Methodenartikel

Multimodale Quantitative Phase Imaging mit digitalen holografischen Mikroskopie Beurteilt Exakt Darmentzündung und Epithelial Wundheilung

DOI:

10.3791/54460

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13. September 2016

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1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine genaue Bewertung der entzündungshemmenden Wirkung ist von größter Bedeutung für die Bewertung potenzieller neuer Medikamente zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen. Die digitale holographische Mikroskopie ermöglicht die Beurteilung von Entzündungen in murinen und menschlichen Dickdarmgewebeproben sowie die automatisierte multimodale Bewertung der epithelialen Wundheilung in vitro.

Zusammenfassung

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Die Inzidenz von entzündlicher Darmerkrankung, dh, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Die Ätiologie von IBD unbekannt bleibt und aktuelle Therapiestrategien sind auf der unspezifischen Unterdrückung des Immunsystems beruhen. Die Entwicklung von Behandlungen, die speziell Darmentzündung und epitheliale Wundheilung Ziel deutlich Management von CED verbessern könnte, dies erfordert jedoch eine genaue Erfassung von entzündlichen Veränderungen. Derzeit werden Wirkstoffkandidaten in der Regel unter Verwendung von Tiermodellen in vivo ausgewertet oder mit Zellkultur - Techniken in vitro. Die histologische Untersuchung erfordert in der Regel die Zellen oder Gewebe von Interesse gefärbt werden, was die Probeneigenschaften verändern können und darüber hinaus die Interpretation der Ergebnisse kann durch Ermittler Expertise variieren. Digitale holografische Mikroskopie (DHM), basierend auf der Erfassung der optischen Weglänge Verzögerung ermöglichtfleckenfreie quantitative Phasenkontrast-Bildgebung. Dadurch können die Ergebnisse direkt mit absolute biophysikalischen Parametern korreliert. Wir zeigen, wie Messung von Veränderungen in der Gewebedichte mit DHM, bezogen auf Brechungsindex-Messung kann entzündlichen Veränderungen zu quantifizieren, ohne Färbung, in verschiedenen Schichten von Kolon-Gewebeproben von Mäusen und Menschen mit Colitis. Darüber hinaus zeigen wir eine kontinuierliche multimodalen markierungsfreie Überwachung von epithelialen Wundheilung in vitro möglich DHM durch die einfache automatische Bestimmung des verwundeten Bereich und gleichzeitige Bestimmung der morphologischen Parameter wie Trockenmasse und Schichtdicke von wandernden Zellen verwendet wird . Abschließend stellt DHM einen wertvollen, neuen und quantitative Werkzeug für die Beurteilung der Darmentzündung mit absoluten Werten für Parameter möglich, vereinfachte Quantifizierung von epithelialen Wundheilung in vitro und damit hohe Potential für eine Translationsdiagnose u hatse.

Einleitung

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Entzündlicher Darmerkrankung (IBD), dh, ulzerative Kolitis (UC) und Morbus Crohn (CD) sind idiopathische entzündliche Erkrankungen des Magen - Darm - Trakt 1. Forschung in die darunter liegende Pathophysiologie von IBD und der Bewertung potentieller neuer Medikamente oder neuartige diagnostische Ansätze ist besonders von Bedeutung. Sowohl in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung von IBD - Patienten hat sich die Darmschleimhaut ein Fokus der Aufmerksamkeit 2,3 geworden. Die Schleimhaut stellt eine anatomische Grenze, an der die Wechselwirkung zwischen kommensalen Bakterien, Epithelzellen und verschiedenen zellulären Kompo....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden von der regionalen Ethikkommission (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Deutschland) nach deutschem Tierschutzgesetz genehmigt. Die Ethikkommission der Universität Münster genehmigt die Verwendung von menschlichen Geweben für histologische und Mikroskop-Analyse.

1. Tiere und Materialien

  1. Verwenden weibliche oder männliche Mäuse des erforderlichen DSS-empfindlichen Stamm, der 20 bis 25 g wiegen, und Haus nach den örtlichen Tierpflegegesetzgebung. Bieten Sie spezielle Futter für Nager und autoklaviert Wasser ad libitum trinken.
  2. Akute Kolitis induzieren DSS ....

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Ergebnisse

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Typisches Setup für DHM Imaging für digitale holografische Mikroskopie (DHM)

Zur Durchführung Hellfeld - Bildgebung und quantitative DHM Phasenkontrast - Bildgebung angewendet wir ein inverses Mikroskop wie in Abbildung 1 B dargestellt. Das System wurde modifiziert , indem ein Modul DHM Anbringen, wie bereits 25 beschrieben. YAG - Laser λ = 532 nm) .......

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Diskussion

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Wir zeigen , dass DHM genaue Beurteilung der histologischen Schäden in murinen Colitis - Modellen und menschlichen Kolon - Gewebeproben ex vivo zur Verfügung stellt. Darüber hinaus haben wir DHM kontinuierlich epithelialen überwachen heilenden Wunde gezeigt , während gleichzeitig multimodale Informationen zu zellulären Veränderungen bereitstellt. In DHM, ist die Rekonstruktion von digital aufgenommenen Hologrammen numerisch 32 durchgeführt. Daher kann im Vergleich zu Hellfeldmikroskopie, Zer.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Faekah Gohar für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken Sonja Dufentester und Elke Weber für die fachkundige Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagents
Azoxymethan (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandA5486
ZellkulturflascheGreiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextransulfat-Natrium (DSS)TdB Konsulat, Uppsala, SchwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - ÖsterreichE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandSPR3196
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgien352070
Isopentan (2-Methylbutan)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandM32631-1L
MethylenblauMerck, Darmstadt, Deutschland1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandM4287
ObjektträgerG. Menzel, Braunschweig, DeutschlandJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek Mischung                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Niederlande4583
Pen/Strepto/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgien1558
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBSLonza, Verviers, Belgien4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgien3626
Natriumchlorid 0,9%Braun, Melsungen, Deutschland5/12211095/0411
StandarddiätAltromin, Lage, Deutschland1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Niederlande4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgien7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Deutschland04-0002 
  µ-Schale 35 mm mit Kultureinsatz, highibidi GmbH, München, Deutschland81176
DIC Deckel für µ-Schalen, mit Glaseinsatzibidi GmbH, München, Deutschland80050<
strong>Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digitales holographisches Mikroskop
>Model<strong>Company
Inverses MikroskopiMICTill Photonics, Gräfelfing, Deutschland
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Lübeck, Deutschland
MikroskopobjektivZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Göttingen, Deutschland
CCD-KameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Deutschland

Referenzen

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  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis i....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Messung des BrechungsindexGewebedichteanalysefarbstofffreie BildgebungZellkulturmonitoringColitis MausmodellCaco 2 Zellen

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