Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In der zeitgenössischen Metabolomik, High - End - analytische Trennverfahren ein breites Spektrum von Metaboliten Klassen , um einen Vertreter zu erhalten zu analysieren Auslesen des physiologischen Status eines Organismus ^1. Das ultimative Ziel einer Metabolomics-Studie ist eine Antwort auf eine bestimmte biologische / klinischen Fragestellung zu erhalten. Derzeit wird die Human Metabolome Datenbank von mehr als 40.000 Einträge Metaboliten enthalten repräsentieren sowohl endogene und exogene Verbindungen (letztere mit Ursprung aus Nährstoffen, Mikrobiota, Drogen und anderen Quellen) ^2. In Anbetracht der großen Vielfalt in physikalisch-chemischen Eigenschaften und Konzentrationsbereich dieser Metaboliten, mehrere Analysetechniken mit unterschiedlichen Trennmechanismen verwendet werden, in Verbindung, um so viele Metaboliten wie möglich Profil in einer bestimmten biologischen Probe. Zum Beispiel Psychogios et al. Verwendeten eine Kombination von fünf analytische Trennverfahren für metabolische profe ling von humanem Serum , was zur Detektion von mehr als 4.000 chemisch unterschiedlichen Metaboliten ^3.

In diesem Papier wird die Aufmerksamkeit auf neu entwickelte CE-MS Strategien zur metabolischen Profils von biologischen Proben ^4,5 bezahlt werden. In CE, spezifischer Kapillarzonenelektrophorese (CZE, normalerweise als CE bezeichnet), sind Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Größenverhältnis getrennt und daher diese analytische Technik ist sehr geeignet für die Analyse von polaren und geladenen Metaboliten. Der Trennmechanismus von CE ist grundsätzlich verschieden von chromatographischen basierte Techniken, wodurch eine komplementäre Sicht auf die metabolische Zusammensetzung von biologischen Proben ^6-8 bereitstellt. Soga und Mitarbeiter waren die ersten , die Nützlichkeit der CE-MS für die weltweite Profilierung von Metaboliten in biologischen Proben ^9,10 zu zeigen. Bis jetzt hat die Machbarkeit und Nützlichkeit der CE-MS für Metabolomik worden ^11-15 weit unter Beweis gestellt.CE wird in der Regel über einen Mantel-Flüssigkeit zu MS gekoppelt Technik Schnittstelle ^16,17; Jedoch aufgrund der Verdünnung des kapillaren Abstrom durch die Mantel-Flüssigkeit wird die Detektionsempfindlichkeit intrinsisch beeinträchtigt.

Vor kurzem wurde gezeigt , dass die Verwendung einer sheathless Schnittstelle signifikant die Nachweis Abdeckung von Metaboliten verbessert , die in verschiedenen biologischen Proben im Vergleich mit CE-MS ^5,18,19 eine klassische Mantel-Flüssig - Grenzfläche verwendet wird . Zum Beispiel, circa 900 molekularen Eigenschaften wurden in menschlichem Urin durch sheathless CE-MS detektiert , während etwa 300 molekularen Eigenschaften mit Mantel-Flüssig - CE-MS ⁵ beobachtet wurden. Die sheathless Schnittstelle verwendet wurde auf einer porösen Spitze Emitter basiert, die durch Moini ^20, erfunden wurde , die effektive Nutzung des eigen niedrigem Fließeigenschaft von CE in Kombination mit nano-ESI-MS ermöglicht.

Um die Verwendung von sheathless CE-MS im Bereich der Metabolomik zu stimulieren,ein Protokoll beschreibt dargestellt, wie dieser Ansatz für die Analyse von stark polaren Metaboliten in biologischen Proben verwendet werden, wie für die Analyse von Extrakten aus der Glioblastom-Zelllinie veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die sheathless CE-MS-Verfahren für die Profilierung von kationischen Metaboliten können auch für die Profilierung von anionischen Metaboliten genau die gleichen Kapillare und Trennungsbedingungen unter Verwendung verwendet werden, wodurch die Analysezeit reduziert und eine einzige Analyseplattform für die globale Profilierung der Bereitstellung berechnet Metaboliten. Das Protokoll beschreibt auch eine Strategie für die effektive Ausrichtung der sheathless poröser Spitze Emitter mit dem MS-Instrument.

HINWEIS: Das Protokoll hier für die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolischen Profils Studien beschrieben ist nur für den Einsatz im Labor. Die unten beschriebenen Verfahren werden auf kürzlich veröffentlichte Arbeit ^4,5 basiert. Weitere experimentelle Details finden sich in diesen Papieren zu finden. Vor dieses Protokoll zu verwenden, finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Bitte verwenden Sie alle geeigneten Laborsicherheitsverfahren, einschließlich Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe, wenn die Experimente in diesem Protokoll beschriebenen durch.

1. Vorbereitung der Reagenzien-Lösungen und Proben

1. Herstellung des Hintergrundelektrolyten (BGE)
   1. Bereiten Sie eine neue BGE-Lösung (10% (v / v) Essigsäure, pH 2,2) jeden Tag.
   2. In 9,0 ml Wasser in einen 10-ml-Glasfläschchen und 1,0 ml Essigsäure, um das Wasser in einem Abzug. Mischen Sie die Lösung gründlich einen Wirbel verwenden.
2. Herstellung von Metaboliten standard Mischung
   1. Man löst 50 ul einer 50 uM Kation Standardmischung 60 kationischen Metaboliten in 50 & mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch ist.
   2. Man löst 50 ul einer 50 uM Anion Standardmischung 30 anionische Metaboliten in 50 & mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bewahren Sie diese Lösung, in Aliquots Frost / Tau-Zyklen der gleichen Standardmischung, bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch zu verhindern.
      HINWEIS: Der Metabolit Standardmischungen für 3 Monate stabil sind, wenn sie richtig bei -80 ° C gelagert.
3. Herstellung von Extrakten aus der Glioblastom - Zelllinie
   1. Waschen Sie die adhärenten menschlichen U-87 MG Glioblastom - Zellen dreimal mit 1 ml eiskaltem 0,9% Natriumchloridlösung ^21.
   2. 2 ml eiskaltem Methanol / Wasser - Lösung (8/2, v / v) zu den anhaftenden Zellen und kratzen mit einem Gummizellschaber ²¹ gekippt. Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Lösung in einem Rohr und ultrasonicate für 2 min.
   3. In Chloroform zu dem Methanol / Wasser-Fraktion (endgültige Verhältnis 8/8/2, v / v / v) und Zentrifuge die Probe für 10 Minuten bei 16.100 × g und 4 ° C.
   4. Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Schicht und verdampfen diese Fraktion ein Vakuum-Konzentrators. Rekonstitution des getrockneten Materials in 50 & mgr; l Wasser für die Analyse von sheathless CE-MS. Wenn nicht in Gebrauch speichern Sie die Probe bei -80 ° C.

2. Einstellen der sheathless CE-MS-System nach oben

1. Die Installation der nackten Quarzglas Patrone mit der porösen Spitze Emitter
   1. Legen Sie eine neue nackten Quarzglas Patrone mit einer porösen Spitze Emitter (30 & mgr; m Innendurchmesser x 90 cm Gesamtlänge) in der CE-Gerät.
   2. Tragen Sie eine Vorwärtsspülung bei 50 psi für 15 Minuten mit der Software das CE-Gerät mit 100% Methanol zu steuern und visuell prüfen, ob Flüssigkeit aus dem capil ausströmendenLary Ausgang während dieser Spülschritt. Auch eine Spülung in die entgegengesetzte Richtung für 5 min bei 50 psi führen die BGE-Lösung visuell zu untersuchen, ob Flüssigkeit aus der leitfähigen Kapillare fließt aus.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 bei einem Druck von 100 psi, falls keine Flüssigkeit Tropfenbildung hat am Kapillarauslaß beobachtet. Installieren Sie einen neuen nackten Quarzglas Patrone, wenn keine Flüssigkeit Tropfenbildung während dieses Schritts beobachtet wurde.
   4. Spülen Sie die Trennkapillare mit Wasser bei 50 psi für 10 min, gefolgt von 0,1 M NaOH bei 50 psi für 10 min, dann mit Wasser bei 50 psi für 10 Minuten und schließlich mit BGE bei 50 psi für 10 min.
      HINWEIS: Die Schritte 2.1.1 bis 2.1.4 nur für die Installation einer neuen kapillaren Kassette erforderlich sind.
2. Die Kopplung der Kapillar - poröse Spitze Emitter ESI-MS
   HINWEIS: Vor der CE-Kapillare zu MS zu koppeln, sicherzustellen, dass die MS Instrument kalibriert worden ist und mit dem CE-System verbunden. Stellen Sie die ESI-Spannung an0. Den MS-Gerät mit einer Nanospray-Quelle. Gas 1, Gas 2 und Schnittstelle Heizungstemperatur wurden als ESI bei sehr niedrigen Flussraten erfolgt nur durch die Anwendung der Ionensprayspannung eingestellt bei 1500 V. Stellen Sie den Vorhang bei 5 psi nicht angewendet.
   1. Entfernen Sie die sprayer Spitze des Quarzglas Patrone aus dem Wasserrohr und installiert es im Nanospray Quellenadapter zum Koppeln mit dem MS Instruments. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der BGE Fläschchen in der CE-Instrument, um die Höhe der Spritze Spitze entsprechen.
   2. Prüfen, für die Strömung von Flüssigkeit durch die leitfähige Kapillare durch 5 min bei 50 psi mit BGE Spülen. Während dieser Spülung eine Tropfenbildung an der Basis des Zerstäubers ESI Schritt Nadel beobachtet werden sollte.
   3. Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 10 Minuten in der Vorwärtsrichtung. Tropfenbildung sollte sich an der Spitze des porösen Spitzenemitter (sprayer Spitze) bei diesem Schritt zu beachten.
   4. Positionieren Sie die poröse Spitze Emitter mit dem Eingang des MS-Einlass in einem Abstand von cIRCA 2 bis 3 mm.
   5. Tragen Sie eine Spannung von 30 kV eine Rampenzeit von 1 min und starten Sie den Erwerb MS - Daten in der m / z - Bereich von 65 bis 1000 m / z für Studien des metabolischen Profils zunächst eine ESI - Spannung von 0 verwenden.
      HINWEIS: Das Massenspektrum des Signals ungültig sein sollte, wie es sollte kein Elektro sein.
   6. Stellen Sie die ESI-Spannung bis 1000 V, während tragen die Daten zu messen. Erhöhen Sie die ESI-Spannung in Schritten von 200 V bis zu einer konstanten Hintergrundsignal wird für mindestens 15 min beobachtet.
   7. Optimieren Sie die poröse Spitze Emitter Position in Bezug auf die Mitte des MS-Einlass, indem er in der x, y oder z-Richtung bewegt, um zu sehen, welche Position die maximale und stabilsten MS-Signal (Gesamtionen Elektropherogramm) zur Verfügung stellt.
   8. Nachdem die Position der porösen Spitze Emitter zu optimieren und die optimale ESI Spannung zu bestimmen, stellen Sie die ESI-Spannung auf 0 V und der CE-Spannung von 30 kV bis 1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min mit.
   9. Erstellen Sie eine MS-Methode using die optimale ESI Spannung und eine CE-Verfahren zur Analyse von Metaboliten-Standards und biologischen Proben auf dem CE-Gerät.

3. Analyse der Metabolit Standards und biologischen Proben

1. Leistungsbewertung des sheathless CE-MS - System
   1. Transfer 20 ul des anionischen Metaboliten Standardmischung in eine leere 100 ul Microvial (PCR Fläschchen), die in einem CE-Phiole passt und setzen diese Fläschchen in der Einlassprobenschale.
      HINWEIS: Das Mindestvolumen erforderlich im Microvial für eine zuverlässige Einspritzung 2 ul.
      1. Starten Sie den MS Erwerb Negativ-Ionen-Modus Verfahren während Schritt erstellt 2.2.9 und anschließend die CE-Sequenz starten Sie die Software die Steuerung des CE-Instrument.
      2. Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 3 min, gefolgt von Injektion bei 2,0 psi für 60 sec (20 nl bis 3% des Kapillarvolumens entspricht) und anschließend durch BGE Injektion bei 1,0 psi für 10sek.
         HINWEIS: Anschließend MS Datenerfassung ausgelöst.
      3. Übernehmen einer Spannung von -30 kV mit einer Anstiegszeit von 1,0 min mit einem Druck von 0,5 psi für 30 min am Einlass. Nach 30 min elektrophoretische Trennung, MS die Datenerfassung zu stoppen und die CE-Spannung auf -1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min unter Verwendung (eine graduelle Abnahme der CE Spannung nach der elektrophoretischen Trennung um die Haltbarkeit der porösen Spitze kapillaren Emitters verbessert).
   2. Zwischen Probeninjektionen, spülen Sie die Kapillare mit Wasser, 0,1 M Natriumhydroxid, Wasser und BGE jeweils bei 30 psi für 3 min.
   3. Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten anionischen Metabolit-Gemisch.
   4. Beurteilen Sie, ob die anionische Metabolit Standards in der Region erscheinen zwischen 10 und 28 min.
   5. Prüfen , ob drei strukturell verwandten Isomeren, das heißt, D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose-6-phosphatteilweise getrennt, das heißt, die Auflösung zwischen den beiden ersten Spitzen circa 0,75 und der letzten beiden Peaks ist circa 0,50 (siehe Abbildung 1).
      ANMERKUNG: Eine Auflösung von 1,5 weist auf eine Basislinientrennung von zwei benachbarten Spitzen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für die kationische Metabolit-Gemisch. Stellen Sie sicher, dass MS-Detektion ist jetzt in positive Ionen-Modus und CE-Spannung ist 30 kV.
   7. Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten kationischen Metabolit-Gemisch.
   8. Beurteilen Sie, ob die kationischen Metaboliten Standards in der Region erscheinen zwischen 8 und 22 min. Überprüfen Sie, ob Isoleucin und Leucin sind zwischen 15 und 15,5 min Migration und bestimmen, ob die Auflösung circa 0,5 ist.
2. Analyse von biologischen Proben
   1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für anionische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie.
      HINWEIS: Die metabolische conZelt nach der Probenvorbehandlungs daher entspricht einer Zelldichte von 20 Zellen / nl, erhalten circa, 20 nl Injektion ist das Äquivalent von 400 Zellen pro Analyse. .
   2. Erstellen eines extrahierten Ionen Elektropherogramm für den Metaboliten Milchsäure (m / z 89,0243) unter Verwendung von 5 mDa Massengenauigkeit und prüfen Sie, ob die Signalintensität über 100.000 Zählungen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für kationische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie.
      HINWEIS: Eine sehr informationsreiche Gesamtionen Elektropherogramm sollte für eine 20 nl Injektion in diesem Modus beobachtet werden.
   4. Nach den Analysen oder wenn nicht in Gebrauch, spülen Sie die Kapillare mit Wasser bei 50 psi für 15 min und speichern den Einlaßteil der Kapillare in ein Fläschchen mit Wasser und dem porösen Abschnitt (Auslassteil) in einem Rohr auch Wasser enthält.

Die vorgeschlagene sheathless CE-MS - Methode ist in der Lage hocheffiziente Bereitstellung dh Plattennummern im Bereich von 60.000 bis 400.000, Profile für die anionische und kationische Metaboliten bei nanomolaren Nachweisgrenzen unter Verwendung von 10% Essigsäure (pH 2,2) als BGE. Die Trennleistung des Verfahrens für die Analyse von stark polaren anionischen Metaboliten für drei strukturell verwandten Zuckerphosphat - Isomeren (1) gezeigt. Obwohl eine Basislinientrennung nicht für diese drei Analyten erhalten wurde, ist eine teilweise Trennung ausreichend ihre selektiven Nachweis von MS zu ermöglichen, da diese Analyten exakt das gleiche Masse haben. Das Potential des sheathless CE-MS Methode zur metabolischen Profils der begrenzten Anzahl von Zellen, dh ein 20 nl Injektion entspricht 400 Zellen (Zelldichte etwa 20 Zellen / nl), wird für die Analyse der kationischen Metaboliten in einem Extrakt nachgewiesen der Glioblastom-Zelllinie (Abbildung 2), in denen mehr als 300 molekularen Eigenschaften über einem S / N-Verhältnis ≥ 5 detektiert.

Abbildung 1. Analyse der Zucker - Phosphat - Isomeren durch sheathless CE-MS. Extrahiert Ion Elektropherogramm für drei Zucker - Phosphat - Isomere (25 & mgr; M) , erhalten mit sheathless CE-MS im Negativ - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung von -30 kV (+0,5 psi am Einlass der CE-Kapillare angelegt); Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. Mit Genehmigung 4. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Analyse von Isoleucin und Leucine durch sheathless CE-MS. Extrahierte Ionen - Elektropherogramm von zwei Aminosäure Isomeren (25 uM) , erhalten mit sheathless CE-MS in positiven Ionenmodus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektion, 2,0 psi für 60 sec. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Potential von sheathless CE-MS zur Profilierung kationischen Metaboliten in einer Zelllinie Extrakt. Metabolic Profil (Gesamtionen Elektropherogramm) beobachtet in einem Extrakt eines Glioblastom - Zelllinie mit sheathless CE-MS im Positiv - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. 4 Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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