Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models

22.5K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/54479

⸱

5. September 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir berichten über ein raffiniertes Verfahren des Eisenchlorid (FeCl 3) induzierte Thrombose - Modelle auf carotis und A. mesenterica sowie Vene, dadurch effizient Intravitalmikroskopie unter Verwendung von Zeit zu überwachen Thrombenbildung zu okklusiv.

Zusammenfassung

Arterielle Thrombose (Blutgerinnsel) ist eine häufige Komplikation vieler systemischer Erkrankungen, die mit chronischen Entzündungen verbunden sind, einschließlich Arteriosklerose, Diabetes, Fettleibigkeit, Krebs und chronischen autoimmunen rheumatologischen Erkrankungen. Thromben sind die Ursache für die meisten Herzinfarkte, Schlaganfälle und den Verlust der Extremitäten, was Thrombosen zu einem äußerst wichtigen Problem für die öffentliche Gesundheit macht. Da diese Thromben von einer unangemessenen Thrombozytenaktivierung und anschließenden Gerinnung herrühren, ist die therapeutische Ausrichtung auf diese Systeme von großer klinischer Bedeutung für die Entwicklung sichererer Behandlungen. Aufgrund der Komplexität des hämostatischen Systems können In-vitro-Experimente die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gefäßwand nicht replizieren. Daher sind In-vivo-Studien von entscheidender Bedeutung, um die pathologischen Mechanismen der Thrombusbildung zu verstehen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Thrombosemodelle an Mäusen entwickelt. Unter ihnen ist die durch Eisenchlorid (FeCl3) induzierte Gefäßverletzung ein weit verbreitetes Modell der Okklusivthrombose, das über die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen im Rahmen eines aseptischen geschlossenen Gefäßsystems berichtet. Dieses Modell basiert auf einer Redox-induzierten Endothelzellschädigung, die einfach und empfindlich sowohl gegenüber Antikoagulanzien als auch mit Thrombozytenaggregationshemmern ist. Die Zeit, die für die Entwicklung eines Thrombus benötigt wird, der den Blutfluss blockiert, gibt ein quantitatives Maß für die Gefäßverletzung, die Thrombozytenaktivierung und die Aggregation, die für thrombotische Erkrankungen relevant sind. Wir haben dieses FeCl3-induzierte vaskuläre Thrombosemodell erheblich verfeinert, wodurch die Daten bei minimaler Variation hochgradig reproduzierbar sind. Hier beschreiben wir das Modell und präsentieren repräsentative Daten aus mehreren Versuchsaufbauten, die den Nutzen dieses Modells in der Thromboseforschung belegen.

Einleitung

Arterielle Thrombose (Blutgerinnsel) ist eine häufige Komplikation vieler systemischen mit chronischer Entzündung assoziierte Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose, Diabetes, Fettleibigkeit, Krebs und chronische Autoimmun rheumatologischen Erkrankungen. Thromben, die in den arteriellen Kreislauf stammen aus unangemessenen Thrombozytenaktivierung, Aggregation und anschließende gerinnungsMechanismen auftreten, und sind in Herzinfarkt, Schlaganfall und Extremitätenverlust verwickelt. Die Behälterwand ist ein komplexes System , das mehrere Zelltypen einschließt und durch eine Vielzahl von äußeren Faktoren ab, einschließlich Scherspannung, zirkulierenden Blutzellen, Hormonen und Cytokinen, sowie die Expression von Antioxidationsmittel - Proteine ​​in der Gefäßwand. In vitro Experimente replizieren kann nicht beeinflusst dieser komplexen Umgebung und deshalb in - vivo - Studien an Tiermodellen sind entscheidend besseres Verständnis der Mechanismen bei thrombotischer Erkrankungen beteiligt zu ermöglichen.

Die Mäuse wurden sim gezeigt zu haben,Ilar Mechanismen für den Menschen im Hinblick auf die Thrombose, Arteriosklerose, Entzündungen und Diabetes 1,2. Weiterhin transgenen und Knockout-Mäuse können die Funktion von spezifischen Genprodukten in einer komplexen physiologischen oder pathologischen Umgebung zu testen erstellt werden. Solche Studien der menschlichen Pathologie nachahmen und bei der Charakterisierung von Arzneimittelwirkungen auf Thrombose wichtige Details bereitstellt, als auch, um Entdeckung neuer Wege und Therapien in Verbindung stehen wichtige mechanistische Informationen zur Verfügung stellen kann.

Pathologische arterielle Thromben entstehen durch Schicht Verletzung oder Dysfunktion und Exposition des Blutstroms in die subendothelialen Matrix 3,4 an Endothelzellen. Verschiedene Thrombose Modelle wurden diese Endotheleinrisses zu induzieren entwickelt, wie mechanische Verletzungen, photo Verbindung Rose Bengal-basierte oxidative Schädigung und Laser-Verletzung 5. In diesem Spektrum, Eisenchlorid (FeCl 3) -induzierten Gefäßverletzung ein weit verbreitetes Modell der Thrombose ist. Dieses Reagenz, wennaufgetragen auf die äußere Aspekt der Gefäße induziert , auf vaskulären Zellen oxidativer Schädigung 6-8, mit dem Verlust der endothelialen Zellschutz von Thrombozyten und Komponenten der Gerinnungskaskade zirkuliert. Die FeCl 3 Modell ist einfach und empfindlich auf beiden Antikoagulans und Anti-Thrombozyten Drogen, und hat auf carotis und Oberschenkelarterien, Jugularvenen und mesenterialen und cremasterica Arteriolen und Venolen bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen 6-15 durchgeführt worden ist .

Ein messbarer Parameter in diesem Modell ist die verstrichene Zeit von der Verletzung Gefäßverschluss zu vervollständigen, gemessen als Blutfluss Aufhören mit einem Doppler - Durchflussmesser oder unter direkter Beobachtung mit Intravitalmikroskopie 6,7,9. Eine Reihe von Zeiten zwischen 5 bis 30 min wurde in verschiedenen Studien in C57Bl6 Mäusen 7-10,16, berichtet darauf hindeutet , dass FeCl 3 Konzentrationen, die Art der Anästhesie, OP - Techniken, Maus Alter, genomischen Hintergrund, Verfahren b Messunglood Fluss und andere Umgebungsvariablen haben erhebliche Auswirkungen in diesem Modell. Diese große Variabilität macht es schwierig, Studien von verschiedenen Forschungsgruppen zu vergleichen und kann Erkennung von subtilen Unterschiede erschweren.

Mit einer Vision solche Variabilitäten zu minimieren und eine gleichmäßig reproduzierbare in vivo Modellsystem etablieren, haben wir die FeCl 3 -induzierten Arteria carotis Modell verfeinert, die die Daten in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Variation macht 6-10,16-19. In diesem Papier beschreiben wir, und die Fähigkeiten teilen und mehrere repräsentative experimentelle Beispiele berichten, die von diesem Modell profitieren können.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Verfahren und Manipulationen der Tiere wurden von Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) von der Cleveland Clinic in Übereinstimmung mit den Vereinigten Staaten Public Health Service - Politik auf der Humane Pflege und Verwendung von Tieren, und der NIH Leitfaden für die Pflege genehmigt und Verwendung von Labortieren.

1. Vorbereitungen:

  1. Fluoreszenzfarbstoff für Labeling Platelets
    1. Bereiten Rhodamin 6G-Lösung, 0,5 mg / ml, in Kochsalzlösung und sterilisiert die Lösung mit 0,22 um-Filter.
  2. FeCl 3 Lösung
    1. Machen Sie eine frische Stammlösung von 30% FeCl 3 (wasserfrei, ist gleich 1,85 M) in reinem Wasser, und Filter mit 0,45 & mgr; m - Filter. Bereiten 5 ml frisch FeCl 3 -Lösung in der gewünschten Konzentration [zB 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) und 12,5% (0,771 M)] von Verdünnen der 30% FeCl 3 -Lösung mit Wasser ina 6 cm Gewebekulturschale und halten den Deckel geschlossen.
      HINWEIS: Mit der Kulturschale erleichtert es , das Filterpapier zu holen , gesättigt mit FeCl 3 -Lösung , als es aus einem engen Behälter, wie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu holen. FeCl3 ist extrem gefährlich und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und Laborkittel usw., Persönliche Schutzausrüstung sollte immer genommen werden.
  3. Filterpapiere
    1. Schneiden Sie das Filterpapier zu 1 mm x 2 mm Größe. Einweichen genug Stücke des geschnittenen Filterpapier in der FeCl 3 -Lösung in der gleichen Schale.
  4. Papaverinhydrochlorid Lösung
    1. Bereiten Papaverinhydrochlorid-Lösung (25 mg / ml) in Wasser und Sterilisieren der Lösung mit 0,22 um-Filter.
  5. Agarose Gel
    1. Bereiten 2% Agarosegel in PBS oder Kochsalzlösung in 6-Well-Gewebekulturplatte, ~ 1 cm Dicke und cut es zu Halbkreis mit ~ 3 cm Durchmesser.

2. FeCl 3 Induced Arteria carotis Injury Thrombosis Modell

  1. Chirurgische Verfahren zur Thrombosemodell
    1. Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alt C57Bl6 Mäuse (oder andere Stämme wie erforderlich). Anästhesieren Mäuse mit dem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) über intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehe Kneifen.
      ANMERKUNG: Diese Menge an Ketamin / Xylazin ausreicht , um das Tier in stabiler Anästhesie zu halten und keine Schmerzen ( als Reaktion auf toe Kneifen) für mindestens 1 Std.
    2. Entfernen Sie Fell am Hals und oberen Brustbereich mit einem kleinen Tier elektrische Klipper. Enthaarungscreme ist nicht erforderlich. Tragen Sie neutral Erdöl Augensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    3. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf dem Deckel 15 cm Gewebekulturplatte. Verwenden Sie ein langes Band (~ 10 cm) hin zu sichernd Gliedmaßen und Unterkörper und zwei Stücke von kleinen Band (2 cm x 0,5 cm) Vorderbeine zu sichern. Verwenden Sie einen 4-0 Naht um die Schneidezähne zu wickeln, kleben Sie die beiden Enden des Fadens an dem Deckel gerade Maus Hals zu halten (Abbildung 2).
    4. Legen Sie die Platte mit der Maus den Kopf in Richtung des Bedieners unter einem chirurgischen Lichtquelle.
    5. Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit Alkohol-Pad. Verwenden Sie die Micro-Adson Pinzette die Haut zu halten und eine chirurgische Schere verwenden, um einen kleinen Schnitt machen (2 - 3 mm).
    6. Halten Sie die Haut des Einschnitts mit der Zange und chirurgische Schere Einsatz mit Backen in den Einschnitt geschlossen. Schieben Sie die Schere subkutan in Richtung des Manubrium oder Kinn, und dann die Schere öffnen Sie die Haut von der subkutanen Schicht zu befreien.
    7. Schneiden Sie die Haut mit den chirurgischen Schere einen Mittelschnitt vom manubrium auf das Niveau des Zungenbeins (3A und 3B) zu machen. Unverblümt sezieren die dünne Faszie (gestrichelte Linie, in 3B) zwischen den Submaxillardrüsen mit einem feinen hemostat und einer Graefe Zange (3B und 3C, blaue Pfeile).
      HINWEIS: Die manubrium (schwarzer Pfeil in 3C) und die Trachea (T in 3C) wird nach diesem Schritt zu sehen.
    8. Halten Sie das Weichgewebe und die Haut an der rechten Seite des Manubrium mit den Graefe Zange gesehen, legen Sie die hemostat unter der Faszie in Richtung der 2 - Uhr - Position (gelb gestrichelte Linie in 3C), öffnen Sie die Backen der hemostat die frei Halsvene aus dem umgebenden Gewebe.
    9. Schneiden Sie die Faszien, Weichgewebe und die Haut in Richtung der 2 - Uhr - Position (3C) mit den chirurgischen Schere , um die rechte Halsvene (3D, Pfeil) zu belichten.
    10. Zeichnen Sie etwa 200 bis 300 & mgr; l Rhodamin 6G-Lösung mit einer 1-ml-Spritze mit 22 G-Nadel, und dann ändernes bis zu 30 G Nadel.
      HINWEIS: Dies schützt die 30 G - Nadel vor Beschädigung seiner feinen Spitze. Direkt Zeichnen der Rhodamin 6G-Lösung mit der 30 G-Nadel wird nicht die Spitze beschädigen; jedoch berühren die Behälterwand versehentlich Schaden verursachen, die Injektion schwierig machen kann.
    11. Spülen Sie die 30 G-Nadel durch langsames Herausdrücken des Rhodamin-6G-Lösung, stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen bleiben in der Spritze oder die Nadel. Halten Sie 100 ul Rhodamin 6G Injektionslösung.
    12. Bend 2 - 3 mm Spitze der Nadel in einen 90 ° Winkel mit dem Nadelhalter, der die Nadel zu tief in die Jugularvene Einführen verhindert und macht die Injektion leichter gesteuert (Figur 3D).
    13. Injizieren Sie die Rhodamin 6G-Lösung in die rechte Halsvene zu Etikett Blutplättchen. Um die Spritze zu stabilisieren und die Nadel in Position zu halten, halten Sie die Spritze mit einer Hand und die Nadel mit den Graefe Zange mit der anderen Hand während der injection.After Injektion, klemmen die Injektionsstelle mit den Graefe Zange Blutungen zu vermeiden.
    14. Öffnen Sie die Backen der hemostat und legen Sie sie unter den Graefe Zange die Gefäßwand der Injektionsstelle zu klemmen, und dann ligieren die Injektionsstelle mit einer 6-0 Naht.
      HINWEIS: Als Alternative von Schritt 2.1.15, mit dem Finger 2 min Druck auf die Injektionsstelle der Anwendung wird die Blutung zu stoppen; jedoch hat dieses Verfahren ein Risiko besteht, dass weitere Blutungen, wenn das Gerinnsel an der Injektionsstelle wird accidently entfernt.
    15. Unverblümt sezieren das weiche Gewebe und Faszien um den linken Submaxillardrüse mit dem hemostat und Graefe Zange und ziehen Sie die Drüse in Richtung der 7 - Uhr - Position (3E) die Kopfnickermuskel (blauer Pfeil in Abbildung 3E) zu belichten.
    16. Unverblümt sezieren die Faszie (Abbildung 3E, gestrichelte Linie) zwischen dem linken Kopfnickers und der M. omohyoideus oder sternohyoid Muskel (3E, grüner Pfeil) auf der linken Seite der Luftröhre mit dem Hämostatikum entfernt.
    17. Führen Sie eine Nadel mit 6-0 Seidennaht (ca. 15 cm lang) unter der Mitte des Kopfnickers (blauer Pfeil in Abbildung 3E), legen Sie die beiden Enden des Fadens zusammen und ziehen Sie den Faden seitlich in Richtung der 10 - Uhr - Position .
      Hinweis: Dieses Verfahren sollte sorgfältig durchgeführt werden , um Verletzungen der linken Halsschlagader zu vermeiden, die außerhalb des Kopfnickers befindet.
    18. Unverblümt trennen den dünnen M. sternohyoideus und / oder M. omohyoideus der A. carotis (CA) (Abbildung 3F Pfeil) freizulegen , nachdem die Kopfnickers Wegziehen. Schneiden Sie den M. sternohyoideus und / oder M. omohyoideus wie nötig. Verwenden Sie die hemostat das weiche Gewebe von CA zu trennen, ohne die CA berühren
      HINWEIS: CA durch den Vagusnerv begleitet wird, gesehen die weiße Struktur in Abbildung 3G (grüner Pfeil), und in den meisten Fällen unter dem dünnen M. sternohyoideus und / oder M. omohyoideus (zwischen den gelben gepunkteten Linien in Abbildung 3F) ist.
    19. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette die seitliche Blende um die CA zu holen, während die Vagusnerv zu vermeiden und CA. Verwenden Sie eine andere feine Spitze Pinzette ein Loch auf der Faszie zwischen dem CA zu stanzen und Vagusnerv.
    20. Führen Sie den Haken durch das Loch und sanft die CA heben, und legen Sie dann die feine Spitze Pinzette unter der CA. Bewegen Sie den Haken und Zangen in entgegengesetzte Richtungen entlang der CA adventitiellen Weichgewebe zu entfernen. Freie mindestens ~ 5 mm Länge von CA (3H, blauer Pfeil) aus dem umgebenden Gewebe.
    21. Um die Hintergrundfluoreszenz blockieren, drücken Sie die Ende eines schwarzen Kunststoff Kaffee Rührer flach, crosscut den Kaffee Rührer in einem 3 mm Stück, und dann in Längsrichtung entlang der Faltenkanten geschnitten zu bekommen zwei Stücke von "U" -Form Kunststoff (3H, grün Pfeil).
      22. ein Stück dieses "U" -Form Kunststoff mit Kochsalzlösung und halten Sie es mit einer Pinzette und legen Sie sie unter dem CA während sanft die CA mit dem Haken (3H, grüner Pfeil) anheben. Unmittelbar 2-3 Tropfen Kochsalzlösung gelten die CA zu vermeiden Trocknen
  2. Echtzeit - Aufzeichnung Video
    1. Übertragen Sie die Maus und die Platte Deckel zusammen mit dem Mikroskoptisch und in einer geeigneten Position unter dem 10X Wasserlinse. Füllen Sie den Raum zwischen dem 10X-Objektiv und dem CA mit Kochsalzlösung.
    2. Starten Sie die digitale Videoaufzeichnung Software-Anwendung, und starten Sie eine neue Datei und benennen Sie es entsprechend. Nehmen normale Gefäßbilder und notieren Sie sich die Rahmennummer, wenn die Videoaufzeichnung gestoppt wird.
      HINWEIS: Verweisen Sie auf das Video - Recording - Software auf dem Computer für die Aufzeichnung. Wir verwenden die digitale Videoaufzeichnung Software und die folgenden Beschreibungen zu dieser Anwendung basieren.
      HINWEIS: Da mechanische traUMA das Endothel verletzen kann und zur Thrombusbildung 20 führen , ist es notwendig , zu bestätigen , dass es vor der Gefäßwand an den FeCl 3 Verletzungen keine chirurgische Verletzung ist. Es ist auch notwendig , um zu bestätigen , dass es keine verbleibenden Gewebe um die CA ist, die eine Barriere bilden kann , und die Wirkung von FeCl 3 -induzierten Verletzung dämpfen. Schreiben Sie die Rahmennummer der Datensätze nach unten wird es einfach, die Videos zu analysieren später verstrichenen Zeiten nach.
    3. Bewegen Sie die Maus mit Plattendeckel aus dem 10fach-Objektiv. Falten Sie eine Ecke von einem Papiertuch eine dünne und feine Spitze zu machen und verwenden Sie es sorgfältig die Saline auslöschen um die CA (CA vermeiden berühren) sowie in anderen Orten im Operationsfeld. Dies ist wichtig , Verdünnung der verwendeten FeCl 3 -Lösung zu vermeiden.
    4. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette und ein Stück Filterpapier holen , gesättigt mit FeCl 3 -Lösung und legen Sie sie direkt auf dem CA und halten Sie es vor Ort für 1 min.
      HINWEIS: To Hilfe Visualisierung der Blutkreislauf und Ernte genaue Daten, legen Sie das Filterpapier nahe dem distalen Ende des freiliegenden CA (Abbildung 3I) und ein kurzes Segment am proximalen Seite (grüner Pfeil in Abbildung 3I) lassen für die Beobachtung der Blutfluss zu spät Phase (siehe unten).
    5. Entfernen Sie das Filterpapier (dieser Zeitpunkt wird als Beginn der "nach der Verletzung" definiert) und spülen Sie die CA mit Kochsalzlösung (mindestens 2 ml).
    6. Setzen Sie die Maus mit Platten Deckel zurück auf die 10X-Objektiv; das Schiff beobachten und aufzeichnen Videobilder zu starten. Schreiben Sie die Video-Frame-Nummer am Ende der ersten Minute der Aufnahme nach unten.
      HINWEIS: Die Thrombusbildung wird durch Akkumulation der fluoreszierenden Thrombozyten identifiziert, die in Echtzeit von Videobildern auf dem Bildschirm oder unter dem Mikroskop beobachtet wird. Nehmen Sie Videobilder direkt nach der Maus wieder unter die Lupe zu nehmen. Halten der Aufnahme zu dem Ende der ersten Minute nach dem Entfernen filter Papier. Beobachten Sie das gesamte Gefäß von dem distalen zu den proximalen Websites Informationen über die Verletzung zu erhalten, und dann konzentrieren sich auf den Bereich von Interesse (in der Regel ist das Zentrum des verletzten Bereich) für weitere Bildgebung.
    7. Record Videobilder für 10 sec pro Minute für die ersten 10 min (beispielsweise von 2.55 Uhr bis 03.05 Uhr) und dann 10 sec jede Minute bis zum Ende des Experiments. Notieren Sie sich die Rahmennummern nach unten, wenn jeder Aufnahme beendet wird.
      HINWEIS: Die Endpunkte des Modells sind: 1) wenn der Blutfluss wurde für> 30 Sekunden aufgehört; oder 2) wenn Okklusion nicht in 30 Minuten nach der Verletzung gesehen. In diesem Fall verwenden 30 min für die statistische Analyse. Stellen Sie Belichtungszeit der Videoaufzeichnung als 10 ms am Anfang, so wird es leicht sein, den Blutfluss über die Thromben zu beobachten. Wenn die Thromben groß werden und die Fluoreszenz sättigt dem Sensor der Kamera wird es schwierig, den Blutfluss über Thromben zu identifizieren. Um dieses Problem zu lösen, bewegen Sie den Imaging-center zum proximalen heil Website (Abbildung 3I, grüner Pfeil) , wo der Blutfluss noch deutlich beobachtet werden kann. Wir erhöhen auch die Expose Zeit auf 15 oder 20 ms, wenn am proximalen un-verletzten Stelle konzentriert, so kann der Blutfluss deutlicher beobachtet werden. Wenn der Blutfluss aufhört, zahlreiche größere Zellen (Leukozyten) beginnen an der Gefäßwand an dem proximalen Stelle des Thrombus zu rollen. Fluss stoppt der Regel innerhalb von 2 bis 3 Minuten nach dem Auftreten der großen Zellen. Notieren Sie sich die Expose Zeit auf dem Aufzeichnungsblatt, wenn es geändert wird. Es dauert in der Regel ca. 30 min von der Anästhesie bis zum Ende des Experiments, wenn die normale Wildtyp C57Bl6 Mäuse verwendet wurden.
      VORSICHT HINWEIS: Verwenden Sie die weiße aggregierten Blutplättchen Gerinnsel nicht als Zeichen des Blutflusses Einstellung, die keine genaue Daten geben , und es wird durch die Belichtungszeit beeinflusst. Der weiße Gerinnsel bedeckt das Gefäßlumen bedeutet nicht, den Blutfluss nicht mehr (siehe die repräsentative Video 1).
      8. , einschläfern die Mäuse mit Überdosis Ketamin / Xylazin (200/20 mg / kg), gefolgt von Genickbruch nach keinen Atem und Herzschlag bestätigt.

3. FeCl 3 Induced Mesenterialarterie / Vein Thrombosis Modell

  1. Anesthetize 8 bis 12 Wochen alten C57Bl6 Mäuse als 2.1.1 in Abschnitt erwähnt. Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  2. Injizieren Papaverine Lösung (insgesamt 0,4 mg / Maus) intraperitoneal Darmperistaltik zu hemmen.
  3. Entfernen Sie Fell am Hals und Bauch mit einem Tier elektrische Klipper. Enthaarungscreme ist nicht erforderlich.
  4. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf dem Deckel 15 cm Gewebekulturplatte. Verwenden Sie vier Stücke von kleinen Band (2 cm x 0,5 cm), um alle Beine zu sichern. Verwenden Sie ein 4 -0 Naht um die Schneidezähne zu wickeln, kleben Sie die beiden Enden des Fadens an dem Deckel den Hals gerade zu halten (Abbildung 2).
  5. Befolgen Sie die Anweisungen 2.1.4 -2.1.15 die Halsvene zur Injektion von Rhodamin 6G Etikett Blutplättchen zu belichten.
  6. Führen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut von xiphoid zu Unterbauch der chirurgischen Schere (4A). Pick - up die Mitte Peritoneum (auch genannt linea alba, 4A, Pfeil) mit Graefe Zange, die klar ist und keine Blutgefäße, heben Sie etwa 2 - 3 mm hoch, bestätigen keine Darm unter der Schnittlinie, und schneiden Sie das Peritoneum geöffnet in längs~~POS=TRUNC mit den feinen Schere (4B).
  7. Wieder sichern die Mäuse nach rechts Seitenlage. Setzen Sie den Halbkreis Agarose - Gel nahe dem Bauch, und exteriorisieren sanft den Darm und breitete sie auf der Oberseite des Gels mit den Graefe Zange (4C). Verwenden Sie die zweite Zweige für die Thrombose - Experiment (4C, Pfeil).
    HINWEIS: Verwenden Sie die hemostat oder Micro-Adson Pinzette den Darm zu exteriorisieren zu helfen. Vermeiden Sie die verletzenDarm und das Gefäß.
  8. Platz 5 - 6 Tropfen Kochsalzlösung, die Feuchtigkeit des Darmes und der Behälter zu halten. Übertragen Sie die Maus mit dem Plattendeckel zusammen mit dem Mikroskoptisch und in geeignete Position unter dem 10X trockenen Linse.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein trockenes Objektiv , weil die jejunoileal Membran nicht Salzlösung aufnehmen kann. Stellen Sie sicher, Salzlösung auf den freiliegenden Gewebe fallen sie feucht zu halten.
  9. Blot, der die Salzlösung rund um die mesenterischen Arterie und Vene vor der Behandlung.
  10. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette , um ein Stück Filterpapier holen , gesättigt mit 12,5% FeCl 3 -Lösung und legen Sie sie direkt auf die mesenteriale Arterie und Vene für 1 min (4D). Entfernen Sie das Filterpapier (dieser Zeitpunkt wird als Beginn der "nach der Verletzung" definiert) und spülen Sie die verletzte mesenteric Arterie und Vene mit Kochsalzlösung (mindestens 2 ml).
  11. Setzen Sie die Maus mit Plattendeckel wieder unter dem 10X trockenen Linse; Beachten Sie die Gefäße und beginnen zu record Videobilder wie in 2.2 erwähnt).
    HINWEIS: Die Endpunkte dieses Experiments sind: 1) wenn der Blutfluss wurde für> 30 Sekunden aufgehört; oder 2) wenn Okklusion nicht in 30 min nach der Verletzung gesehen, und in diesem Fall 30 min für die statistische Analyse verwendet werden.
  12. Am Ende des Experiments einschläfern die Mäuse mit Überdosis Ketamin / Xylazin (200/20 mg / kg), gefolgt von Genickbruch nach kein Atem und Herzschlag bestätigt werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Arteria carotis Thrombosis Modell
Bei Mäusen mit C57BL6 Hintergrund empfehlen wir die Verwendung von 7,5% FeCl 3 Behälter für 1 min als Ausgangspunkt zu behandeln. Unter der Behandlung von 7,5% FeCl 3, Grenzen des verletzten Bereich und normalen Gefäßwand werden unter dem Mikroskop (siehe Online - Video - 1) leicht identifiziert, was darauf hindeutet , dass die endotheliale Schicht erheblich ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das FeCl 3 -induzierten Modell ist eines der am häufigsten verwendeten Thrombosemodelle, die nicht nur wertvolle Informationen über genetische Veränderungen auf die Thrombozytenfunktion und Thrombose 7,8,16,19,31-33 liefern kann, kann aber auch ein wertvolles Werkzeug, zur Bewertung der therapeutischen Verbindungen und Strategien zur Behandlung und Prävention von Krankheiten atherothrombotic 11,17,34-37. Hier haben wir unsere Modifikationen und Verfeinerungen dieses Modells gezeigt und z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) der National Institutes of Health unter den Preisnummern R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) und R01 HL098217 (PI: Nieman) unterstützt. Der Inhalt dieser Veröffentlichung liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chirurgische Schere - WolframkarbidFeinmechanik-Werkzeuge 14502-14
Micro-Adson-Pinzette zum Schneiden und Halten von Haut - gezackt/gerade/12 cmFine Science Tools 11018-12- und Haltehaut
Metzenbaum Fino Schere - Wolframcarbid/Gebogen/Blunt-Blunt/14,5 cmFine Science Tools 14519-14   zum Präparieren und Trennen von Weichgewebe
Ultrafeines Hämostat - Glatt/Gebogen/12,5 cmFeinwissenschaftliche Werkzeuge 13021-12zum Präparieren und Trennen von Weichgewebe
Graefe Pinzette - gezahnt/gerade/10 cmFine Science Tools 11050-10zum Präparieren und Trennen von Weichgewebe
Dumont #5 Feine Pinzette - Biology Tips/Straight/Inox/11 cmFine Science Tools 11254-20 Isolieren Sie das Gefäß vom umgebenden Gewebe
Dumont #5XL Pinzetten - Standardspitzen/Gerade/Edelstahl/15 cmFine Science Werkzeuge 11253-10Gefäß aus umgebendem Gewebe isolieren
Stumpfer Haken - 12 cm/0,3 mm SpitzendurchmesserFine Science Tools 10062-12Gefäß aus umgebendem Gewebe isolieren
Castroviejo Mikro-NadelhalterFine Science Tools 12061-02Nadelhalter
Nahtfaden 4-0Fine Science Tools 18020-40Zur Fixierung der Schneidezähne an der Platte
Nahtfaden 6-0Fine Science Tools 18020-60Für alle chirurgischen Eingriffe und Ligaturen
Kalt NahtnadelnFine Science Tools 12050-03
Rhodamin 6G Sigma83697-1GZur Leberthrombozyte
FeCl3 (wasserfrei)Sigma12321Zur Induktion von Gefäßverletzungen
PapaverinhydrochloridSigmaP3510Zur Hemmung der Darmperistaltik.
Medline Sterilisation von chirurgischen Instrumenten Dampf-Autoklaven-BänderMedline111625Um die Maus auf der Platte zu befestigen
Fisherbrand™   Spritzenvorsatzfilter - steril 0,22 & Mikro; mFisher09-720-004Zur Stereolisierung von Lösungen, die Mäusen injiziert werden
Fisherbrand™   Spritzenvorsatzfilter - steril 0,45 &Mikro; mFisher09-719DZur Filterung der FeCl3-Lösung
Steriles Alkohol-VorbereitungskissenFisher06-669-62Zur Sterilisation der Operationsstelle
Agarose BioExpressE-3120-500Zur Herstellung von Geltischen
Leica DMLFS, FluoreszenzmikroskopenLeicaIntravital-Mikroskopen
GIBRALTAR-Plattform und X-Y-Tischsystem mit angebrachter Heizplatte.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix Version 3.17.2 SoftwareNorPixhttps://www.norpix.com/
Schnitt, , ,

Referenzen

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Eisenchlorid ThromboseHalsschlagader ModellIntravitalmikroskopieThrombozytenaktivierungThrombusbildungGef verletzungAntikoagulanzienThrombozytenaggregationshemmerRhodamin 6G MarkierungPAR4 Antik rper
Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.