Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Abstract

Die Identifizierung des/der molekularen Ziel(s) von kleinen Molekülen ist ein herausfordernder, aber notwendiger Schritt zum Verständnis ihres Wirkmechanismus. Obwohl mehrere Methoden zur Identifizierung von Zielen entwickelt und verwendet wurden, um die Bindungsproteine einer Vielzahl von kleinen Molekülen erfolgreich aufzuklären, haben diese Techniken Nachteile, die sie für den Nachweis bestimmter Arten von kleinen Molekül-Ziel-Wechselwirkungen ungeeignet machen. Insbesondere nicht-kovalente Wechselwirkungen, die von nativen zellulären Bedingungen abhängen, wie z. B. die von Membranproteinen, deren Strukturen bei der Zelllyse gestört werden können, sind oft nicht für affinitätsbasierte Zielidentifizierungsmethoden zugänglich. Hier demonstrieren wir ein Verfahren, bei dem eine Sonde, die eine photolabile Gruppe enthält, verwendet wird, um kovalent mit dem niedermolekularen Bindungsprotein in der Umgebung der lebenden Zelle zu vernetzen, was den Nachweis und die Isolierung des Zielproteins ermöglicht, ohne dass die Interaktion nach der Zelllyse aufrechterhalten werden muss. Diese Technik ist ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung biologisch interessanter kleiner Moleküle mit unbekannten Mechanismen, sowohl im Rahmen der Grundlagenbiologie als auch in der Wirkstoffforschung.

Introduction

Bioaktive kleine Moleküle funktionieren grundlegend durch die Interaktion mit und die Änderung der Funktion von einer oder mehreren "Ziel" Moleküle, am häufigsten Proteine ​​in der Zelle. Bei der Wirkstofffindung, wenn eine aktive Verbindung durch phänotypische Screening entdeckt wird, die Identifizierung der molekularen Ziel (en) dieser Verbindung ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur für das Verständnis des Mechanismus der Wirkung und mögliche Nebenwirkungen der Verbindung, sondern auch für potenziell entdecken neue Biologie der Krankheitsmodell zugrunde liegen und den Weg für die Entwicklung neuer mechanistische Klassen von Therapeutika ¹ geebnet.....

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll von MacKinnon und Taunton ¹⁰ für den Einsatz in lebenden Zellen angepasst wurde.

1. Herstellung von kultivierten Zellen

1. Bereiten sterile 6-cm Zellkulturschalen für die Anzahl der Proben gewünscht (siehe unten).
   HINWEIS: Eine Schüssel Zellen pro Behandlungsbedingung verwendet wird, aber wenn mehr Protein erforderlich ist, 2 oder 3 Gerichte pro Zustand und kombiniert nach UV-Bestrahlung hergestellt werden.
   1. Bereiten Sie mindestens drei Gerichte von Zellen; Negative Kontrolle mit DMSO nur (D), Sondenbehandlung nur (P) und Sonde + Wettbewerber (C).
   2. Optional vorbereiten, ....

Results

Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit einer Photoaffinitätssonde des Antimykotikum Itraconazol erhalten, deren Verwendung bisher ¹⁶ veröffentlicht wurde. Diese Ergebnisse zeigen die Verwendung der Lebendzellphotoaffinitätsmarkierungstechnik, um erfolgreich eine große Itraconazol-bindende Protein als 35 kDa membrane protein Spannungsabhängiger Anionenkanal 1 (VDAC1) identifizieren.

Das obige Protokoll wurde in HEK.......

Discussion

Verschiedene Ansätze, um die Ziele von kleinen Molekülen zu identifizieren können grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: top-down, wo der zelluläre Phänotyp des Medikaments verwendet wird seine potenzielle Ziele zu verengen auf der Grundlage ihrer bekannten Funktionen oder von unten nach oben, wo das Ziel ³ direkt durch chemische oder genetische Mittel identifiziert. Top-down oder phänotypische Studien können bestimmte zelluläre Prozesse identifizieren durch das Medikament beeinflusst (zB Transkr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)	Life Technologies	20490	Machen Sie einen frischen Tag der Anwendung. Bereiten Sie 100 mM Brühe in Wasser mit 4 eq NaOH vor.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Bereiten Sie 1,7 mM Brühe in einem Verhältnis von 4:1 von t-Butanol zu DMSO vor und lagern Sie sie bei -20  °C.
Kupfersulfat (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	50 mM Brühe in Wasser zubereiten, bei Raumtemperatur lagern.
Biotin-Azid	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Bereiten Sie 10 mM Vorrat in DMSO vor, lagern Sie bei -20  °C.
Alexa Fluor 647-azid	Life Technologies	A10277	Mio. Bestand in DMSO vorbereiten, lagern bei -20  °C.
365-nm-UV-Lampe	Spectroline	FC100	UV-Blockerbrille getragen werden.
Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei	Roche Life Science	11873580001	50x Lösung in Wasser zubereiten und bei -20  lagern °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Auf Ausgang 1 einstellen, Einschaltdauer 30%.
Fluoreszierender Gelscanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Verwenden Sie einen roten Laser, um Alexa-Fluor 647 zu erkennen.
Detergenzien-kompatibles Dc-Protein-Assay-Kit	Bio-Rad	5000112
Streptavidin Agarose-Kügelchen mit hoher Kapazität	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles	ThermoFisher Scientific	11885092
fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin-Lösung	ThermoFisher	Scientific 15140122
SDS-Probenpuffer (2x)	ThermoFisher Scientific	Nr. LC2676