Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus Und andere Vibrio Arten

Summary

Der Nachweis und die Isolierung klinisch relevanter Vibrio-Spezies erfordern selektive und differentielle Kulturmedien. In dieser Studie wurde die Fähigkeit eines neuen chromogenen Mediums zum Nachweis und zur Identifizierung von V. parahaemolyticus und anderen verwandten Spezies untersucht. Es wurde festgestellt, dass das neue Medium eine bessere Sensitivität und Spezifität aufweist als das herkömmliche Medium.

Abstract

Lebensmittelbedingte Infektionen in der durch Vibrio - Spezies verursacht USA haben einen Aufwärtstrend gezeigt. In der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus verantwortlich für die meisten Vibrio -assoziierten Infektionen. So präzise Differenzierung zwischen Vibrio spp. und Detektion von V. parahaemolyticus ist von entscheidender Bedeutung für die Sicherheit unserer Nahrungsmittelversorgung zu gewährleisten. Obwohl molekulare Techniken immer häufiger sind, kultur je Methoden sind immer noch routinemäßig durchgeführt, und sie sind unter bestimmten Umständen von Standardmethoden in Betracht gezogen. Daher wurde eine neue chromogene Agarmedium mit dem Ziel untersucht , eine bessere Methode zur Isolierung und der Differenzierung von klinisch relevanten Vibrio spp bereitzustellen. Das Protokoll verglichen , um die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze für die Detektion von V. parahaemolyticus zwischen dem neuen chromogenes Medium und einem herkömmlichen Medium. Verschiedene V. parahaemolyticus - Stämme (n = 22) rediverse Serotypen und die Quelle der Herkunft präsentiert wurden verwendet. Sie waren zuvor von der Food and Drug Administration (FDA) und Centers for Disease Control and Prevention (CDC) identifiziert und weiter in unserem Labor von TLH -PCR verifiziert. In mindestens vier getrennten Versuchen wurden diese Stämme auf dem chromogenen Agar und Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose (TCBS) Agar beimpft, die die empfohlene Medium zum Kultivieren dieser Spezies ist, gefolgt von einer Inkubation bei 35-37 ° C für 24 -96 h. Drei V. parahaemolyticus - Stämme (13,6%) wuchs nicht optimal auf TCBS, dennoch zeigte grüne Kolonien , wenn es Wachstum war. Zwei Stämme (9,1%) brachte nicht die erwarteten Cyan Kolonien auf dem chromogenen Agar. Nicht V. parahaemolyticus - Stämme (n = 32) wurden auch die Spezifität des chromogenen Agar zu bestimmen getestet. Unter diesen Stämmen wuchsen, 31 nicht oder anderen Morphologien Kolonie ausgestellt. Die mittlere Rückgewinnung von V. parahaemolyticus auf der chromogenic Agar war ~ 96,4%, bezogen auf CASO-Agar mit 2% NaCl ergänzt. Im Ergebnis ist die neue chromogene Agar ein effektives Medium V. nachzuweisen parahaemolyticus und es von anderen Vibrionen zu unterscheiden.

Introduction

Als Mitglied der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus ist ein Gram-negative, nicht-sporenbildende, gekrümmte, stabförmiges Bakterium. Es weist eine hohe Beweglichkeit in sowohl flüssigen als auch halbfesten Umgebungen. Die meisten V. parahaemolyticus Stämme sind nicht pathogen für den Menschen, aber die pathogenen Subtypen Epidemien und Pandemien verursacht, daher ist diese Spezies als ^1,2 ein wichtiges Lebensmittel übertragene Erreger in vielen Ländern zu sein. Die Inzidenz von Vibrio - Infektion in den USA hat sich seit dem Jahr 2000 ³ einen Aufwärtstrend gezeigt. Unter Vibrio spp., V. parahaemol....

Protocol

1. Medien und Anzucht von Bakterienstämmen

HINWEIS: Die Verwendung aseptischer Techniken in allen Experimenten. Verwenden Sie sterile Materialien. Sterilisieren alle Behälter, Geräte und Reagenzien vor der Verwendung. Autoklav alle Abfälle vor der Entsorgung, da sie biologisch gefährlichen betrachtet werden. Autoklaventemperatur und Zeitkombination ist ≥121 ° C x ≥15 min für alle folgenden Verfahren.

1. Um ~ 1-L CASO-Agar (TSA), fügen Sie zuerst 1 L VE-Wasser in einem 2-L-Erlenmeyerkolben einen magnetischen Rührstab enthält. Verwenden einen Kolben, der mindestens zwei Mal größer ist als das Endvolumen ist. In 30 g tryptische Sojab....

Results

In dieser Studie wurden 54 Mikrobenstämme zusammengebaut, das in der V. 22 - Stämme enthalten parahaemolyticus Spezies Vibrio 19 andere Arten und 13 nicht Vibrio - Spezies (Tabelle 1). Die meisten V. parahaemolyticus Stämme wurden entweder von der FDA, CDC oder anderen staatlichen Gesundheitsbehörden erhalten. Sie stellen diverse Serotypen und Isolation Quellen. Diese Stämme wurden zuvor von den Aufsichtsbehörden identifiziert.......

Discussion

Diese Studie konzentriert sich auf Kulturmedien Entwicklung und Evaluierung. Herkömmlicherweise TCBS ist die selektive und Medium zur Isolierung und Detektion V. Differential verwendet parahaemolyticus, V. cholerae und V. vulnificus ^12. Es wurden jedoch Einschränkungen berichtet V. für dieses Medium, wie die Unfähigkeit , zu differenzieren cholerae aus anderen Vibrio - Spezies. Sucrose und pH-Indikator sind die Differenzierungsmittel von TCBS. Somit verurs.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz/Equipment
			verwenden
	Fisher Scientific	DF0418-17-7	kann
Mixer			verwenden, um Austernfleisch zu mischen
Generator	Hardy Diagnostics	CN035A	zur Bereitstellung einer mikroaerophilen Atmosphäre; kann
Schokoladen-Agar-Platten	Hardy Diagnostics	E14	kann andere Marken verwenden
Gängige PCR-Reagenzien (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase)	Beliebige		oder PCR-Kügelchen verwenden (Fisher Sci 46-001-014)
Kulturröhrchen	Fisher Scientific	S50712	kann andere Marken verwenden
Eppendorf Röhrchen	Fisher Scientific	S348903	kann andere Marken verwenden
Gel doc	Any
HardyChrom Vibrio Agar Platten	Hardy Diagnostics	G319	Studie bewertet dieses Medium
Inkubator	Beliebig
Impfschleifen	Fisher Scientific	22-363-606	In dieser Studie wurde eine Größe von 10 Mikrolitern verwendet
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212	anderer Marken verwenden
	Alle
PBS	Fisher Scientific	R23701	anderer Marken verwenden
	Fisher	Scientific FB0875713
Pipetten und Spitzen	Alle		sterilisierte Spitzen
Primer für tlh	IDT DNA-Waage
	Alle
Spreader	Fisher Scientific	08-100-11	Perlen können anstelle verwendet werden
Stomacher Mixer	Stomacher	400	Die Proben wurden 30 Sekunden lang bei 200 U/min homogenisiert. Es können auch andere Homogenisatoren verwendet werden.
Sterile Filterbeutel für	Mixer Fisher Scientific	01-812-5
TCBS Pulver	Hardy Diagnostics	265020	Diese Studie bewertet dieses Medium
Thermocycler	Jedes
TSB-Pulver	Fisher Scientific	DF0370-07-5	kann andere Marken
verwenden UV-Betrachtungsschrank	Beliebig		Emittieren langwelliges UV-Licht
Wasserbad	Beliebig
Name	>Quellen	Katalognummer<	>Kommentare
<>Bakterienarten und -stämme
Aeromonas hydrophila	ATCC
Candida albicans	ATCC
Campylobacter jejuni	ATCC
em>Escherichia coli	ATCC
em>Proteus mirabilis	ATCC
em>Pseudomonas aeruginosa	ATCC
em>Staphylococcus aureus	ATCC
Salmonellen Choleraesuis	ATCC
em>Shigella boydii	ATCC
em>Shigella flexneri	>ATCC
Shigella sonnei	>ATCC
em>Vibrio alginolyticus	ATCC
V. cholerae (Serotypen umfassen O139, O1, non O1, El Tor Biovars)	FDA, ATCC
em>V. damsela	FDA
V. fisheri	Environment
V. fluvialis	CDC
V. furnissii	CDC
V. hollisae	FDA
V. metschnikovii	ATCC
em>V. mimicus	FDA
V. parahaemolyticus (Serotypen umfassen O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)	ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus	FDA
V. vulnificus	FDA