"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Phagosomenbildung sowie die genaue Stelle des Phagosomenschismas in lebenden Makrophagen in 3D mit Hilfe der Total Internal Reflection Florescence oder TIRF-Mikroskopie zu visualisieren. Diese Methode kombiniert TIRF-Mikroskopie mit Epifluoreszenz, um die schrittweise Lokalisierung von zwei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen während der Pseudopodenverlängerung und Spitzenfusion zu überwachen. Die Technik bietet eine systematische Methode, um den kritischen Winkel zu bestimmen und ein TIRF-Signal zu erhalten, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf die Nähe der Plasmamembran zu ziehen.

Schalten Sie am Tag vor der TIRF-Mikroskopsitzung die Heizkammer auf 37 Grad Celsius ein, um eine homogene Erwärmung des Mikroskoptisches zu ermöglichen. Am nächsten Morgen mit 100 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 0,1 % BSA, um 7x10 bis zum 6. Schaf rote Blutkörperchen oder SRBCs pro 35-Millimeter-Glasbodenschale zweimal zu waschen. Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Kaninchen-IGG-Anti-SRBCs in einer subagglutinierenden Konzentration in PBS, ergänzt mit 0,1 % BSA pro 5 Mikroliter Zellen, und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit langsamer Rotation.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die SRBCs zweimal in PBS plus BSA und resuspendieren Sie die Zellen in 2 Millilitern serumfreiem Mikroskopiemedium mit 37 Grad Celsius pro Schale. Behandeln Sie dann 35-Millimeter-Schalen mit Glasboden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 Millilitern 0,1 %-Poly-L-Lysin, gefolgt von zwei Spülgängen mit 2 Millilitern PBS. Für die nicht-kovalente Fixierung der SRBCs werden je 2 Milliliter der IGG-opsonisierten Zellen in die Polylysin-beschichteten Schalen gegossen und die Proben in einer Schwingrotorzentrifuge zentrifugiert.

Entsorgen Sie die Überstände und waschen Sie die Partikel einmal mit 2 Millilitern PBS plus 10 % BSA. Inkubieren Sie die Partikel dann mit 2 Millitern frischem PBS plus 10 % BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Wäschen mit 2 Millilitern PBS. Ersetzen Sie das PBS nach der letzten Wäsche durch 2 Milliliter serumfreies Mikroskopiemedium mit 37 Grad Celsius.

Stellen Sie eine SRBC-beschichtete Schale auf den Mikroskoptisch. Kratzen Sie dann die transfizierten Zellen von Interesse vom Boden der Kulturschale ab und pipettieren Sie die Zellen einige Male, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Geben Sie die transfizierten Zellen in die SRBC-beschichtete Schale.

Starten Sie die Live-Erfassungssoftware. Finde eine Zelle, die die fluoreszenzmarkierten Proteine exprimiert, und passe die Position der Schale so an, dass sich eine Zelle von Interesse in der Mitte des Feldes befindet. Erfassen Sie 500 Bilder in verschiedenen Winkeln von null bis 5 % in Schritten von 0,01 Grad, bei einer Anregungswellenlänge.

Um den kritischen Winkel zu bestimmen, bei dem das einfallende Licht an der Grenzfläche zwischen Glas und Medium vollständig reflektiert wird und eine evaneszente Welle erzeugt, öffnen Sie die Bildsequenz in der entsprechenden Bildgebungssoftware. Wählen Sie einen interessierenden Bereich in der Zelle mit gleichmäßiger Fluoreszenz aus. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bild die Option Stapel und Z-Achsen-Profil plotten.

Um das Profil der z-Achse darzustellen, wird die mittlere Fluoreszenzintensität, die im interessierenden Bereich gemessen wird, mit der Funktion der Winkel auf der x-Achse dargestellt. Jeder Winkelwert auf der x-Achse, der über dem kritischen Winkel liegt, kann dann während der Mikroskopiesitzung verwendet werden, um ein TIRF-Signal zu erhalten. Verwenden Sie als Nächstes in der Live-Erfassungssoftware den Protokolleditor, um die Parameter der Erfassung einzustellen.

Einschließlich der Anzahl der Loop-Erfassungssequenzen, der Fluoreszenzkanäle und ihrer Laserintensität, des TIRF-Winkels und der Belichtungszeit. Stellen Sie die Z-Verschiebung des Objektivs so ein, dass die Epifluoreszenzmodenebene erreicht wird. Stellen Sie dann im Epifluoreszenzmodus den TIRF-Winkel auf 1 ein und verschieben Sie das Objektiv mit Z zurück in die TIRF-Ebene.

Nehmen Sie dann ein Bild der Zelle im LED-Modus mit hellem Licht auf. Finden Sie nun eine Zelle von Interesse mit einer moderaten Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen, die an der Phagozytose mit einem SRBC beteiligt ist, und verschieben Sie die Zelle in die Mitte des Feldes. Beachten Sie, dass eine solche Zelle durch eine ausgedehnte Plasmamembran um das Partikel herum identifiziert werden kann.

Geben Sie die Anzahl der Frames auf der Registerkarte "Loop-Anzahl" ein, um eine Streaming-Erfassung von 500 bis 1.000 Frames zu starten. Ändern Sie bei Bedarf die Laserintensität und die Belichtungszeit, um sie an die unterschiedlichen Fluoreszenzniveaus in der Zelle anzupassen. Um zwei separate Bildsequenzen zu erzeugen, die den beiden Kanälen entsprechen, öffnen Sie die Sequenzen in der imagine-Software und klicken Sie auf den Reiter Bild.

Wählen Sie im Menü Hyperstacks die Option Stack to Hyperstack aus. Geben Sie dann im Popup-Fenster xyctz für die Reihenfolge, die Anzahl der für die Kanäle verwendeten Fluorochrome, die Anzahl der Slices auf der z-Achse, die Anzahl der Bilder geteilt durch die Anzahl der Kanäle unter Frames und Graustufen für den Anzeigemodus ein. Teilen Sie dann die Kanäle auf.

Hier wird ein repräsentativer Lebendzell-TIRF-Mikroskopiefilm eines Phagosomenverschluss-Assays in rohen 264,7-Makrophagen gezeigt, die einen IGG-opsonisierten SRBC verschlingen. Da die Spitzen der Pseudopoden, die dem Glas gegenüberliegen, um den SRBC gleiten, wird im TIRF-Bereich ein F-Aktin-Ring nachgewiesen, der sich allmählich verengt, bis er sich schließt. Parallel dazu entspricht das verschwommene F-Aktin-Signal, das von der Epifluroeszenz nach Verschiebung des Stadiums um drei Mikrometer über dem TIRF-Bereich depolymerisiert wird, einer Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Bechers.

Nach drei Minuten ist der SRBC vollständig internalisiert, was durch Durchlichtbildgebung bestätigt wird. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann nachgewiesen werden, dass das Aktin an der Basis des phagozytären Bechers, wo die fokale Exozytose der intrazellulären Kompartimente stattfindet, stattfindet. Nach der Gewinnung kann eine Zelle für die korrelative Elektronenmikroskopie weiterbearbeitet werden, oder die gesamte Zellpopulation kann fixiert und für die klassische Immunfluoreszenzmikroskopie eingefroren werden.

Es ist wichtig zu bedenken, dass die Phagozytose sehr temperaturempfindlich ist und daher die Temperatur in der Heizkammer und im Nährschalenmedium während des gesamten Eingriffs auf einer konstanten Temperatur von 37 Grad Celsius gehalten werden sollte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Partikel opsonisiert, Deckgläser mit den Partikeln bedeckt, die kritischen Winkel für die TIRF-Mikroskopie bestimmt und die Lokalisierung von Proteinen von Interesse während der Phagozytose lebender Zellen abbildet.