Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.
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Methodenartikel
Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kleine RNA-Therapien, die auf Postintegrationsschritte im HIV-1-Replikationszyklus abzielen, gehören zu den Top-Kandidaten für die Gentherapie und haben das Potenzial, als medikamentöse Therapien für HIV-1-Infektionen eingesetzt zu werden. Zu den Postintegrationsinhibitoren gehören Ribozyme, kurze Hairpin-RNAs (sh), kleine interferierende (si) RNAs, U1-Interferenz-RNAs (U1i) und RNA-Aptamere. Viele von ihnen wurden mit Hilfe von transienten Co-Transfektionsassays mit einem HIV-1-Expressionsplasmid identifiziert, und einige sind in klinische Studien übergegangen. Zusätzlich zu den Wirksamkeitsmessungen wurden kleine RNAs auf ihr Potenzial untersucht, die Expression menschlicher RNAs zu beeinflussen, das Zellwachstum und/oder die Zelldifferenzierung zu verändern und angeborene Immunantworten hervorzurufen. In den hier beschriebenen Protokollen wird eine Reihe von transienten Transfektionsassays beschrieben, die zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen entwickelt wurden, die auf Postintegrationsschritte im HIV-1-Replikationszyklus abzielen. Wir haben diese Assays verwendet, um neue Ribozyme zu identifizieren und das Format von shRNAs und siRNAs zu optimieren, die auf HIV-1-RNA abzielen. Die Methoden bieten eine schnelle Reihe von Assays, die für das Screening neuer Anti-HIV-1-RNAs nützlich sind und für das Screening anderer Postintegrationsinhibitoren der HIV-1-Replikation angepasst werden könnten.
Einleitung
Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T - Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 - Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie 1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen 3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 - Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation 4.....
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Protokoll
1. Zellen und Transfektionen
- Kultur HEK 293T Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. Vorbereiten eines 2 x 10 5 Zellen / ml - Suspension in dem Zellkulturmedium. In 500, 100 und 1000 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung von 24-Well, 96-Loch - und 12-Well - Platten, die für die virale Produktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays, bzw. (2A).
- Vorsichtig schwenken die Platten und inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Wachsen Zellen zu 50-70% Konfluenz.
- Nach einer Transfektion ....
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Ergebnisse
Eine allgemeine schematische Darstellung der Verfahren ist in Figur 2 mit einem Beispiel der Transfektion Plan für drei Test RNAs und einer Steuer RNA bereitgestellt in 2B gezeigt. Für die virale Produktion und Zelllebensfähigkeitstests, die Auslese für jedes Testkonstrukt wird auf eine negative Kontrolle normalisiert. Replikate werden in Sätzen transfiziert, so daß jeder Test RNA an seinen benachbarten negativen Kontrolle normiert. Dies geschieht, um un.......
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Diskussion
Die HIV-1 - Produktion beschriebenen Assay wurde unter Verwendung von HEK293T - Zellen (Figur 2) durchgeführt und ist ähnlich Assays verwendet HIV-1 - RNA für eine effektive Ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30 und U1i RNA 11,31 Zielstellen zu screenen. Mit Hilfe verschiedener Methoden HIV-1-Produktion zu quantifizieren, wurden die meisten Studien virale Produktion 48 Stunden nach der Co-Transfektion eines HIV-1-Expressionsplasmid mit Kandidaten RNAs gemessen. Na.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die vorgestellten Arbeiten wurden von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt (gewährt DCB-120266, PPP-133377 und HBF-348967 zu AG).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Zellkulturplatten, 96 Well, 24 Well, 6 Well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Mikroröhrchen Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Niedermolekulares Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | Transfektionsreagenz für synthetische RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | Transfektionsreagenz für RNA-Expressionsplasmide |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| Poly(A)-RNA-Template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| Oligo(dT)12-18 DNA-Primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE Filtermat Papier | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Mikrotiterplatten-Szintillationszähler | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Mikrotiterplatten-Spektralphotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysepuffer Tabletten | Roche | 4693159001, 4906837001 | Protease- und Phosphatase-Inhibitoren |
| Mikrozentrifuge Eppendorf | 5415R | ||
| Bradford-Reagenz | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel-Laufkammer | Hoefer | SE600 | |
| Halbtrockene Transferzelle | Bio-rad | 1703940 | |
| Proteinleiter EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrozellulosemembran | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antikörper-Stripping-Lösung | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| ADAR1 Antikörper | von Dr. B.L. Bass | ||
| Phospho-T446-PKR Antikörper | Abcam | ab32036 | |
| Phospho-S396-IRF3 Antikörper | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR Antikörper | von Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 Antikörper | Cell Signaling | 11904 | |
| Aktin Antikörper | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-markierte Ziegen-Anti-Kaninchen | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-markierte Ziegen-Anti-Maus | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
Referenzen
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
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Nachdrucke und Genehmigungen
