Der folgende Bericht beschreibt, wie das Nagetiermodell der nicht-arteriitischen anterioren ischämischen Optikusneuropathie (rNAION) unter Verwendung der entsprechenden Farbstoff-, Kontaktlinsen- und Laserparameter repliziert werden kann. Wir zeigen auch die geeigneten Schritte zur Beurteilung der rNAION-Läsion in vivo auf.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Das Nagetier-Modell der nonarteritic anteriore ischämische Optikusneuropathie (rNAION)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nichtarteritische anteriore ischämische Optikusneuropathie (NAION) ist eine fokale ischämische Läsion des Sehnervs, die 1/700 Personen im Laufe ihres Lebens betrifft. NAION führt zu einem Ödem des Sehnervs, einem selektiven Verlust der retinalen Ganglienzellneuronen (RGCs) und einer Atrophie des Sehnervs. Es wurde ein Nagetiermodell von NAION entwickelt, das die meisten NAION-Merkmale und -Folgen aufweist und sowohl auf Ratten als auch auf Mäuse anwendbar ist. Dieses Modell verwendet eine fokale Laseranwendung mit einer Wellenlänge von 532 nm, um einen photoaktiven Farbstoff, Rose Bengal (RB), zu beleuchten, um Kapillarschäden und Leckagen am anvisierten vorderen Sehnerv (der laminaren Region) zu verursachen. Nach der rNAION-Induktion kommt es zu einer frühen Ischämie des Sehnervs, einem Sehnervenödem und einer intraneuralen Entzündung, gefolgt von selektivem RGC und axonalem Verlust. Da es sich beim Sehnerv um einen Trakt der weißen Substanz des ZNS handelt, ist das rNAION-Modell sowohl auf mechanistische Studien der selektiven Ischämie der weißen Substanz als auch auf neuroprotektive Analysen und kurz- und langfristige Mechanismen der glialen und neuronalen Reaktion auf Ischämie anwendbar.
Einleitung
Nonarteritic anteriore ischämische Optikusneuropathie (NAION) ist eine fokale ischämische Läsion des vorderen Teils des Sehnervs (ON) 1. NAION ist die häufigste Ursache für den plötzlichen Sehnerv im Zusammenhang mit Sehverlust bei Personen im Alter von 50 2. Der Mechanismus wird angenommen , dass ein Kompartment - Syndrom zu sein , die in intraneuralen Ödem führt, und eine Kompression der Kapillaren die Axone im Sehnerven Versorgung 3.
Da die tatsächlich auf das zentrale Nervensystem (ZNS) Trakt ist, kann das Nagetier NAION (rNAION) Modell verwendet werden, um die Mechanismen und Reaktionen auf isolierte CNS weißen Substanz Hübe zu studieren. Das rNAION Modell kann daher sinnvoll sein, viele Probleme in Sezieren zu weißen Substanz mit Schlaganfall im Zusammenhang mit Schäden verbunden. Es kann verwendet werden, um verschiedene neuroprotektive Strategien und Mittel in der weißen Substanz Schlaganfall zu bewerten.
Eines der attraktivsten Merkmale des Modells ist, dass esschmerzlos, nicht-invasive Verfahren. Die Laserleistung kann eingestellt werden, um verschiedene Grad der ischämische Schädigung zu erzeugen. Ein weiteres Merkmal ist, dass es auf der laserinduzierten Superoxid-Radikalen beruht, um die Kapillarendothels zu beschädigen, eine progressive Dysfunktion Kapillare zu erzeugen. Es ist diese Funktionsstörungen und progressive Ödeme, die mit dem Mechanismus zu sein bemerkenswert ähnlich angenommen wird, dass NAION verursacht. Die Forschung hat gezeigt , dass es keine direkte kapillare Gerinnungs verursacht, sondern arbeitet durch mindestens zwei Mechanismen: Superoxid - induzierten Tod und Abstreifen eines Teils der kapillaren Endothelzellen 4 und NFkB (nuclear factor kappa-Leichtketten-Enhancer von aktivierten B - Zellen mit) in verbleibenden Endothel Entzündungshochregulierung zugeordnet ist , 5 den Fluidtransport durch die Zellmembranen in das Interstitium erhöht. Die Schließung der Sehnerv Kapillaren und Kompression von interstitieller Flüssigkeit Akkumulationsergebnis in Sehnervenkopf Ischämie verursacht. Ein schematisches Bild gezeigt inFigur 2. Das rNAION Modell kann in beiden Spezies Ratte und Maus 6,7, verwendet werden und kann in der Ebene seiner Schwere variieren, aus einer leichten Läsion zu einem vollständigen, aber schmerzlos Zerstörung des Sehnervs und der Netzhaut, wie beispiels als zentrale Retinaarterienokklusion (ZAV).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
(; Baltimore, MD, USA IACUC) Dieses Protokoll wurde von der University of Maryland Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss genehmigt
1. Experimenteller Aufbau
- Machen Sie eine kundenspezifische Kontaktlinse aus einem klaren optischer Qualität Kreis 7 mm Durchmesser Plexiglas, 3 mm Dicke. Schneiden Sie die Rundlinsen mit einer Bohrmaschine. Verwenden Sie ein Standard-Bohrer, um die innere Kurve machen und polieren schließlich die äußeren und inneren Kurven eine Kontaktlinse Polierer ultrafeiner Körnung mit (1000/3000).
- Bereiten 2,5 mM Bengalrosa (RB) in pH 7,4 Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) im Voraus, Sterilisieren Filter mit einem 0,45-Mikron-Spritzenfilter und Speicher 1 ml Aliquots in 20 ° C in einem lichtdichten Behälter für bis zu 6 Monate.
HINWEIS: Die Verwendung von Albino outbred männlichen Tieren, wie Sprague Dawley minimiert die Belastung abhängige Antwort Unterschiede ermöglicht leichtere Induktions und reduziert die Variabilität, die mit der Brunst cycli auftreten kannng weiblich. - Richten Sie verdoppelt die Frequenz Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat (Fd-YAG) ophthalmische medizinische Laser, der eine 532 nm Laserlicht erzeugt. Montieren Sie den Laser auf einem Haag-Streit ophthalmologischen Spaltlampe ein Standard-ophthalmologischen Laser-Adapter. Das im Handel erhältliche Gerät ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung des Auges und der Laserpunkt Anwendung des Tieres. Der medizinische Laser hat auch einen Zielstrahl für die richtige Fokussierung und Zentrierung mit gleichen Punktgröße wie Laserinduktion. Laser Leistungsparameter sind wie folgt:
- Für Ratte rNAION Induktion: Verwenden Sie 500 um Spotgröße / 50 mW Laserleistung / 1.000 ms Dauer / 1.000 ms Intervall.
- Für Maus rNAION Induktion: die Punktgröße auf 300 & mgr; m für kleinere Papille ändern und andere Parameter, die die gleiche wie die Ratte Einstellung verlassen.
- Verwenden Sie regelmäßig ein Laserleistungsmesser der Laserleistung zu gewährleisten.
2. Experimentelles Verfahren
- Schalten Sie die Laserleistungund stellen Sie den entsprechenden Laserparameter auf. Erwärmen Sie den Laser für mindestens fünf Minuten vor dem Gebrauch.
- Wiegen Sie das Tier die geeignete Dosis für Ketamin / Xylazin und RB Farbstoff zu bestimmen. Anästhesieren das Tier durch intraperitoneale Injektion einer 1 ml / kg Gemisch von 80 mg / ml Ketamin und 4 mg / ml Xylazin.
- Lassen Sie das Tier in einem beheizten Käfig, bis sie vollständig betäubt. Prüfen Sie, ob keine Antwort auf aversiven Reizen (Schwanz oder Zeh Prise). Überprüfen Sie Tiere für Narkosetiefe alle 10 min.
- Erweitern die Schüler des Tieres mit 1% Tropicamid und betäuben die Oberfläche des Auges mit 0,5% Proparacain. Bei der Verwendung von pigmentierten Tieren, wie Long Evans, ein 2,5% Neosynephrin Augentropfen wird Pupillenerweiterung erhöhen.
- Mit einer Schere die Whiskers nahe der Mündung auf der Seite zu schneiden, um die Ansicht zu vermeiden induziert werden blockiert.
- Geben Sie einen Tropfen von 1% Methylcellulose oder andere ophthalmische Kupplungsabfall an der Innenseite des maßgeschneiderte Kontaktlinse, und wenden Sie dann das Objektiv auf ter Ratte Auge.
- Legen Sie das Tier auf einer Plattform auf die Höhe der Spaltlampe eingestellt. Gesetzt den Kopf des Tieres in einem 45 ° Winkel, so dass sich das Auge an der Spaltlampe und Laserstrahls senkrecht ist.
- Visualisieren Sie das Auge durch die Augenspaltlampe. Stellen Sie sicher, dass der Zielstrahl ist die richtige Größe sowie fokussiert und zentriert direkt auf der visualisierten Sehnerv. Fotografieren Sie das Netzhautfundus eine Digitalkamera mit hoher ASA mit (1200 - 2000) auf einem der Okulare der Spaltlampe mit einem Maß Adapter montiert Geschwindigkeit.
HINWEIS: Die Fähigkeit, die Choroidealgefässe zeigt die Transparenz der Netzhaut zu sehen. Dies ist ein wichtiges Zeichen, um später retinaler Ischämie zu erkennen zu können, was die Interpretation verwechseln kann, wenn sie auftritt. rNAION ist Sehnerv Ischämie, die in isolierten RGC Verlust führt, während retinaler Ischämie führt zu Schädigungen der Netzhaut alle Zellen der inneren Netzhautschichten zu beeinflussen. - Optional können weitere Bild der Netzhaut undSehnerv einen Spektralbereich-optischen Kohärenztomographen (SD-OCT 8) unter Verwendung der nichtinduzierten Auge zu evaluieren. Scannen en face (3B) sowie 7 Querschnitts Scans durch die Retina (3C). Die SD-OCT-Bildgebung verwendet die gleiche Kontaktlinse für die Laser-Induktion eingesetzt.
- Injizieren von 1 ml / kg RB intravenös durch die Schwanzvene, und warten Sie für 30 Sekunden, dann aktivieren Sie die Laserleistung. Diese Zeitverzögerung ermöglicht die RB gleichmäßig in der Zirkulation zu verteilen. Wir verwenden einen 50 mW Laserpuls an einem s / Puls. Größere Energien (≥ 60 mW) können die Netzhaut schädigen oder retinale vaskuläre Ischämie verursachen.
Achtung: Stellen Sie sicher , dass jeder hat ein Paar von Laserschutzfiltergläser der entsprechenden Sperr Wellenlänge Streu Eingabe Laserlicht Ermittler Auge zu verhindern.
HINWEIS: Die Laser Verabreichung rasch nach der IV RB Injektion verabreicht werden muss, da der Farbstoff schnell aus dem Kreislauf eliminiert wird. Je länger die Laserinduzierung, desto schwerer der Sehnerv Ischämie. 12 sec Impulse in schneller Abfolge - In der Regel werden die Tiere 7 angegeben. Der Kontakt des Laserlichts mit dem zirkulierenden Farbstoff gibt den Sehnerv Gefäße einen schönen goldenen Glanz, der durch die Spaltlampe (4B) zu sehen ist. Dies erweist sich der Farbstoff systemisch injiziert und in den Blutstrom verteilt. Wenn die Glut schwach ist, oder gar keine (4A) wurde der Farbstoff nicht intravenös injiziert. In diesem Fall wird keine zweite Injektion sofort geben, da das Tier für mindestens zwei Tage vor Reinjektion erholen müssen. - Unmittelbar nach der Induktion, entfernen Sie die Kontaktlinse. Decken Sie beide Augen mit Augen Triple-Antibiotikum (Neosporin / Polymyxin / Bacitracin) Salbe mit Dexamethason, und legen Sie das Tier auf einem 37 ° C Erwärmung Pad in einem einzigen untergebracht Käfig unter strenger Beobachtung bis zur vollständigen Genesung.
- Reinigen Sie die Kontaktlinse mit destilliertem water und für die zukünftige Verwendung mit einem nicht scheuernden Reinigungstuch trocken wischen.
- Zwei Tage nach der Induktion bewerten den Sehnerv Ödem sowohl Fundus Farbfotografie und SD-OCT - Analyse 8.
HINWEIS: Um den Grad der Sehnerv Ödem gibt Ischämie eine Abschätzung der Schwere des Sehnervs Vergleich. An zwei Tagen wird der Sehnerv Scheibe Rand unscharf, und die Netzhautvenen leicht erweitert werden, im Vergleich mit der Gegenseite (un-induzierten) Auge. Führen Sie Elektroretinogramm (ERG) und Flash - visuell evozierten Potential (VEP 11) auf zwei und vier Wochen nach der Induktion für die Elektroanalyse.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Kontaktlinse freigegeben zentralen Netzhaut Visualisierung (Abbildung 1). Der Schwerpunkt Laserspot beleuchtet die Papille auf der Rückseite der Netzhaut (Abbildung 2). Die normale un induzierter Netzhaut wird durch Spaltlampen - Biomikroskop (3A) und SD-OCT (3B und 3C) abgebildet gezeigt. Beim Laserinduktion, wenn kein Farbstoff in dem Kreislauf vorhanden ist, wird Laserlicht führen nicht in Gefäß und Platten ...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Zwar gibt es eine Reihe von Modellen der Schädigung des Sehnervs (Sehnerv Crush 12, Sehnervdurchtrennung 13 und PION 14) sind, ist das rNAION Modell humane, anpassungsfähig sowohl an Ratten und Mäusen. Es ähnelt mehr dem menschlichen klinischen Zustand von NAION. Dieser Zustand beinhaltet progressive anterioren Sehnerv Ödem, eine vordere Sehnerv Kompartmentsyndrom, fokale axonalen Ischämie, isoliert retinaler Ganglionzellen axonalen Schäden und Verluste über einen längeren Zeitverlauf. D...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken den vielen Studenten und Stipendiaten, die auf diesem Modell gearbeitet haben, um ihre Wirksamkeit zu verbessern und ihre Mechanismen zu verstehen. Ein besonderer Dank an Dr. gebührt. Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY) und Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Paris, Frankreich). Diese Studie wurde teilweise durch RO1 EY015304 zu SLB finanziert.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 50 mW 532 nm Laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm Laser | Laserglow Technologien | Ersatz für Iridex | |
| Laser Spaltlampenadapter | Iridex | SMA gekoppelter Adapter für Laserausgabe | |
| Coherent Fieldmate Lasermessgerät mit Thermosäulensensor | Coherent | andere auch passend | |
| Ophthalmic Examing Spaltlampe Biomikroskop | Verschiedene | Haag-Streit ist das Beste; billigere Versionen bei ebay erhältlich | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinduzierendes Mittel |
| Fundus Kontaktlinse oder Glasdeckglas | Custom / Cantor und Nissel (UK) | Speziell entwickelte plankonvexe Kunststofflinse für die Augenuntersuchung und Induktion | |
| Tropicamid 1% | |||
| Tamiya Polierpaste | Tamiya, INC | 87068 | Polierkontaktlinse |
| 2,5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | Kontaktlinsen-Kopplungsmittel | |
| 2,5% Neosynephrin Ophthalmische Tropfen | Alcon Labs | Pupillenerweiterungsmittel | |
| Tropicamid 1% | Alcon Labs | Pupillenerweiterungsmittel | |
| 0,5% Proparacain | Alcon Labs | topisches Anästhetikum | |
| 30 G Insulinspritze mit verschmolzener Nadel | Verschiedenes | zur | intravenösen Injektion von Rose Bengal |
| Ophthamic Antibiotika-Salbe mit Dexamethason hinzugefügt (Dreifach-Antibiotikum-Salbe) | Verschiedenes | Verschiedenes | Nach Induktion auftragen, um die Hornhautvernarbung zu minimieren |
| Heidelberg Corporation Spektralbereich-Optischer Kohärenztomograph | Heidelberg Corporation | Für optische Kohärenzmessungen zu Beginn und nach der Induktion; für die Induktion nicht erforderlich |
Referenzen
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222(2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934(2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241(2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
