliziertere Kulturgeräte erfordert, ist sie zu Beginn des Vorgangs weniger arbeitsintensiv. Vergleichende genomische und transkriptomische Analysen des angepassten Stammes liefern evolutionäre Hinweise darauf, wie die Stressoren zu Mutationen beitragen, die den Stress überwinden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, eine beschleunigte Evolution von Mikroorganismen unter kontrollierten Laborbedingungen herbeizuführen.
Einleitung
Mikroorganismen können auf unterschiedliche Umgebungen überleben und sich anzupassen. Unter starkem Stress, Anpassung kann 1-3 über Erwerb von positiven Phänotypen durch statistische genomische Mutationen und anschließende positive Selektion auftreten. Daher kann mikrobiellen Zellen anzupassen durch metabolische oder regulatorische Netzwerke für ein optimales Wachstum zu ändern, die "adaptive Evolution" bezeichnet wird. Vor kurzem sind wichtige mikrobielle Tendenzen, wie Ausbrüche von Superbugs und dem Auftreten von robusten mikrobielle Stämme, sind sehr eng miteinander verbunden Evolution unter Stressbedingungen zu adaptiv. Unter definierten Laborbedingun....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Ausrüstung
- Besorgen Sie sich ein Chemostat Glas (150-250 ml) oder einem Erlenmeyerkolben (250 ml) mit einer Einlassöffnung und eine Austrittsöffnung enthält. Verbinden Sie die Anschlüsse mit Silikonschlauch so dass für Flussraten von 10 bis 100 ml / h. Optional kann ein Entlüftungsventil, eine Luftaustrittsöffnung, und temperiertes Wasser Einlass- und Auslasskanäle verwenden.
- Besorgen Sie sich eine Vorrichtung, die geeignet für die chemostat Glas, die für das Rühren und Temperaturkontrolle bietet (oder einen Dreh Schüttelinkubator verwenden).
- Erhalten zwei peristaltische Pumpen, um frisches Medium zu liefern u....
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Ergebnisse
Für High-Succinat Stress Anpassung, die Wildtyp - E coli - W3110 - Stamm war in einem Chemostat bei D kultiviert = 0,1 h -1 für 270 Tage (Abbildung 2).
Abbildung 2: High-Succinat Stress Anpassung von E. coli W3110 unter Verwendung Chemostat - Kultur. Dünne Pfeile zeigen die Zeiten , bei denen die Konzentration .......
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Diskussion
Mikroorganismen sind in der Lage aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und der genetischen Vielfalt zu fast allen Umgebungen anzupassen. Adaptive Laborentwicklung ermöglicht Mikroorganismen unter Bedingungen entwickelt, zu entwickeln, die eine Möglichkeit der Auswahl der einzelnen Organismen beherbergt spontane Mutationen bereit, die unter den gegebenen Bedingungen von Vorteil sind.
Die chemostat Technik ist robuster für den folgenden Gründen künstlich angetrieben Evolution als Übertragungs.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde finanziell unterstützt vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim wurde durch ein Stipendium der Katholischen Universität von Korea (2015) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mini-Chemostat-Fermenter | Biotron Inc. | - | hergestellt auf Sonderbestellung |
| Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | Schlauchgröße kann je nach Verdünnungsrate und Größe des Fermenterbehälters variiert werden. | |
| Behälter | Bellco | Media Vorratsflasche | 20 L |
| Chemikalien | Sigma-Aldrich-Reagenz | ||
| Glukose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS Reagenz |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | für die Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur, ≥ 99,5% |
| NaCl Sigma-Aldrich | 746398 | ACS-Reagenz, ≥ 99 | |
| %Na2HPO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98,5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS-Reagenz, ≥ 99% |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS-Reagenz, ≥ 98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS-Reagenz, ≥ 96% |
| Thiamin & Middot; HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | Reagenzqualität, ≥ 99% |
| Na2· Succinat & Middot; 6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥ 99% |
Referenzen
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
