Name: Phagosomen Closure Assay zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale Visualisierung von Phagosomenbildung und -verschluss in lebenden Makrophagen mittels TIRF-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Beobachtung der Phagozytose in Echtzeit.

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Wir danken Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, Frankreich) für die ersten Diskussionen über den experimentellen Ansatz und Dr. Jamil Jubrail für die Lektüre des Manuskripts. Nadège Kambou und Susanna Borreill sind dafür bekannt, dass sie in unserem Labor Experimente mit der Methode durchgeführt haben. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des CNRS (ATIP-Programm), der Ville de Paris und der Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 einschließlich eines Promotionsstipendiums für FMA) an FN und der Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS) unterstützt, einschließlich eines Promotionsstipendiums für JM.

Hinweis: Das verwendete Plasmid LifeAct-mCherry ist ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17. 1. Zellen und Transfektion Anmerkung: RAW264.7 Makrophagen sind sub Konfluenz in komplettem Medium gezüchtet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10% FCS ( Kalbsfetusserum)) in einer 100-mm-Platte. Sie werden mit Plasmiden transfiziert durch Elektroporation fluoreszent markierte Proteine ​​kodieren. Routinemßig etwa 5 - 6 x 10 6 Zellen mit 20 ug oder 10 ug Plasmid für jede Transfektion oder Co-Transfektion bzw. transfiziert sind. Man beachte, dass andere Mittel zur Transfektion beruhen auf Elektroporation oder Lipofektion als alternative Ansätze verwendet werden. <ol><li> Abkratzen der Zellen mit einem Zellheber und resuspendieren sie in 10 ml Kulturmedium durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. </li><li> zentrifugieren Sie dieZellsuspension 300 · g, 5 min bei RT in Schwenkwinkel Rotor. </li><li> Vorwärmtemperatur 10 ml komplettem Medium mit 10 &amp; mgr; g / ml Gentamicin bei 37 ° C ergänzt. </li><li> Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und das Pellet in 3 ml &quot;Waschpuffer A&quot; aus der Elektroporation Kit. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension 300 · g, 5 min bei Raumtemperatur in Schwenkwinkel Rotor. </li><li> In der Zwischenzeit die DNA - Mischung bei Raumtemperatur hergestellt: 120 ul 2x Puffer B, 20 ug Plasmid - DNA , codierend für das Protein von Interesse, qsp 240 &amp; mgr; l H 2 O. </li><li> Nach der Zentrifugation verwerfen die gesamte Überstand. </li><li> Zellpellet in der DNA-Mischung und Transfer in 4 mm Elektroporationsküvetten. </li><li> 3 min bei RT inkubieren. </li><li> Elektroporation bei 250 V, 900 uF. </li><li> Resuspendieren sofort die Zellen in der vorgewärmten (37 ° C) komplettes Medium mit Gentamicin ergänzt und die Platte derm in einer 100 mm-Schale. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Morgen, ersetzen Sie das komplette Medium mit 10 ml Serum-freien Mikroskopie Medium (RPMI 1640 ohne Phenolrot, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin). </li></ol> 2. Opsonisierung von roten Blutkörperchen Hinweis: Als Modell der Partikel Ziel für Makrophagen, rote Blutkörperchen vom Schaf (SRBCs) verwendet werden. Normalerweise etwa 7 x 10 6 SRBCs pro 35 mm Glasbodenschale verwendet. <ol><li> Waschen Sie die SRBCs mit 100 ul 1x PBS (phosphate buffered saline) /0.1% BSA (Rinderserumalbumin) und Zentrifuge (600 · g, 4 min). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Resuspendieren der SRBCs in 100 ul 1x PBS / 0,1% BSA und Zentrifuge (600 × g, 4 min). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und resuspendieren SRBCs in 1x PBS / 0,1% BSA mit Kaninchen-IgG-anti-SRBCsbei Unter agglutinierende Konzentration. Verwenden Sie 500 ul einer Lösung, die Antikörper / 5 ul SRBCs. Anmerkung: Die Teil agglutinierende Konzentration von Antikörpern gegen die niedrigste Konzentration entspricht, die keine Agglutination als Bildung eines Netzwerks erkannt induzierte. Im Allgemeinen ist die Unter agglutinierende Konzentration beträgt 8,2 &amp; mgr; g / ml. <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration von IgG-Anti-SRBCs erforderlich, um die SRBCs durch einen Hämagglutinations-Test opsonisieren. Serienmäßig wird die IgG verdünnen anti-SRBCs (Lager bei 13,1 mg / ml) zwischen 1/50 - 1 / 25.600 in einer Mikrotiterplatte. Fügen Sie 2 x 10 6 SRBCs in jeder Vertiefung. Die Platte im Dunkeln bei RT für mehrere Stunden. </li></ol></li><li> bei RT inkubieren 30 Minuten mit langsamer Rotation. </li><li> Nach zweimaligem Waschen in 1x PBS / 0,1% BSA wie oben beschrieben, Resuspendieren der IgG-opsonisiertes SRBCs (IgG-SRBCs) in vorgewärmten serumfreien Mikroskopie Medium (2 ml / Schale). </li></ol> 3. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser <ol><li> In der Zwischenzeitbehandeln, 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml 0,01% Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Teller zweimal mit 2 ml 1x PBS. </li></ol> 4. Nicht-kovalente Fixierung von SRBCs auf Glasboden Geschirr <ol><li> Gießen 2 ml SRBCs Suspension pro 35 mm Glasbodenschale. </li><li> Zentrifuge mit einem schwingend Rotor bei 500 · g während 2 min auf 35 mm Glasbodenschalen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wäscht einmal mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA. </li><li> Inkubieren der Teilchen für 30 min mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA pro Schale. </li><li> Waschen Sie die Teller dreimal mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Ersetzen 1x PBS mit 2 ml vorgewärmtes (37 ° C) serumfreien Medium Mikroskopie. </li></ol> 5. Phagozytose Visualisierte von TIRFM <ol><li> Mikroskop Hinweis: TIRFM wurde durchgeführt unter Verwendung eines Mikroskops ausgestattet mit einer Öl-Immersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), einer Heizkammer mit CO 2, und zwei singenle Photonenerfassungskameras EMCCD (Elektronenvervielfachungs Charge Coupled Device), gekoppelt mit einer Linse 1,5X. <ol><li> Am Tag vor der TIRF-Mikroskop-Sitzung, schalten Sie die Heizkammer bei 37 ° C eine homogene Erwärmung des Mikroskoptisch zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Kritische Winkelbestimmung Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird. <ol><li> Legen Sie eine 35 mm Glasbodenschale mit opsonisierter SRBC mit Serum-freiem Medium Mikroskopie unter dem Mikroskop. </li><li> Abkratzen der Zellen und Resuspendieren sie in dem Medium vor ihnen Zugabe (100-500 ul) in die Schüssel. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Live Acquisition&quot; Software, um das Mikroskop steuern und durchführen Anregung mit einem 491 nm und / oder einem 561-nm-Laser zu identifizieren Zellen fluoreszenz markierte Proteine ​​exprimiert. </li><li> Identifizieren Sie eine Zelle, die die fluoreszenz markierte Proteine ​​exprimiert. </li><li> Legen Sie es in der Mitte des Feldes und erwerben 500 imAlter bei einer Anregungswellenlänge, mit verschiedenen Winkeln von 0 ° bis 5 °, mit einer Zunahme von 0,01 ° (2A) zu starten. Die Winkel werden automatisch durch das Mikroskopsystem verändert. </li><li> Bestimmen den kritischen Winkel so dass das einfallende Licht vollständig an der Glas / Medium-Schnittstelle und Erzeugen der abklingenden Welle reflektiert zu werden. Mit ImageJ Color Profiler Software, öffnen Sie die Bildsequenz, indem Sie auf &quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie die Datei. </li><li> Wählen Sie eine Region of Interest (ROI), mit dem rechteckigen Werkzeug, in der Zelle mit einer einheitlichen Fluoreszenz (2B gelb 1). </li><li> Zeichnen Sie die &quot;Z - Achse - Profil&quot; mittlere Fluoreszenzintensität in der ROI mit der Funktion der Winkel auf der x - Achse gemessen , indem Sie auf Registerkarte &quot;Bild&quot;, &quot;Stapel&quot; in der Drop - Down - Menü und &quot;Plot Z-Achse Profile&quot; (2B rot 2). Hinweis: Der kritische Winkel ist der Winkel zur ma führendenxim Fluoreszenz vor einer scharfen Abnahme der Fluoreszenz. </li><li> Verwenden einen beliebigen Wert des Winkels auf der x-Achse überlegen dem kritischen Winkel während der Mikroskopie Sitzung ein TIRF - Signal als Beispiel 2.00 (2C) zu erhalten. </li></ol></li><li> Acquisitions <ol><li> Verwendung von Live - Acquisition - Software, die Parameter des Erwerbs mit dem Modul &quot;Protocol Editor&quot; (3A) auf. <ol><li> Erstellen Sie ein Protokoll mit einer &quot;Schleife&quot; umfassend &quot;Multi Channels&quot; Erwerb Fluoreszenzsignal von Proteinen von Interesse in der TIRF Region zu erwerben. Geben Sie den TIRF Winkel (zum Beispiel 2,00), die Belichtungszeit (beispielsweise 50 msec) und die Laserintensität (beispielsweise 50%) (3B 1). </li><li> Einführung eines &quot;Z move&quot; des Objektivs 3 &amp; mgr; m über dem TIRF Bereich Signalerfassung in Epifluoreszenz mit dem &quot;Multi Channels&quot; Werkzeug zu erhalten. Geben Sie einen Winkel unter ter kritischen Winkel (wie beispielsweise 1,00), die Zeit der Exposition (50 msec) und die Laserintensität (50%) (3B, 2 und 3). </li><li> Als nächstes fügen unten , um ein &quot;z move&quot; des Objektivs 3 &amp; mgr; m, in der TIRF - Bereich (3B 4) zurückzukehren. Fügen Sie einen &quot;Schnappschuss&quot; der Zelle , in helles Licht LED (Light-Emitting Diode) (3B 5). </li></ol></li><li> Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einem moderaten Niveau von fluoreszenz markierte Protein-Expression, die durch die Verlängerung der Plasmamembran um das Teilchen Phagozytose von SRBC initiiert. </li><li> Legen Sie es in der Mitte des Feldes. </li><li> Starten Sie Streaming-Akquisition von 500 - 1.000 Frames. In der &quot;Schleifenzählung&quot;, geben Sie &quot;750 Frames&quot; (3B 1). Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird. </li><li> Öffnen Sie die Sequenz Bilder in Bild J-Software, indem Sie auf&quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und die Datei auswählen. </li><li> Trennen Sie die Kanäle durch einen Klick auf die Registerkarte &quot;Bild&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; Drop-Down-Menü und auf &quot;Stack zu Hyperstack&quot; -Funktion. Füllen Sie das Fenster erschienen: Bestellen: xyctz; Channel (c): Anzahl der Kanäle (ex: &quot;2&quot;, wenn Sie zwei Fluorochrome); Scheiben (z): Anzahl der Schichten in der Z-Achse (ex: &quot;1&quot;, wenn es keine Bewegung in der Z-Achse); Frames (t): Anzahl der Bilder pro Anzahl der Kanäle geteilt; Anzeigemodus: Graustufen. Anmerkung: Zwei getrennte Bildsequenzen erzeugt werden, entsprechend den zwei verschiedenen Kanälen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene experimentelle Protokoll schlägt eine beispiellose Methode vor, um in Echtzeit und in lebenden Zellen mit hoher Auflösung die Bildung eines Phagosoms und insbesondere dessen Verschluss zu verfolgen. Es müssen mehrere technische Aspekte erörtert werden. Erstens ist der Assay sehr temperaturempfindlich. Es ist sehr wichtig zu überprüfen, ob die Heizkammer eine Temperatur von 37 °C hat und dass alle Medien, Geräte oder Zellen in der Kammer aufbewahrt werden, um Temperaturschwankungen zu vermeiden, die ...

Phagozytose ist eine wichtige Zellfunktionen, die mit der Erkennungs beginnt und die Bindung von Material an Oberflächenrezeptoren, die dann führt zur Internalisierung und Degradation des aufgenommenen Materials. Während einzelliger Eukaryonten, wie die Form Dictyostelium discoideum und Amöben für Fütterung auf Bakterien Phagozytose verwenden, haben höhere Organismen mit professionellen Zellen entwickelt. Makrophagen oder dendritischen Zellen sind die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger in verschiedenen Geweben und Organen und sind entscheidend für die adaptive Immunsystem durch Antigenpräsentation und Zytokin - Produktion 1-4 zu aktivieren. Unter bestimmten Umständen können die Phagozytose von nicht-professionellen Phagozyten durchgeführt werden, zum Beispiel Endothel- und Epithelzellen. Dieser Prozess ist wichtig für die normale Gewebeumsatz und Umbau Homöostase während der Entwicklung und im Erwachsenenalter zu halten. Schließlich spezialisierte Fresszellen wie Sertoli-Zellen in den Hoden oder retinalenPigment - Epithelzellen sind extrem potente Phagozyten 5. Die Bildung eines phagosome wo Abbau von Mikroorganismen oder Zellabfall auftritt beginnt mit der Clusterung von phagozytischen Rezeptoren auf der Oberfläche der phagozytischen Zelle. Downstream Signalereignisse folgende Häufung von opsonischen Rezeptoren wie Fc-Rezeptoren (FcR) oder Komplement-Rezeptoren (CRs) wurden gut charakterisiert. Allerdings gibt es auch zahlreiche nicht-opsonischen Rezeptoren, einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), Lektine, Mannose-Rezeptoren und Scavenger-Rezeptoren. Diese Rezeptoren erkennen Determinanten auf der Partikeloberfläche , wie beispielsweise Mannose oder Fucose - Reste, Phosphatidylserin und Lipopolysaccharide 1,6-9. Pathogen oder Zelltrümmer Anerkennung beinhaltet die Bindung an und Clustering von mehreren Arten von phagozytischen Rezeptor, der dann zu intensiv und vorübergehende Aktin-Umbildung führen. Parallel dazu Brenn Exozytose von intrazellulären ABTEILUNGts trägt zur Freisetzung von Membranspannung und ist für eine effiziente Phagozytose von großen Teilchen wichtig. Die Signalereignisse zu Aktin-Polymerisation und Membranverformung führen, wurden in experimentellen Modellen seziert, die einen einzelnen phagozytischen Rezeptor ausgelöst. Während FcR-vermittelte Phagozytose, gibt es intensive Aktin-Polymerisation, die von kleinen GTPasen (Rac, Cdc42) geregelt wird. Unter ihren nachgeschalteten Effektoren führt das Wiskott-Aldrich - Syndrom - Protein (WASP) zur Aktivierung des Actin-Related Protein 2/3 Komplex (Arp2 / 3) , die Aktinfilamente 1,2,4,10 nukleiert. Die lokale Produktion von Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) ist von entscheidender Bedeutung für die anfängliche Aktin - Polymerisation , die pseudopod Bildung antreibt. Die Umstellung auf PI (3,4,5) P 3 ist für pseudopod Verlängerung und phagosome Verschluss 11 erforderlich. Mehrere Wege beitragen 2 zum Verschwinden von PI (4,5) P. Zum einen Ablösung von Phosphatidylinositol Phosphat Kinases (PIPKIs) von der phagosome Verhaftungen PI (4,5) P2 - Synthese. Zweitens kann es nach Klasse phosphoryliert und verbraucht werden , ich PI3K - Kinasen (PI3K) und in PI (3,4,5) P 3 12 umgewandelt. Eine Rolle für Phosphatasen und Phospholipasen hat auch in PI (4,5) P 2 Hydrolyse und F-Actin - Entfernung während der Phagozytose in Säugerzellen und in Dictyostelium 13,14 angedeutet worden. Die Phospholipase C (PLC) δ hydrolisiert PI (4,5) P 2 in Diacylglycerin und Inositol-1,4,5- Tris - Phosphat. Die PI (4,5) P2 und PI (3,4,5) P 3 Phosphatase OCRL (Lowe-Syndrom Lowe) wurde ebenfalls in phagosome Bildung in Verbindung gebracht. Präzise lokale Bildung von F-Actin und seine Depolymerisation fest in Raum und Zeit geregelt wird, und wir haben gezeigt, dass die Rekrutierung von intrazellulären Kompartimenten gezeigt ist wichtig, lokal die OCRL Phosphatase zu liefern, was zu einer lokalen Aktin Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse beitragen <sup&gt; 13,15. Dazu verwendeten wir die Versuchsanordnung hier beschrieben. Der Mechanismus und die molekularen Spieler für phagosome Schließung und Membran scission erforderlich bleiben schlecht wegen der Schwierigkeiten, definiert bei der Visualisierung und Überwachung der Website von phagosome Schließung. Bis vor kurzem wurde die Phagozytose auf festen oder lebenden Zellen beobachtet, die Teilchen auf ihrer Rückenfläche internalisieren oder auf ihren Seiten, so dass die rechtzeitige Visualisierung des Standortes von phagosome Schließung schwierig. Darüber hinaus Befestigungsmethoden könnten Rückzug von Membranen und Vorspannung bewirken, dass die Ergebnisse auf Pseudopodien Erweiterung und Schließung. Dagegen ist der Test, den wir eingerichtet haben und beschreiben hier können wir pseudopod Erweiterung und die Schließung Schritt der Phagozytose in lebenden Zellen 13, bezogen auf die gesamte interne Reflexion Mikroskopie (TIRFM) 16 sichtbar zu machen. Diese optische Technik verwendet eine abklingende Welle Fluorophore in einem dünnen Bereich zwischen einer transparenten an der Grenzfläche anzuregen, soDeckel (Deckglas) und eine Flüssigkeit (Zellkulturmedium). Die Dicke der Anregungstiefe beträgt etwa 100 nm von der festen Oberfläche, so dass die Visualisierung von molekularen Ereignissen nahe an der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, und begrenzt die out-of-focus-Fluoreszenz und die Cytotoxizität aufgrund Beleuchtung der Zellen. Ausnutzend TIRFM, entwickelten wir das &quot;phagosome Verschluss assay&quot; in dem Deckgläschen mit Poly-Lysin aktiviert werden und dann beschichtet mit IgG-opsonisiertes roten Blutzellen (IgG-SRBCs). Makrophagen transient fluoreszierend markierten Proteine ​​von Interesse exprimieren, werden dann die IgG-SRBCs zu versenken erlaubt. Während Zellen, die die Zielpartikel lösen, die nicht-kovalent an die Glasoberfläche sind, können die Spitzen der Pseudopodien beobachtet und in den TIRF-Modus aufgezeichnet werden. TIRF Akquisitionen mit Akquisitionen im Epifluoreszenz-Modus kombiniert, nach der Stufe 3 um oben verlagert, was die vis erlaubtualization der Basis des phagozytischen Tasse. Zugabe von pharmakologischen Wirkstoffen wie diejenigen, Actin oder dynamin während des Prozesses Hemmen ist auch möglich, das Verfahren weiter auf molekularer Ebene zu sezieren. Das Protokoll im Detail hier beschrieben ist, für eine RAW264.7 murine Makrophagenzelllinie und opsonierten Partikel, aber praktisch kann es auf andere phagozytische Zelle und mit anderen Zielen, wie beispielsweise Kügelchen angepasst werden. Diese Methode wird eine bessere Charakterisierung der Regelung in Zeit und Raum der molekularen Spieler in pseudopod Erweiterung und phagosome Schließung während verschiedener phagozytischen Prozessen beteiligt zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Rote Blutkörperchen gegen Schafe IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin Hitzeschockfraktion, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten 4 mm</td><td>Zellprojekt</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Raumtemperatur Elektropuffer-Kit</td><td>Zellprojekt</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Lösung</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschalen 35 mm unbeschichtet 1,5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Öl-Immersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), Heizkammer mit CO2, eine Kamera Einzelphotonendetektion EMCCD (Electron Multiplikation Charge Coupled Device) und eine 1,5-fache</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung 0,1 %</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td>Verdünnung bei 0,01 % in Wasser</td></tr><tr><td>RPMI 1640 mittel GLUTAMAX&nbsp; Ergänzung</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, kein Phenolrot (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Rote Blutkörperchen (SRBCs) von SchafenEurobio</td><td></td> <td>DSGMTN00-0Q</td><td>Konserviert in Alsever Puffer bei 4 μde; C vor dem Gebrauch</td></tr></tbody></table>

&quot;phagosomen closure assay&quot; zu visualisieren phagosomen formation in drei dimensionen mit total internal reflection fluoreszenz-mikroskopie (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagozytose ist ein Mechanismus, der von spezialisierten Zellen verwendet wird, um Mikroorganismen oder Zelltrümmer zu internalisieren und zu eliminieren. Es beruht auf tiefgreifenden Umlagerungen des Aktin-Zytoskeletts, das die treibende Kraft für die Ausdehnung der Plasmamembran um das Partikel ist. Darüber hinaus beruht die effiziente Verschlingung von großem Material auf der fokalen Exozytose intrazellulärer Kompartimente. Dieser Prozess ist hochdynamisch und es wurde beschrieben, dass zahlreiche molekulare Akteure eine Rolle bei der Bildung phagozytärer Becher spielen. Die genaue zeitliche und räumliche Regulation all dieser Moleküle ist jedoch noch schwer fassbar. Darüber hinaus war der letzte Schritt des Phagosomenverschlusses sehr schwer zu beobachten, da die Hemmung durch RNA-Interferenz oder dominante negative Mutanten oft zu einer verzögerten phagozytären Becherbildung führt. 
Wir haben einen speziellen experimentellen Ansatz mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) in Kombination mit Epifluoreszenz entwickelt, um Schritt für Schritt die Ausdehnung von Pseudopoden und ihren Spitzen in einem Phagosom zu überwachen, das um ein Partikel herum wächst, das lose an ein Deckglas gebunden ist. Diese Methode ermöglicht es uns, mit hoher Auflösung die Spitzen der Pseudopoden und ihre Fusion während des Verschlusses des Phagosoms in lebenden Zellen für zwei verschiedene fluoreszenzmarkierte Proteine gleichzeitig zu beobachten.

Das experimentelle System in diesem Manuskript beschrieben ist, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Transfizierte RAW264.7 Makrophagen , die Proteine ​​von Interesse zu einem fluoreszierenden Tag fusioniert exprimiert in Kontakt gebracht werden mit IgG-opsonisiertes roten Schafsblutzellen (SRBCs) , die waren nicht-kovalent fixierten auf dem Deckglas. Die Makrophagen können die SRBC aus dem Deckglas lösen sie zu verschlingen. Das Mikroskop verwendet TIRF ermöglich...

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Phagosomebildung sowie die genaue Stelle der Phagosome-Spaltung in 3D in lebenden Makrophagen mittels Totaler Interner Reflexionsfluoreszenz, oder TIRF-Mikroskopie, sichtbar zu machen. Diese Methode kombiniert die TIRF-Mikroskopie mit Epifluoreszenz, um die schrittweise Lokalisation von zwei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen während der Pseudopodienausstülpung und -spitzenfusion zu verfolgen. Die Technik bietet eine systematische Methode, um den kritischen Winkel zu bestimmen und ein TIRF-Signal zu erhalten, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf Vorgänge nahe der Plasmamembran zu ziehen.Am Tag vor der TIRF-Mikroskopie-Sitzung die Heizkammer auf 37 Grad Celsius einschalten, um eine homogene Erwärmung der Mikroskopierbühne zu ermöglichen. Am nächsten Morgen 7 × 10⁶ Schafs-rote Blutkörperchen (SRBCs) pro 35-Millimeter-Dish mit Glasboden zweimal mit jeweils 100 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 0,1 % BSA, waschen. Nach der zweiten Zentrifugation die Zellen in 500 Mikrolitern Kaninchen-IgG anti-SRBCs in PBS mit 0,1 % BSA bei einer subagglutinierenden Konzentration pro 5 Mikroliter Zellen resuspendieren und 30 Minuten unter langsamer Rotation inkubieren.Am Ende der Inkubation die SRBCs zwei Mal in PBS mit BSA waschen und die Zellen in 2 Milliliter mikroskopiegeeignetem Medium ohne Serum pro Platte bei 37 Grad Celsius resuspendieren. Anschließend 35-Millimeter-Glasbodenplatten mit 2 Milliliter 0,1 % Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandeln, gefolgt von zwei Waschschritten mit jeweils 2 Milliliter PBS. Zur nicht-kovalenten Fixierung der SRBCs 2 Milliliter der mit IGG opsonisierten Zellen in jede polylysinbeschichtete Platte geben und die Proben in einem Schwenkrotor-Zentrifugenröhrchen zentrifugieren.Entfernen Sie die Überstände und waschen Sie die Partikel einmal mit 2 Milliliter PBS plus 10 % BSA. Inkubieren Sie anschließend die Partikel mit 2 Milliliter frischem PBS plus 10 % BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Waschungen mit jeweils 2 Milliliter PBS. Ersetzen Sie nach der letzten Waschung den PBS durch 2 Milliliter serumfreies Mikroskopie-Medium mit 37 Grad Celsius.Stellen Sie eine mit SRBC beschichtete Petrischale auf den Mikroskopständer. Schaben Sie anschließend die transfizierten Zellen der gewünschten Population vom Boden der Kulturschale ab und pipettieren Sie die Zellen mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Geben Sie die transfizierten Zellen auf die mit SRBC beschichtete Schale.Starten Sie die Software für die Live-Aufnahme. Suchen Sie eine Zelle, die die fluoreszenzmarkierten Proteine exprimiert, und justieren Sie die Position der Schale, sodass sich eine Zelle von Interesse in der Mitte des Sichtfelds befindet. Nehmen Sie 500 Bilder unter verschiedenen Winkeln von null bis 5 % in 0,01-Grad-Schritten bei einer Anregungswellenlänge auf.Um den kritischen Winkel dafür zu bestimmen, dass das einfallende Licht an der Grenzfläche zwischen Glas und Medium vollständig reflektiert wird und eine evaneszente Welle erzeugt wird, öffnen Sie die Bildsequenz in der geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Wählen Sie einen interessierenden Bereich in der Zelle mit gleichmäßiger Fluoreszenz aus. Gehen Sie dann unter dem Reiter „Bild“ zu „Stacks“ und wählen „Z-Achsenprofil plotten“.Um das mittlere Fluoreszenzintensitätsprofil der z-Achse in der Region des Interesses in Abhängigkeit von den Winkeln auf der x-Achse darzustellen. Jeder Winkelwert auf der x-Achse, der über dem kritischen Winkel liegt, kann anschließend während der Mikroskopiesitzung zur Erfassung eines TIRF-Signals verwendet werden. Danach im Live-Aufnahmesoftware den Protokoll-Editor verwenden, um die Parameter der Aufnahme festzulegen.Unter Einbeziehung der Anzahl der Loop-Aufnahmesequenzen, der fluoreszierenden Kanäle und ihrer Laserintensität, des TIRF-Winkels sowie der Belichtungszeit. Stellen Sie die Z-Bewegung des Objektivs so ein, dass die Ebene des Epifluoreszenzmodus erreicht wird. Stellen Sie dann im Epifluoreszenzmodus den TIRF-Winkel auf 1 und die Z-Bewegung des Objektivs zurück auf die TIRF-Ebene.Danach ein Bild der Zelle im hellen LED-Lichtmodus aufnehmen. Anschließend eine Zelle mit mäßigem Ausmaß an fluoreszenzmarkierter Proteinexpression auswählen, die gerade eine Phagozytose eines SRBC durchführt, und die Zelle in die Mitte des Sichtfelds bewegen. Beachten Sie, dass eine solche Zelle an der ausgedehnten Plasmamembran um das Partikel herum erkannt werden kann.Geben Sie im Reiter „Loop Count“ die Anzahl der Bilder ein, um eine Streaming-Aufnahme von 500 bis 1.000 Bildern zu starten. Ändern Sie gegebenenfalls die Laserintensität und Belichtungszeit, um sie an die unterschiedlichen Fluoreszenzniveaus in der Zelle anzupassen. Um zwei separate Bildsequenzen zu erzeugen, die den beiden Kanälen entsprechen, öffnen Sie die Sequenzen in der Bildverarbeitungssoftware und klicken Sie auf den Reiter „Image“.Wählen Sie im Menü „Hyperstacks“ die Option „Stack to Hyperstack“. Geben Sie anschließend im Popup-Fenster „xyctz“ für die Reihenfolge, die Anzahl verwendeter Fluorochrome für die Kanäle, die Anzahl der Schichten (Slices) auf der z-Achse, die Anzahl der Bilder geteilt durch die Anzahl der Kanäle unter „Frames“ sowie „Graustufen“ für den Anzeigemodus ein. Danach trennen Sie die Kanäle.Hier ist ein repräsentativer Live-Cell-TIRF-Mikroskopie-Film eines Phagosomen-Schluss-Assays in rohen 264.7-Makrophagen zu sehen, die ein mit IGG opsonisiertes SRBC aufnehmen. Während sich die Spitzen der Pseudopodien, die der Deckglasoberfläche gegenüberliegen, um das SRBC herum bewegen, wird ein F-Aktin-Ring im TIRF-Bereich detektiert, der sich fortschreitend verengt, bis er sich schließt. Parallel dazu entspricht das unscharfe F-Aktin-Signal, das mittels Epifluoreszenz erfasst wird, nachdem der Objekttisch um drei Mikrometer über den TIRF-Bereich hinaus verschoben wurde, der Depolymerisation an der Basis der Phagozytosegrube.Nach drei Minuten sind die SRBC vollständig internalisiert, wie durch Transmissionslichtmikroskopie bestätigt werden kann. Mit dieser Methode lassen sich die Aktinstrukturen am Basisbereich der Phagozytosegrube darstellen, an denen die fokale Exozytose der intrazellulären Kompartimente stattfindet. Nach der Aufnahme kann eine Zelle für die korrelative Elektronenmikroskopie weiterverarbeitet oder die gesamte Zellpopulation fixiert und eingefroren sowie für die klassische Immunfluoreszenzmikroskopie aufbereitet werden.Es ist wichtig zu beachten, dass die Phagozytose sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen ist und daher die Temperatur in der Heizkammer sowie im Kulturmedium der Petrischale während des gesamten Verfahrens konstant bei 37 Grad Celsius gehalten werden sollte. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man Partikel opsonisiert, Deckgläser mit den Partikeln beschichtet, die kritischen Winkel für die TIRF-Mikroskopie bestimmt und die Lokalisation von Proteinen während der Phagozytose in lebenden Zellen bildlich darstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) zur Visualisierung exozytärer Ereignisse in kortikalen Neuronen. Ein pH-empfindlicher Marker für grün fluoreszierendes Protein (GFP) fluoresziert bei der Vesikelfusion, wobei die selektive TIRF-Anregung die membranproximale Exozytose...

Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse 

Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Lernen Sie die dreidimensionale Visualisierung von Phagosomenbildung und -verschluss in lebenden Makrophagen mittels TIRF-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Beobachtung der Phagozytose in Echtzeit.

Phagosomen Closure Assay zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) (Video) | JoVE Journal

"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

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