"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Phagosomebildung sowie die genaue Stelle der Phagosome-Spaltung in 3D in lebenden Makrophagen mittels Totaler Interner Reflexionsfluoreszenz, oder TIRF-Mikroskopie, sichtbar zu machen. Diese Methode kombiniert die TIRF-Mikroskopie mit Epifluoreszenz, um die schrittweise Lokalisation von zwei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen während der Pseudopodienausstülpung und -spitzenfusion zu verfolgen. Die Technik bietet eine systematische Methode, um den kritischen Winkel zu bestimmen und ein TIRF-Signal zu erhalten, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf Vorgänge nahe der Plasmamembran zu ziehen.

Am Tag vor der TIRF-Mikroskopie-Sitzung die Heizkammer auf 37 Grad Celsius einschalten, um eine homogene Erwärmung der Mikroskopierbühne zu ermöglichen. Am nächsten Morgen 7 × 10⁶ Schafs-rote Blutkörperchen (SRBCs) pro 35-Millimeter-Dish mit Glasboden zweimal mit jeweils 100 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 0,1 % BSA, waschen. Nach der zweiten Zentrifugation die Zellen in 500 Mikrolitern Kaninchen-IgG anti-SRBCs in PBS mit 0,1 % BSA bei einer subagglutinierenden Konzentration pro 5 Mikroliter Zellen resuspendieren und 30 Minuten unter langsamer Rotation inkubieren.

Am Ende der Inkubation die SRBCs zwei Mal in PBS mit BSA waschen und die Zellen in 2 Milliliter mikroskopiegeeignetem Medium ohne Serum pro Platte bei 37 Grad Celsius resuspendieren. Anschließend 35-Millimeter-Glasbodenplatten mit 2 Milliliter 0,1 % Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandeln, gefolgt von zwei Waschschritten mit jeweils 2 Milliliter PBS. Zur nicht-kovalenten Fixierung der SRBCs 2 Milliliter der mit IGG opsonisierten Zellen in jede polylysinbeschichtete Platte geben und die Proben in einem Schwenkrotor-Zentrifugenröhrchen zentrifugieren.

Entfernen Sie die Überstände und waschen Sie die Partikel einmal mit 2 Milliliter PBS plus 10 % BSA. Inkubieren Sie anschließend die Partikel mit 2 Milliliter frischem PBS plus 10 % BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Waschungen mit jeweils 2 Milliliter PBS. Ersetzen Sie nach der letzten Waschung den PBS durch 2 Milliliter serumfreies Mikroskopie-Medium mit 37 Grad Celsius.

Stellen Sie eine mit SRBC beschichtete Petrischale auf den Mikroskopständer. Schaben Sie anschließend die transfizierten Zellen der gewünschten Population vom Boden der Kulturschale ab und pipettieren Sie die Zellen mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Geben Sie die transfizierten Zellen auf die mit SRBC beschichtete Schale.

Starten Sie die Software für die Live-Aufnahme. Suchen Sie eine Zelle, die die fluoreszenzmarkierten Proteine exprimiert, und justieren Sie die Position der Schale, sodass sich eine Zelle von Interesse in der Mitte des Sichtfelds befindet. Nehmen Sie 500 Bilder unter verschiedenen Winkeln von null bis 5 % in 0,01-Grad-Schritten bei einer Anregungswellenlänge auf.

Um den kritischen Winkel dafür zu bestimmen, dass das einfallende Licht an der Grenzfläche zwischen Glas und Medium vollständig reflektiert wird und eine evaneszente Welle erzeugt wird, öffnen Sie die Bildsequenz in der geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Wählen Sie einen interessierenden Bereich in der Zelle mit gleichmäßiger Fluoreszenz aus. Gehen Sie dann unter dem Reiter „Bild“ zu „Stacks“ und wählen „Z-Achsenprofil plotten“.

Um das mittlere Fluoreszenzintensitätsprofil der z-Achse in der Region des Interesses in Abhängigkeit von den Winkeln auf der x-Achse darzustellen. Jeder Winkelwert auf der x-Achse, der über dem kritischen Winkel liegt, kann anschließend während der Mikroskopiesitzung zur Erfassung eines TIRF-Signals verwendet werden. Danach im Live-Aufnahmesoftware den Protokoll-Editor verwenden, um die Parameter der Aufnahme festzulegen.

Unter Einbeziehung der Anzahl der Loop-Aufnahmesequenzen, der fluoreszierenden Kanäle und ihrer Laserintensität, des TIRF-Winkels sowie der Belichtungszeit. Stellen Sie die Z-Bewegung des Objektivs so ein, dass die Ebene des Epifluoreszenzmodus erreicht wird. Stellen Sie dann im Epifluoreszenzmodus den TIRF-Winkel auf 1 und die Z-Bewegung des Objektivs zurück auf die TIRF-Ebene.

Danach ein Bild der Zelle im hellen LED-Lichtmodus aufnehmen. Anschließend eine Zelle mit mäßigem Ausmaß an fluoreszenzmarkierter Proteinexpression auswählen, die gerade eine Phagozytose eines SRBC durchführt, und die Zelle in die Mitte des Sichtfelds bewegen. Beachten Sie, dass eine solche Zelle an der ausgedehnten Plasmamembran um das Partikel herum erkannt werden kann.

Geben Sie im Reiter „Loop Count“ die Anzahl der Bilder ein, um eine Streaming-Aufnahme von 500 bis 1.000 Bildern zu starten. Ändern Sie gegebenenfalls die Laserintensität und Belichtungszeit, um sie an die unterschiedlichen Fluoreszenzniveaus in der Zelle anzupassen. Um zwei separate Bildsequenzen zu erzeugen, die den beiden Kanälen entsprechen, öffnen Sie die Sequenzen in der Bildverarbeitungssoftware und klicken Sie auf den Reiter „Image“.

Wählen Sie im Menü „Hyperstacks“ die Option „Stack to Hyperstack“. Geben Sie anschließend im Popup-Fenster „xyctz“ für die Reihenfolge, die Anzahl verwendeter Fluorochrome für die Kanäle, die Anzahl der Schichten (Slices) auf der z-Achse, die Anzahl der Bilder geteilt durch die Anzahl der Kanäle unter „Frames“ sowie „Graustufen“ für den Anzeigemodus ein. Danach trennen Sie die Kanäle.

Hier ist ein repräsentativer Live-Cell-TIRF-Mikroskopie-Film eines Phagosomen-Schluss-Assays in rohen 264.7-Makrophagen zu sehen, die ein mit IGG opsonisiertes SRBC aufnehmen. Während sich die Spitzen der Pseudopodien, die der Deckglasoberfläche gegenüberliegen, um das SRBC herum bewegen, wird ein F-Aktin-Ring im TIRF-Bereich detektiert, der sich fortschreitend verengt, bis er sich schließt. Parallel dazu entspricht das unscharfe F-Aktin-Signal, das mittels Epifluoreszenz erfasst wird, nachdem der Objekttisch um drei Mikrometer über den TIRF-Bereich hinaus verschoben wurde, der Depolymerisation an der Basis der Phagozytosegrube.

Nach drei Minuten sind die SRBC vollständig internalisiert, wie durch Transmissionslichtmikroskopie bestätigt werden kann. Mit dieser Methode lassen sich die Aktinstrukturen am Basisbereich der Phagozytosegrube darstellen, an denen die fokale Exozytose der intrazellulären Kompartimente stattfindet. Nach der Aufnahme kann eine Zelle für die korrelative Elektronenmikroskopie weiterverarbeitet oder die gesamte Zellpopulation fixiert und eingefroren sowie für die klassische Immunfluoreszenzmikroskopie aufbereitet werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Phagozytose sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen ist und daher die Temperatur in der Heizkammer sowie im Kulturmedium der Petrischale während des gesamten Verfahrens konstant bei 37 Grad Celsius gehalten werden sollte. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man Partikel opsonisiert, Deckgläser mit den Partikeln beschichtet, die kritischen Winkel für die TIRF-Mikroskopie bestimmt und die Lokalisation von Proteinen während der Phagozytose in lebenden Zellen bildlich darstellt.