"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

Zusammenfassung

Phagozytose ist ein Mechanismus, der von spezialisierten Zellen verwendet wird, um Mikroorganismen oder Zelltrümmer zu internalisieren und zu eliminieren. Es beruht auf tiefgreifenden Umlagerungen des Aktin-Zytoskeletts, das die treibende Kraft für die Ausdehnung der Plasmamembran um das Partikel ist. Darüber hinaus beruht die effiziente Verschlingung von großem Material auf der fokalen Exozytose intrazellulärer Kompartimente. Dieser Prozess ist hochdynamisch und es wurde beschrieben, dass zahlreiche molekulare Akteure eine Rolle bei der Bildung phagozytärer Becher spielen. Die genaue zeitliche und räumliche Regulation all dieser Moleküle ist jedoch noch schwer fassbar. Darüber hinaus war der letzte Schritt des Phagosomenverschlusses sehr schwer zu beobachten, da die Hemmung durch RNA-Interferenz oder dominante negative Mutanten oft zu einer verzögerten phagozytären Becherbildung führt.

Wir haben einen speziellen experimentellen Ansatz mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) in Kombination mit Epifluoreszenz entwickelt, um Schritt für Schritt die Ausdehnung von Pseudopoden und ihren Spitzen in einem Phagosom zu überwachen, das um ein Partikel herum wächst, das lose an ein Deckglas gebunden ist. Diese Methode ermöglicht es uns, mit hoher Auflösung die Spitzen der Pseudopoden und ihre Fusion während des Verschlusses des Phagosoms in lebenden Zellen für zwei verschiedene fluoreszenzmarkierte Proteine gleichzeitig zu beobachten.

Einleitung

Phagozytose ist eine wichtige Zellfunktionen, die mit der Erkennungs beginnt und die Bindung von Material an Oberflächenrezeptoren, die dann führt zur Internalisierung und Degradation des aufgenommenen Materials. Während einzelliger Eukaryonten, wie die Form Dictyostelium discoideum und Amöben für Fütterung auf Bakterien Phagozytose verwenden, haben höhere Organismen mit professionellen Zellen entwickelt. Makrophagen oder dendritischen Zellen sind die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger in verschiedenen Geweben und Organen und sind entscheidend für die adaptive Immunsystem durch Antigenpräsentation und Zytokin - Produktion ^1-4 zu akti....

Protokoll

Hinweis: Das verwendete Plasmid LifeAct-mCherry ist ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach ^17.

1. Zellen und Transfektion

Anmerkung: RAW264.7 Makrophagen sind sub Konfluenz in komplettem Medium gezüchtet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10% FCS ( Kalbsfetusserum)) in einer 100-mm-Platte. Sie werden mit Plasmiden transfiziert durch Elektroporation fluoreszent markierte Proteine ​​kodieren. Routinemßig etwa 5 - 6 x 10 ⁶ Zellen mit 20 ug oder 10 ug Plasmid für jede Transfektion od....

Ergebnisse

Das experimentelle System in diesem Manuskript beschrieben ist, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Transfizierte RAW264.7 Makrophagen , die Proteine ​​von Interesse zu einem fluoreszierenden Tag fusioniert exprimiert in Kontakt gebracht werden mit IgG-opsonisiertes roten Schafsblutzellen (SRBCs) , die waren nicht-kovalent fixierten auf dem Deckglas. Die Makrophagen können die SRBC aus dem Deckglas lösen sie zu verschlingen. Das Mikroskop verwendet TIRF ermöglich.......

Diskussion

Das hier beschriebene experimentelle Protokoll schlägt eine beispiellose Methode vor, um in Echtzeit und in lebenden Zellen mit hoher Auflösung die Bildung eines Phagosoms und insbesondere dessen Verschluss zu verfolgen. Es müssen mehrere technische Aspekte erörtert werden. Erstens ist der Assay sehr temperaturempfindlich. Es ist sehr wichtig zu überprüfen, ob die Heizkammer eine Temperatur von 37 °C hat und dass alle Medien, Geräte oder Zellen in der Kammer aufbewahrt werden, um Temperaturschwankungen zu vermeiden, die .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rote Blutkörperchen gegen Schafe IgG	MP Biomedicals	55806
Rinderserum Albumin Hitzeschockfraktion, pH 7, ≥ 98%	Sigma	A7906
Zellheber	Corning	3008
Küvetten 4 mm	Zellprojekt	EP104
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-094
Raumtemperatur Elektropuffer-Kit	Zellprojekt	EB110
100 mm TC-behandelte Zellkulturschale	Corning	353003
Gene X-cell pulser	Biorad	165-2661
Gentamicin Lösung	Sigma	G1397
Glasbodenschalen 35 mm unbeschichtet 1,5	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C Case
iMIC	TILL Photonics		Öl-Immersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), Heizkammer mit CO2, eine Kamera Einzelphotonendetektion EMCCD (Electron Multiplikation Charge Coupled Device) und eine 1,5-fache
Poly-L-Lysin-Lösung 0,1 %	Sigma	P8920-100 ml	Verdünnung bei 0,01 % in Wasser
RPMI 1640 mittel GLUTAMAX  Ergänzung	Life technologies	61870-010
RPMI 1640 medium, kein Phenolrot (10 x 500 ml)	Life technologies	11835-105	Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch
Rote Blutkörperchen (SRBCs) von SchafenEurobio		DSGMTN00-0Q	Konserviert in Alsever Puffer bei 4 μde; C vor dem Gebrauch