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Methodenartikel

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

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⸱

DOI:

10.3791/54525

⸱

13. Oktober 2016

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.

Zusammenfassung

Elektrophysiologische Aufnahmen von Rückenmark Scheiben haben sich als wertvolle Technik zu sein, ein breites Spektrum von Fragen zu untersuchen, die von Mobilnetzwerkeigenschaften. Wir zeigen, wie rentabel schräge Scheiben des Rückenmarks von jungen Mäusen herzustellen (P2 - P11). Bei dieser Herstellung behalten die Motoneuronen ihre Axone von den ventralen Wurzel des Rückenmarks kommen aus. Die Stimulation dieser Axone entlockt zurück ausbreitenden Aktionspotentiale der Motoneuron somas und spannend die Motoneuron Kollateralen im Rückenmark eindringen. Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale ist eine sofortige, endgültige und elegante Art und Weise Motoneuron Identität zu charakterisieren, die andere Methoden Identifizierung übertrifft. Darüber hinaus ist die Motoneuron Kollateralen stimulierenden eine einfache und sichere Weg, um die Sicherheit Ziele der Motoneuronen im Rückenmark, wie andere Motoneuronen oder R zu erregenenshaw Zellen. In diesem Protokoll stellen wir antidrome Aufnahmen von der Motoneuron somas sowie Renshaw Zellanregung aus ventral root Stimulation.

Einleitung

Historisch gesehen , in vivo an großen Tieren wie Katzen oder Ratten Motoneuron Aufnahmen scharf Elektrode 1 wurden durchgeführt , oder auf einem isolierten ganzen Rückenmark in Mäuse 2. Die Entstehung der Patch-Clamp-Aufnahmetechnik in den 1980er Jahren für den direkten Zugriff auf das Motoneuron genannt somas nach Bedarf Abdichtung unter Sichtführung erreicht werden. Somit wurde das Rückenmark slice Zubereitung leicht seit den frühen 1990ern 3 erreicht. Jedoch oft früh slice Zubereitung nicht für die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Nach bestem Wissen und Gewissen, haben nur zwei Studien erfolgreich Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten berichtet, und keiner wurde von den Mäusen 4,5 erhalten.

In diesem Artikel stellen wir eine Technik tragfähige Rückenmarksscheiben neugeborenen Mäusen zu erreichen (P2 - P11) in dem die Motoneuron-Pool seiner ventralen Wurzel abzuweichen Axone beibehält. auslassenral Wurzel Stimulation löst antidromic Aktionspotential aus dem gleichen Ventralwurzel zurück in die Somen des Motoneuron-Pool zu verlassen. Es regt auch die Motoneuron Sicherheiten Ziele, andere Motoneuronen 6-10 und die Renshaw - Zellen 11-13. Da nur Motoneurone ihre Axone die ventralen Wurzeln nach unten senden, verwenden wir die Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale als eine einfache und sichere Weg um physiologicaly Motoneuronen 10 identifizieren.

Neben der Verwendung von potenziell nicht-inclusive oder irreführende elektrophysiologischen und morphologischen Kriterien , um die Motoneuron Identität, die jüngsten Studien über Rückenmark Motoneurone zu bestätigen stützen sich ebenfalls auf mühsame und zeitraubende Post - hoc - Anfärbungen 16. Eine solche Identifizierung wird in der Regel nur durchgeführt mit einer Probe der aufgezeichneten Zellen. Andere Identifikationsstrategien setzen auf Mauslinien, in denen die Motoneurone endogene Fluoreszenz exprimieren 17-19. Doch bereits in jungen Jahren mit genetisch kodierten Markierungen kann schwierig sein, wenn Markerexpression noch variabel ist oder wenn die Studie erfordert bereits eine transgene Mauslinie verwendet wird. Alternativ kann antidrome Aktionspotentialaufzeichnungen routinemäßig auf allen Mäusen vom Beginn der Zellaufnahme erfolgen. Experimentatoren arbeiten an intakten Rückenmark Vorbereitungen bei der Katze, Ratte und Maus haben zuverlässig solche Identifikationstechniken seit den 1950er Jahren 1,2,20,21 verwendet. Bei optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale aus praktisch alle aufgenommenen Motoneurone zu entlocken.

Darüber hinaus können Ventralwurzel Stimulation verwendet werden , um zuverlässig andere Motoneurone 22,23 oder ihre Ziele begeistern. die Renshaw Zellen 10,24,25. Wir präsentieren hier Anwendungen der Ventralwurzel Stimulation in Form von antidromic Aktionspotential Aufnahmen von Motoneuron somas sowie Anregung von Renshaw Zellen.

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Protokoll

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien (86/609 / CEE und 2010-63-UE) und Französisch Gesetzgebung durchgeführt und wurden von der Universität Paris Descartes Ethikkommission genehmigt.

1. Spinal Cord Scheibe Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen täglich oder einen Tag im Voraus. Wenn über Nacht, Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten und in fest verschlossenen Flaschen gekühlt halten.
    1. Bereiten Low Na + künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM Sucrose, 26 mM NaHCO 3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl 2, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). Da Na-Kynurenat oft schwer zu lösen, stellen Sie sicher, das in der Tabelle aufgeführten Materialien zu kaufen.
    2. Bereiten K-Gluconat solution: 130 mM K-Gluconat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat, eingestellt auf pH 7,4 mit KOH.
    3. Bereiten ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4).
    4. Vor dem Beginn der Dissektion, lösen sich 2% Agar in 80 ml der K-Gluconat-Lösung und halten bei 60 ° C warm.
  2. intrakardialer Perfusion
    1. Führen Sie diese Vorbereitung auf die weiblichen und männlichen Mäusen im Alter von P2 bis P11.
    2. Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 ml 25 mM Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg).
    3. Mit Nadeln oder Klebeband, immobilisieren die Maus auf dem Rücken auf einer großen Petrischale mit Silikon gefüllt. Verwenden Sie ein Sezieren microscope für den Rest der Präparation.
    4. Halten Sie die Spitze des Brustbeins, heben Sie die Brust und schneiden Sie die Membran mit einer feinen Schere. Dann öffnen Sie die Brust auf beiden Seiten, indem sie durch die Rippen schneiden das Herz aussetzen.
    5. Schneiden Sie den rechten Vorhof vor den linken Ventrikel mit einer 27G Nadel Punktierung.
    6. Perfuse mit eiskaltem niedrigen Na + ACSF. Nach 30 sec, sollte eine niedrige Na + ACSF aus dem Atrium fließen zu sehen. Geringe Mengen an Natrium verhindern, dass die Zellen, die aus Spick und Zelltod bei der Präparation zu reduzieren.
    7. Halten Sie die Nadel im Herzen unter dem Binokular halten, bis die Leber gelb wird, wenn das Blut abgelassen wird.
  3. Rückenmark Dissektion
    1. Enthaupten das Tier und legte es auf seinen Bauch.
    2. Entfernen Sie schnell , die Haut des Rückens (Abbildung 1A1). Machen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und hinunter den Brustkorb (Abbildung 1A2). Dann schneiden Sie die Schnur als low wie möglich in der kaudalen Abschnitt, um die Wirbelsäule mit dem Beginn der Rippen aus dem unteren Teil des Tieres zu isolieren. Drehen Sie das Tier wieder und entfernen Sie die Eingeweide noch an den Rippen befestigt.
    3. Übertragung der Wirbelsäule zu einer anderen, kleineren Silizium gefüllte Petrischale und benutzen 4 insect pins es dorsalen Seite nach oben (Figur 1A) zu halten.
    4. Kontinuierlich perfundieren das Tier mit Carbogen blasigen ACSF (bei etwa 4 ° C) , während eine Laminektomie der dorsalen Seite durchgeführt wird , und Aussetzen des Rückenmarks von der rostralen Ende (1B). Dazu legen Sie die Spitze der feinen Schere zwischen dem Knochen und dem Rückenmark und schneiden den Knochen nach und nach aus dem rostralen Ende, um sicherzustellen, von der weißen Substanz zu bleiben weg. Alternate auf jeder Seite , während mit einer Pinzette die Band von Knochen bereits geschnitten (Abbildung 1B1) fern zu halten.
    5. Unter Verwendung der kleinsten Feder Schere und Pinzette, heben Sie die Dura und schneidenbeide Seiten auf, während Sie die lose Teil der Dura, um mit der Schere eine Beschädigung des Rückenmarks zu vermeiden. Schneiden Sie entlang der rostro-caudale Achse.
      HINWEIS: Die Dura ist eine halb transparente kontinuierliche Membran; in diesem Alter ist die pia mater zu zerbrechlich und wird während der Präparation und Slicing (Abbildung 1B2) kommen auseinander.
    6. Sobald die Dura ein stumpfes Glas oder Kunststoffspitze entfernt verwendet wird vorsichtig auf die Schnur auf der linken Seite des von der Halbschnitt Wirbelsäule gebildet Nut schieben, und schneiden Sie die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der rechten Seite, von der rostralen Seite beginnen , am weitesten von wo aus sie die Schnur (wenige mm zumindest Abbildung 1B2) eingeben.
    7. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, gehen immer von rostral nach kaudal. Wenn linkshändig, von der linken Seite beginnen und dann auf die rechte Seite zu bewegen.
  4. Die Einbettung in Agar
    1. Schieben Sie die Kabel aus der Wirbelsäule. Verwenden Sie einen kleineren Insektenstift festzunagelndie Schnur mit der Rückenfläche nach oben und zart jedes Stück Membran noch daran (Abbildung 1C1) angebracht entfernen.
    2. Einmal gereinigt, schneiden beide Enden (Abbildung 1C2). Fügen Sie ein gebogener Insektenstift im vorderen Teil der Schnur der Schnur zu manipulieren und beachten Sie seine Ausrichtung (Pfeil in Abbildung 1C2). Dann übertragen das Rückenmark zu einer eiskalten K-Gluconatlösung.
      HINWEIS: Diese Lösung ahmt die intrazelluläre Zusammensetzung des CSF und die Zellen vor dem Absterben des osmotischen Schock verhindern , sobald die Motoneuronen 26 geschnitten wird.
    3. Sobald das Rückenmark innerhalb der intrazellulären Lösung ist, nehmen Sie den Becher mit dem Agar aus dem trockenen Bad und kühlen sie auf eine Mischung aus Eis und Wasser.
    4. Halten Sie Rühren, während die Temperatur zu messen. Wenn die Temperatur 38 ° C erreicht das Rückenmark tauchen, es durch das Insekt Stift halten und legen Sie sie nach unten rostralen Seite. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark ist als straight wie möglich weg von den Wänden, Schwanz- Teil leicht nach oben (Abbildung 1D1).
    5. Verlassen das Becherglas in das Gemisch aus Eis und Wasser das Agar zu ermöglichen, so schnell wie möglich zu verfestigen. Stellen Sie sicher , dass es an seinem Platz bleibt und dass das Kabel so gerade wie möglich (Abbildung 1D1) ist.
  5. Slicing
    1. Nach dem Erstarren schneiden den Agarblock das Rückenmark in der Weise , dass die Basis des Blocks in einem 35 ° Winkel mit dem Lendenteil des Cords (Pfeil in Figur 1D2) enthält. Die dorsale Oberfläche sollte entfernt werden , mit Blick auf von der Basis (Abbildung 1D2).
      Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren zum Aufrechterhalten der Kontinuität der Motoneuron-Pools zu den ventralen Wurzeln, von dem sie zu verlassen.
    2. Kleben Sie den Block in die Kammer des Vibratom mit Sekundenkleber. Tauchen sie in K-Gluconatlösung und fügen Sie slushed gefrorenen K-Gluconatlösung zu haltendas Bad (unter 2 ° C) gekühlt.
    3. Schneiden Sie 350 bis 400 & mgr; m dicke Scheiben der Lendengegend (erkennbar durch ihre Krümmung und mit größerem Durchmesser). In der richtigen Ausrichtung (siehe 1.4.1.), Verwenden Sie die Klinge von der dorsalen auf der ventralen Oberfläche zu schneiden und Scheiben kontinuierlich mehr rostral machen. Typischerweise gibt es 4-5 geeignete Scheiben mit ventral Wurzeln erstreckt 2 mm oder mehr. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 10 ° Winkel, 70 Hz Schwingungsfrequenz und 10 mm / min Geschwindigkeit des Schneidens.
  6. Die Inkubation
    1. Übertragen Sie die Scheiben zu ACSF bei 34 ° C. Nach ca. 30 min, kühlen die Scheiben bis auf RT und die Aufnahme-Session beginnen.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Dissection
A1:. Die Entfernung der Haut des Rückens der dorsalen Säule zu belichten A2:Schneiden der Schultern und Rippen der dorsalen Säule frei B1:. Vertebrale Spalte auf die Silizium-gefüllte Petrischale gepinnt (dorsalen Seite nach oben, kaudal links) B2:. Gleiche mit dem Rückenmark ausgesetzt und seziert C1:. Rückenmark isoliert . (rostralen Seite links) C2: Rückenmark bereit eingebettet werden (Bauchseite nach oben, rostralen Seite links). Notieren Sie sich die kleineren Insektenstift an der rostralen Seite D1:.. Rückenmark im Agar - Becher (rostralen Seite dow, Bauchseite gegenüber dem Boden) D2: Cut Agar - Block mit dem eingebetteten Rückenmark. Notieren Sie sich die 35 ° Winkel der Rückenmark bildet mit der Basis des Blocks und der Lendenanschwellung (Pfeil). Maßstabsbalken 1 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Platzieren der Scheibe in die Kammer

HINWEIS: Ventral Wurzeln sind von unterschiedlicher Größe.

  1. Bereiten Sie eine Schachtel mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern von 40 bis 170 & mgr; m im Voraus reichen. Zur Vorbereitung Saugpipetten, bereiten viele Pipetten mit einer langen Verjüngung. Mit einem Diamantmesser, machen einen Schnitt an verschiedenen Positionen. Dann unter einem Binokular, brechen sie durch die Spitze mit einer Pinzette zu schlagen.
  2. Entfernen Sie die Kammer von der Aufnahme Mikroskop und legen Sie sie unter einem Binokular.
  3. Wählen einer Scheibe, die einen ventralen Wurzel von ausreichender Länge enthält (2 mm oder mehr) auf eine Nutsche Stimulationselektrode angebracht zu werden. Wählen Sie die richtige Ausrichtung der Scheibe mit den ventralen Wurzeln nach oben (2A) und schneiden Sie vorsichtig die Agar um die ventralen Wurzeln , während der Rest des Agar verlassen um die Scheibe (2B).
    Hinweis: Da der Agar fester als die Scheibe ist, wird dies die Gewinde des Ankers Scheibe ermöglichen, sich auf dem Agar zu ruhen und nicht auf der Scheibe und damit die anchor wird das Gewebe nicht schädigen. Stellen Sie sicher , dass die Fäden des Ankers Scheibe oberhalb der Motoneuron - Pool (in rot in 2C gezeigt).
  4. Montieren Sie die Kammer wieder auf das Mikroskop und kontinuierlich die Aufnahmekammer perfuse mit ACSF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei RT. Verwendung einer Glaspipette mit ACSF gefüllt und mit einer Spritze verbunden, saugen einen der ventralen Wurzel (Pfeil in Figur 2C). Um eine gute Stimulation des ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze um den ventralen Wurzel dicht sein. Einen Pol sollte in der Stimulationselektrode und die andere in dem Bad (oder mit der patch-Klemmelektrode reference).
  5. Erreichen patch-clamp Aufzeichnung der gewünschten Zelltyp und notieren Sie die Wirkung der ventralen Wurzel Stimulation als previsouly 10 beschrieben.
    1. Hier wird ein Verstärker für die Datenerfassung verwendet werden. Filter Ganzzellableitungen bei 3 kHz. Digitalisieren bei 10 kHz. Compensate Brückenwiderstand in current-Clamp-Modus.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Ventralwurzel Vorbereitung
A: Lendenwirbelscheibe Rückenmark eingebettet in Agar mit der ventralen Wurzel nach oben . B: lumbalen Rückenmark Scheibe mit den ventralen Wurzeln aus dem Agar befreit . C: lumbalen Rückenmark Scheibe mit einer Stimulationselektrode eng um den ventralen Wurzeln (Pfeil) platziert . Beachten Sie die Position der Renshaw - Zellen, die rote Fluoreszenz im CHRNA2-Cre Maus 28 mit der Maus Reporter gekreuzt R26 Tom 17. Maßstabsbalken 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Ergebnisse

Bestätigung der Motoneuron Identität Mit antidromen Aktionspotentialen

Zell - Targeting

Motoneurone sind im ventralen Horn (sichtbar in rot in 2C) gefunden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet, und gehen bis das Bündel streut voll und man beginnt, große Zellen zu sehen (l...

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Diskussion

Oblique slicing des Rückenmarks ist wichtig, da es für die einseitige Stimulation der Motoneuron-Pools und Renshaw Zellen in einer einzigen Wirbelsegments in einer zuverlässigen, umfassende und spezifische Weise ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es eine schnelle, elegante und eindeutige Identifikation von aufgezeichnetem Motoneurone. Als nächstes werden wir die Vorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Scheibe Zubereitungsmethoden zu markieren, und dann werden wir die häufigsten Fallen stressen zu vermeiden, w...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Marin Manuel und Olivia Goldman-Szwajkajzer für ihre Hilfe in den Fotos zu machen. Die Autoren danken auch Arjun Masukar und Tobias Bock für das Manuskript Korrektur. Finanzielle Unterstützungen wurden von der Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) zur Verfügung gestellt, das NIH-NINDS (R01NS077863), die Thierry Latran Foundation (OHEX Project), die Französisch Verband für Myopathie ( Grant-Nummer 16026) und Target ALS sind dankbar anerkannt. Felix Leroy war der Empfänger einer "Contrat Doctoral" von der Ecole Normale Supérieure, Cachan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Na-KynurenatABCAMab120256löst sich besser auf als andere Marken
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
Saccharose SigmaS9378
NaHCO3 SigmaS6014
CaCl2 G BiowissenschaftenR040
MgCl2 Qualität Biologisch351-033-721
Glukose SigmaG5767
Ascorbinsäure SigmaA5960
Na-pyruvat SigmaP2250
K-Gluconat SigmaP1847
EGTA SigmaE3889
HEPES SigmaH4034
NaClSigmaS9888
AgarSigmaA9799
QX-314AlomonQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
GluconsäureSigmaG1951
Cäsiumhydroxid LösungSigma232041
KOHSigmaP5958
Vannas Federschere - 2.5mm FST15000-08nur zum Schneiden der Dura verwenden, kann beim Schneiden von Knochen beschädigt werden
StimulatorA-M SystemsIsolierter Impulsstimulator Modell 2100
VibratomeCampdenVibrierendes Mikrotom 7000 - Modell 7000smz-2

Referenzen

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Schlagwörter

Pr paration obliquer SchnitteIdentifizierung von MotoneuronenErregung von Renshaw Zellenantidrome Ableitungelektrophysiologische AufzeichnungenVibratomschnittAgar EinbettungstechnikLow Sodium ACSF Perfusion
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