Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Summary

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Abstract

Obwohl ambulant erworbener Pneumonie ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit bleibt, haben murine Modelle von bakteriellen Pneumonie kürzlich signifikante präklinische Fortschritte in unserem Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Pathogenese erleichtert. In - vivo - Maus - Modellen der integrierten Physiologie und Widerstandsfähigkeit des Wirtsabwehrreaktion erfassen in eine Weise , die nicht durch alternative, vereinfachte ex - vivo - Ansätze offenbart. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für intrapulmonale Inokulation von Bakterien in Mäusen, einschließlich Aerosolisierung, intranasale Verabreichung, perorale endotracheal Kanülierung unter "blind" und visualisiert Bedingungen und transkutane endotracheal Kanülierung beschrieben. Alle Methoden haben relativen Vorteile und Einschränkungen. Hier beschreiben wir im Detail eine nicht-invasive, technisch nicht-intensiven, kostengünstige und schnelle Methode zur intratrachealen Lieferung von Bakterien , die Aspiration (dh Inhalation) von der Maus umfassteines infektiösen Inokulum in den Mund-Rachenraum während unter Vollnarkose pipettiert. Dieses Verfahren kann für die pulmonale Abgabe einer großen Vielzahl von nicht-ätzenden biologischen und chemischen Mitteln verwendet werden, und ist relativ leicht zu erlernen, auch für Labors mit minimaler Erfahrung mit pulmonaler Verfahren. Neben der Aspirationspneumonie Methode beschreiben wir auch die nachfolgende zum Testen in vivo pulmonalen angeborenen Immunantwort der Maus, insbesondere Verfahren zur Quantifizierung von bakteriellen Clearance und die zelluläre Immunantwort des infizierten Atemwegs Schritt- für -Schritt - Verfahren bereitzustellen. Dieses integrierte und einfache Ansatz zu einer Lungenentzündung Beurteilung ermöglicht eine schnelle und robuste Bewertung der Wirkung von genetischen und Umwelt Manipulationen auf Lungen angeborenen Immunität.

Introduction

Die ambulant erworbene Pneumonie bleibt die häufigste Todesursache von Infektion in den USA, mit insgesamt nur wenig Veränderung der Sterberaten in den letzten 40 Jahren trotz Verbesserungen bei der Impfung und Antibiotika - Strategien ^1,2. Trotz des Mangels an spürbaren Fortschritte bei der öffentlichen Gesundheit Ebene, in den letzten Jahren dramatisch Fortschritte wurden in unserem Verständnis der molekularen und zellulären Pathogenese der Lungenentzündung, mit vielen dieser Schritte nach vorn gemacht möglich durch die Verwendung von Maus-Modellen der Lungeninfektion gemacht. Die genetische Lenkbarkeit der Maus, die Ähnlichkeit des murinen und humanen Immunsystem und die breite Palette von Maus-bezogenen immunologischer Reagenzien, die kommerziell verfügbar sind, haben zusammen rasche Fortschritte des Feldes erleichtert.

Mausmodelle von bakterieller Pneumonie in der Literatur beschrieben wurden im allgemeinen auf eine von vier technischen Wege zur Pathogen Inokulation verlassen: i) Aerosolisierung; ii) intranasal Lieferung; iii) peroralen Abgabe; und iv) chirurgische intratracheale Injektion (dh Tracheotomie) ^3. Alle Routen der Infektion haben Vor- und Nachteile ^3. Insbesondere bezüglich Exposition der oberen Atemwege, Potenzial für eine Beimischung von oronasal Flora, Anforderungen für die allgemeine Anästhesie, Variabilität der an das distale Lunge zuge Inokulum, lobar Verteilung der gelieferten Erregern, technisches Know-how-Anforderungen und Verfahrens Morbidität variieren stark über diese Ansätze.

Häufig verwendete peroralen Infektion Techniken umfassen über Kanülierung endotracheal (translaryngeale) entweder einen Ansatz "blind" (nicht sichtbar), oder unter direkter Larynx - Visualisierung ^3-5. Beide Methoden, während robust, erfordern erhebliche Ausbildung und auch tragen Risiko von Trauma an der oberen Atemwege. Im vorliegenden Bericht beschreiben wir eine technisch nicht intensiv, nicht-invasive, kostengünstige und schnelle Methode der peroralen Infektion, whiermit Bakterien (Klebsiella pneumoniae in dem gegebenen Beispiel) pipettiert Oropharynx eines betäubten Maus in die Lunge über aspiration geliefert (dh inhalation). Wir und andere haben die Aspirationspneumonie Technik erfolgreich ^6-9 verwendet. Dieses vielseitige und leicht Lungen-Delivery - Methode gelernt kann in die Lunge auf die Lieferung von vielen zusätzlichen nicht-ätzende Mittel erweitert werden, einschließlich Zytokine und andere Proteine, pathogen-assoziierte Moleküle (zB Lipopolysaccharide), Zellen (dh adoptiven Transfer), und Toxine (zB Bleomycin). Zusätzlich wichtigen technischen Überlegungen Erörterung beschreiben wir auch ein integriertes, quantitative Ansatz für die nachfolgende Wirtsantwort auf Pneumonie Beurteilung, einschließlich stromabwärts Messung von bakteriellen Clearance (dh koloniebildende Einheit [CFU] Quantifizierung in der Lunge und peripheren Organen) und Leukozyt Akkumulation im Luftraum.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der US Public Health Service Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren nach Prüfung durch den Animal Care und Use Committee des NIEHS ausgeführt.

1. Herstellung von K. pneumoniae Kultur

Achtung: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) Haube oder andere BSL2 bezeichneten Bereich und entsorgen Abfall pro Institut BSL2-Richtlinien.

1. Für Suspensionswachstum von K. pneumoniae, tauen ein Glycerolstammlösung von Bakterien und eine Arbeitskultur durch die Übertragung von 1 ml K. impfen pneumoniae Lager zu 50 ml tryptische Sojabrühe (TSB) in einem 500 ml oder größere Kolben.
2. Machen Glycerin Aktien durch Zugabe von 900 ul kultivierter log-Phase K. pneumoniae zu 100 ul sterilem Glycerin und Einfrieren bei -20 ° C oder -80 ° C. Für die Langzeitlagerung wird -80 ° C empfohlen.
3. Kultur Bakterien aus step 1.1 durch Schütteln über Nacht Kolben (14 bis 18 Stunden) bei 37 ° C bei 200-225 rpm.In um log-Phase das Wachstum zu fördern, verdünnte 1-5 ml dieser Kultur über Nacht in einen Kolben mit 50 ml TSB am Morgen und unter Schütteln ~ 2,5 h bei 37 ° C zurück.
4. 1 ml der K. pneumoniae Kultur aus dem letzten Schritt in ein 1,5 - ml - Röhrchen und Schleudern bei 7.500 × g für 2 min. Ein weißes Pellet sollte sichtbar sein. Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören, leicht resuspendieren Bakterien mit Pipette in 1 ml steriler Kochsalzlösung, und Spin wieder bei 7.500 × g für 2 min.
   1. Führen Sie diesen Waschschritt 2x, das letzte, gewaschene Pellet in 1 ml steriler Kochsalzlösung gebracht werden.
5. Führen Sie log-weise serielle Verdünnungen von diesem ordentlichen Inokulum. Fügen Sie zum Beispiel 400 & mgr; l des Inokulums in 3,6 ml steriler Kochsalzlösung in Serie eine 10 ^-1 -10 ^-9 Verdünnungsreihe zu machen.
6. Bestimmen Sie die OD ₆₀₀ von gewaschen K. pneumoniae , indem 1 ml der1:10 und 1: 100 Verdünnungen in Einweg - Küvetten und Messen der OD ₆₀₀ zuerst mit steriler Kochsalzlösung Austastung. Messen Duplikaten Genauigkeit sicherzustellen. Eine OD ₆₀₀ von 1,0 entspricht etwa 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml. Man beachte, dass die Beziehung zwischen OD und CFU / ml nicht linear sein kann.
   1. Verwenden Sie die OD ₆₀₀ aus den Verdünnungen Konzentration von K. zu berechnen pneumoniae, Auftragen der OD: KBE / ml Umwandlung oben und Factoring in der Verdünnung.
7. Verwenden Sie die K. pneumoniae Konzentration des gewünschten Inokulum CFU Dosis in einem <100 & mgr; l Volumen für die Lieferung an Mäuse (siehe unten) vorzubereiten.
8. Platte auch 100 & mgr; l von 10 ^-6 bis 10 ^-9 - Verdünnungen und 100 & mgr; l steriler Kochsalzlösung auf einzelne tryptischen Soja - Agar (TSA) Platten bei RT. über Nacht bei 37 ° C inkubieren und Bakterienkolonien, um aufzuzählen, um genaue Konzentration berechnen, die in Experiment verwendet wurde, und für die Kontamination zu kontrollieren.
   HINWEIS: Die tatsächliche Bakterienkonzentration von endgültige Inokulum kann ± 500 KBE / ml, die durch Absorption vorhergesagt. Experimentatoren sollte idealerweise die OD ₆₀₀ bestätigen: KBE / ml Beziehung in Pilotstudien vor in vivo bei Mäusen zu verwenden, empirisch die ₆₀₀ OD Nachstellen: KBE / ml Umsatz bezogen auf ihre persönlichen Erfahrungen.

2. Murine Intratracheale (es) Aspiration von K. pneumoniae aus Oropharynx

1. Stellen Sie sicher, dass Mäuse sind eindeutig durch Schwanz Zeichen, Tätowierung oder einem anderen zugelassenen Kennung identifiziert.
2. Zeichnen Sie up Dosierung Inokulum von Bakterien P200 Pipette vor der Mäuse von Isofluran, um das Entfernen Verfahren zu beschleunigen. Für die besten Ergebnisse mit ihr Bestreben, mit einem Volumen von <100 & mgr; l Überlauf zu verhindern. Hierbei verwenden 2000 CFU / 50 & mgr; l von K. pneumoniae.
3. Anesthetize Mäuse in einer klaren Kammer mit Isofluran - Gas (zB 2% Isofluran bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 l / min) oder per institutional Richtlinien. Die Anzahl der Mäuse, zusammen zu anästhesieren durch Komfortniveau des Experimentators bestimmt, typischerweise 1-2 zu einem Zeitpunkt. Beachten Sie die Atmung und bestätigen Niveau der Anästhesie einmal tief Luft sichtbar und 2-3 Sekunden kann zwischen den Atemzügen gezählt werden.
   HINWEIS: Wenn es Bedenken über mögliche verwirrende Effekte flüchtiger (inhalativen) Anästhetika, kann Anästhesie statt mit intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin erreicht werden. Mit dem oben beschriebenen Verfahren, tiefe Narkose dauert nur wenige Minuten. Wenn mehr verlängerte Anästhesie induziert wird, Augensalbe sollte Augen Austrocknung zu verhindern, verwendet werden.
4. Sobald die Maus betäubt, positionieren Sie es in einer semirecumbent Rückenlage, durch die oberen Schneidezähne aus einem Gummiband aufgehängt gestreckt zwischen Zapfen auf einer schrägen Plexiglasplatte (Abbildung 1).
5. Ziehen Sie vorsichtig mit der Maus Zunge an der Seite mit einem Paar von stumpfen nicht geriffelten Pinzette und Ablagerung Dosis in die Mundhöhle mit einem P200 pipette. Seien Sie vorsichtig zu vermeiden Trauma induzieren entweder auf die Zunge oder Mund-Rachenraum.
6. Während die Zunge zurückgezogen zu halten, sanft die Nase mit einem behandschuhten Finger verschließen, bis die Maus inhaliert. Weiterhin die Nase zu bedecken, bis die Maus genommen hat zwei oder mehrere Inhalationen, und keine Flüssigkeit in die Mundhöhle sichtbar. die Nase Abdeckung hilft sicherzustellen, dass die Maus, um die Bakterien in die Lunge inhaliert wird, als Mäuse Nasenatmer sind.
7. Entfernen Sie die Maus aus der Inokulation Platte und zurück in seinen Käfig, platzieren Sie die Maus auf dem Rücken Betten oder Schmutz zu verhindern, dass die nares blockiert, während die Maus aus der Narkose erholt.
8. Sobald alle Mäuse wurden dosiert und wurden aus der Narkose aufgewacht, Hausmäuse in einer Kabine / Zimmer nur Mäuse enthalten , die mit K. dosiert wurden pneumoniae. Überwachen Mäuse täglich, Körpergewicht , einschließlich , wenn über 48 Stunden nach der Infektion gehen.
9. Verwenden Sie täglich Maische und / oder zusätzliche Wärme, wenn die Mäuse so dass über 48 zu gehen,h.

3. bronchoalveolären Lavage (BALF) Sammlung und Analyse

1. Euthanize Mäuse pro institutionellen Richtlinien. Hier verwenden , um eine tödliche Injektion von 150 mg / kg Natriumpentobarbital oder äquivalente Dosis von kommerziellen Euthanasielösung durch Ausbluten gefolgt, da dies vermeidet mögliche Komplikationen zu den Lungen , die mit CO ₂ -Inhalation und zervikale Dislokation.
2. Position der Maus auf dem Rücken und zu sterilisieren Maus durch Fell mit 70% Ethanol besonders über die Brust und Nackenbereich Spritzen.
3. Machen Sie einen Längsschnitt knapp unterhalb des Brustbeins, dann hält das Brustbein mit einer Pinzette, nick die Membran, so dass die Lunge in die Brusthöhle zu fallen zurück. Schnitt durch den Brustraum auf jeder Seite des Gefßsystems und dann nach oben durch den Hals, Belichten der Trachea.
4. Da die Luftröhre durch Längsmuskeln auf beiden Seiten umgeben ist, vorsichtig durch die Mitte durchgeschnitten und das Gewebe an den Seiten schieben, wie esDies vermeidet die umgebende Gefäß Schneiden, das Blut in die Trachea einführen könnte. Wenn das Gefäßsystem eingekerbt ist, reinigen Sie die Umgebung mit Gaze, bevor die Tracheallumen zu zugreifen.
5. Verwenden chirurgische Scheren oder eine Nadel nick die Trachea über ¼ der Weg nach unten aus dem Kopf und legen Sie eine Kanüle in eine 1-ml-Spritze mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung vorinstalliert angebracht (PBS) kaudal in die Luftröhre. Bei der Verwendung von Mäusen Alter von 8 Wochen oder Frauen <, reduzieren Sie die lavaging Volumen auf 600-800 ul.
6. Schieben Sie das Volumen in die Lunge langsam, so dass alle Lappen aufzublasen und dann das Volumen wieder aus mit der Spritze ziehen, Wiederholung 3x. Wenn PBS wird aus den Nüstern kommt hat die Kanüle nicht weit genug in die Trachea oder Inflation auftritt zu schnell gedrückt worden. Alternativ kann, wenn die Lunge nicht gut aufzublasen, hat sich die Kanüle in zu weit getrieben worden, so leicht zurückziehen.
7. Sammeln Sie gepoolten Waschungen in einem 15-ml-Röhrchen auf Eis.
8. Drehender Luftraum Lavage bei 1.200 × g für 5 min Überstand in ein 1,5-ml-Röhrchen gesammelt und bei -80 ° C einfrieren. Anschließend verwenden Sie den Überstand (dh BALF) zur Messung von Protein, Zytokine und für verschiedene andere biochemische Assays. Das Pellet repräsentiert Zellen aus der bronchoalveolären Raum.
9. Wenn rote Blutkörperchen (RBCs) in dem Zellpellet Grundlage von Farb evident sind, lysieren mit 1 ml Puffer ACK Lyse für 1 min durch Zugabe von 5 ml 1x PBS folgte der Lyse Reaktion zu stoppen, und der Puffer verdünnen. Alle Proben identisch, entweder behandelt oder nicht mit ACK-Lysepuffer.
10. Spin-Zellen bei 1200 × g für 5 min, dekantieren Sie den Überstand und die Zellen in 1 ml 1x PBS bringen.
11. Vortex und Zählen von Zellen auf einem Hämozytometer zur Zählung der gesamten Luftraum Zellen.
12. Basierend auf Dichte der Zellen hinzufügen etwa 80-150 & mgr; l (~ 80 & mgr; l für eine infizierte Maus und ~ 150 für eine naive Maus) zu einer Folie Kammer auf einer Cytospin-Zentrifuge. Spin-Zelles auf Objektträger für die nachfolgende Färbung Zelldifferentialpopulationen zu bestimmen.
13. Lassen Sie Zellen über Nacht Dias zum Trocknen auf. Stain Zellen mit Tri-Färbung (zB Hema 3 [siehe Tabelle]) durch die Schlitten 7 mal in Fixativ getaucht, 9 - mal bei der Flecken 1 und 7 Mal bei der Flecken 2 (keine Spülungen zwischen Flecken) und trocknen lassen. Nach Fleck getrocknet ist, Deck Dias und zählen manuell Differentiale durch Mikroskop. Im Allgemeinen sind Neutrophile und Monozyten / Makrophagen leicht durch ihre Größe und Kernmorphologie aus.

4. Bestimmung bakterielle Belastung in Lunge und peripheren Geweben

1. Vor Beginn: Verdünnungsröhrchen mit 900 ul 1x PBS für Lunge und Milz und 90 ul 1x PBS für Blut vorzubereiten. Kennzeichenschilder für Bakterien und stellen bei Raumtemperatur Kultivierung; Daher wird, sobald Gewebe wurde, wird gesammelt Zeit zwischen Homogenisierung und Überzug für das Bakterienwachstum minimiert werden.
   Hinweis: Aufgrund der heterogenen Deposition von Bakterien in den Lungen, die mit Aspiration auftreten können, wird empfohlen, dass einzelne Mäuse für die Analyse von entweder insgesamt Atemweg Zellularität oder total (bilateral) Lungen bakterielle Belastung verwendet werden.
2. Euthanize die Maus gemäß Schritt 3.1 und anschließend Sammeln von Blut aus dem linken Ventrikel in einen heparinisierten Röhre platzieren Gerinnung zu vermeiden. Entfernen Sie alle Lungenlappen und in einem 15 ml-Röhrchen mit 5 ml 1x PBS, gefolgt von der Entfernung der Milz und Platzierung in 2 ml 1x PBS. Die Röhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, Instrumente zu reinigen mit Ethanol zwischen einzelnen Gewebe / Maus.
3. Homogenisieren des Gewebes auf Eis, vorzugsweise mit Einweg-Homogenisatoren, die zwischen jeder Probe verändert werden kann. Einweg-Homogenisator Tipps können zur Wiederverwendung zwischen den Experimenten autoklaviert werden.
4. Sobald Gewebe homogenisiert wurde, führen Reihenverdünnungen und Platte. Plattenproben eines gegebenen Gewebe / Verdünnung in zweifacher Ausfertigung auf einer einzigen Platte TSA durch eine Trennlinie auf der Kunststoff Zeichnung. Plating und dilution Vorschläge finden Sie weiter unten (in allen Fällen wurden 10 ul Probe wird auf Platte verteilt) und werden auf einer 24 Stunden nach der Infektion der Obduktion basiert. Wenn 48-72 hr Analyse von Proben, eine größere Anzahl von Verdünnungen durch erhöhte Bakterienbelastung zu späteren Zeitpunkten kann es erforderlich sein plattiert.
   1. For Blood - 1:10 verdünnen um 10 & mgr; l Blut in 90 ul sterilem 1x PBS hinzufügen. Platte ordentlich und 1:10 verdünnten Proben in zweifacher Ausfertigung. Sobald Blut überzogen wurde, spinnen Restblut bei 9.300 × g für 10 min Plasma zur Messung von Zytokinen und Chemokinen zu extrahieren.
   2. Für Lung - 1:10 verdünnen - 1: 100 durch Zugabe von 100 & mgr; l der homogenisierten Lunge in 900 ul sterilem 1x PBS seriell. Platte ordentlich Homogenat und alle Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung.
   3. Für Spleen - verdünnen 1: 10-1: 100 durch Zugabe von 100 & mgr; l der homogenisierten Milz in 900 ul sterilem 1x PBS seriell. Platte ordentlich Homogenat und beide Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung.
5. Lassen Brotaufstrichproben kurz trocknen lassen.
6. Invert TSA-Platten und in einen statischen 37 ° C-Inkubator über Nacht.
7. Bestimmen die Anzahl der kolonisierenden Bakterien durch die Bakterienkolonien von beiden Seiten der Platte gemittelt und von jeder Verdünnung. Faktor in den Anfangs Verdünnungen von 5 ml für Lunge und 2 ml für Milz Gesamtgewebe CFUs zu bestimmen.

Results

C57BL / 6 - Mäuse wurden mit 2000 CFU K. infiziert pneumoniae 43816 (Serotyp 2) über Mund - Rachen - Aufnahme in der Lunge. Bei dieser Dosis Mäuse beginnen in der Regel klinische Symptome 12-24 Stunden nach der Infektion einschließlich Lethargie, gekräuselte Fell und Gewichtsverlust von 5-10% (2A) zu zeigen. Innerhalb von 48-72 Stunden nach der Infektion, viele der Mäuse zeigen Symptome der Krankheit und Morbidität, die typischerweise um durchschnittlic...

Discussion

Murine Modelle von bakteriellen Lungenentzündung, die in Partnerschaft mit Gen - Targeting und in - vivo - biologischen und pharmakologischen Interventionen, zur Verfügung gestellt haben kritische Einblicke in die Lungenabwehrreaktion. Große Fortschritte wurden insbesondere in unserem Verständnis der Chemokine und Adhäsionsmoleküle gemacht worden , die ^10,11 Rekrutierung von Neutrophilen auf den infizierten Luftraum beherrschen. In - vivo - Modellen an einer Lungenentzündun...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, Serotyp 2	ATCC	43816
Tryptische Sojabrühe	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Katheter, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Lösung 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Lösung 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixiermittel	Fisher	23-122-929
27½ Messgerät Tuberkulinspritzen	Fisher	14-826-87
Lithium-Heparin-Plasmakollektoren	Fisher	2675187
L-förmige Einweg-Spreader	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7,4	im Haus hergestellt	n/a	Destilliertes Wasser (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK Lysepuffer	im eigenen Haus hergestellt	n/a	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), bis zu 500 ml mit destilliertem Wasser und pH-Wert bis 7,4