Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) unter Verwendung einer mantellosen, porösen Grenzfläche für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten verwendet werden kann. Unter der Annahme, dass oft keine Metaboliten geladen werden können, und sie kationisch oder anionisch sein können, ist zu ihrer Trennung elektrolytische Trennungen wie die Kapillarelektrophorese die am besten geeignete Methode. In den letzten Jahren war die Sensibilität jedoch nicht gut genug.

Das lag an der Schnittstelle und die Methode war auch nicht robust. Aber ich denke, wir haben beide Probleme gut gelöst, indem wir eine Hülle als freie Schnittstelle verwendet haben, und dieses neue Protokoll zu verwenden. Die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie unter Verwendung einer neuartigen mantellosen Schnittstelle mit porösen Spitzen kann zur Beantwortung wichtiger klinischer Fragen auf dem Gebiet der Metabolomik eingesetzt werden.

Zum Beispiel kann das Profiling von hochpolaren geladenen Metaboliten mit dieser Technologie einfach durchgeführt werden. S-Komposite, getrennt nach dem Verhältnis von Ladung zu Größe. In den meisten Fällen eignet sich diese Technik sehr gut für die Profilierung dieser Art von Verbindungen, die auf biologische Proben übertragen werden.

Ein einzigartiges Merkmal der vorgeschlagenen mantellosen CE-MS-Methodik besteht darin, dass sie für die Profilierung von anionischen und kationischen Metaboliten verwendet werden können, indem nur die CE-Spannungspolarität und die MS-Nachweispolarität umgeschaltet werden. Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da CE-MS als relativ neue und komplizierte Technik gilt. Um diesen Vorgang zu starten, setzen Sie eine neue blanke Quarzglaskartusche mit einem Emitter an der porösen Spitze in das Kapillarzonen-Elektrophorese- oder CE-Instrument ein.

Wenden Sie eine Vorwärts-Methanolspülung bei 50 psi für 15 Minuten mit der Software an, die das CE-Gerät steuert. Und prüfen Sie visuell, ob Flüssigkeit aus dem Kapillarauslass austritt. Führen Sie dann fünf Minuten lang eine Spülung in die entgegengesetzte Richtung bei 50 psi mit dem Hintergrund-Electrolite oder der BGE-Lösung durch, um visuell zu untersuchen, ob Flüssigkeit aus der leitfähigen Kapillare austritt.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt bei einem Druck von 100 psi, falls nicht beobachtet wurde, dass Flüssigkeit aus dem Kapillarauslass fließt. Spülen Sie anschließend die Trennkapillare 10 Minuten lang mit Wasser bei 50 psi, gefolgt von 0,1 molar Natriumhydroxid bei 50 psi für 10 Minuten, Wasser bei 50 psi für 10 Minuten und BGE-Lösung bei 50 psi für 10 Minuten. Entfernen Sie anschließend die Sprühspitze der Quarzglaskartusche aus dem Wasserschlauch und setzen Sie sie in den Nanospray-Quellenadapter zur Kopplung mit dem MS-Gerät ein.

Stellen Sie sicher, dass die Höhe der BGE-Lösungsfläschchen im CE-Instrument mit der Höhe der Sprühspitze übereinstimmt. Überprüfen Sie, ob die Flüssigkeit durch die leitfähige Kapillare fließt, indem Sie sie fünf Minuten lang mit BGE-Lösung bei 50 psi spülen. Während dieses Spülschritts sollte ein Flüssigkeitstropfen an der Basis der Elektrospray-Ionisationsnadel oder ESI-Sprühnadel beobachtet werden.

Spülen Sie die Trennkapillare nach dem Spülen 10 Minuten lang mit BGE-Lösung bei 50 psi in Vorwärtsrichtung. Während dieses Schritts sollte ein Flüssigkeitstropfen an der Spitze des porösen Spitzenemitters beobachtet werden. Positionieren Sie nun den porösen Spitzenstrahler in einem Abstand von etwa zwei bis drei mm zum Eingang des MS-Inlets.

Legen Sie eine Spannung von 30 kV mit einer Rampenzeit von einer Minute an und beginnen Sie mit der Erfassung von MS-Daten im Masse-Ladungs-Bereich von 65 bis 1000 für metabolische Profiling-Studien, wobei zunächst eine ESI-Spannung von Null verwendet wird. Stellen Sie die ESI-Spannung während der Messung der Daten auf 1000 V ein. Erhöhen Sie die ESI-Spannung in Schritten von 200 V, bis mindestens 15 Minuten lang ein konstantes Hintergrundsignal zu hören ist.

Übertragen Sie 20 Mikroliter eines zuvor hergestellten Standardgemisches aus anionischen Metaboliten in ein leeres 100-Mikroliter-Mikrofläschchen. Setzen Sie das Mikrofläschchen in ein CE-Fläschchen und setzen Sie das CE-Fläschchen in das Probentablett ein. Starten Sie eine zuvor erstellte MS-Akquisitionsmethode mit negativem Ionenmodus und starten Sie anschließend die CE-Sequenz mit der Software, die das CE-Gerät steuert.

Spülen Sie anschließend die Trennkapillare drei Minuten lang mit BGE-Lösung bei 50 psi, gefolgt von Injektionen mit zwei psi für 60 Sekunden und einem psi für 10 Sekunden. Anlegen einer Spannung von 30 kV mit einer Rampenzeit von einer Minute und einem Druck von 0,5 psi für 30 Minuten am Einlass. Nach einer 30-minütigen elektrophoretischen Trennung stoppen Sie die MS-Datenerfassung und verringern die CE-Spannung mit einer Rampenzeit von fünf Minuten auf 1 kV.

Spülen Sie die Trennkapillare zwischen den Probeninjektionen drei Minuten lang mit Wasser, 0,1 molaren Natriumhydroxid, Wasser und BGE-Lösung bei 30 psi. Sobald die Läufe abgeschlossen sind, analysieren Sie die aufgezeichneten Daten, indem Sie die Migrationszeiten und die Signalintensität des analysierten anionischen Metabolitengemisches bestimmen. Beurteilen Sie, ob die anionischen Metabolitenstandards im Bereich zwischen 10 und 28 Minuten auftreten.

Prüfen Sie dann, ob die drei strukturell verwandten Isomere, D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose-6-phosphat, teilweise getrennt sind. Die Trennleistung der mantellosen CE-MS-Methode zur Analyse hochpolarer anionischer Metaboliten wird für drei strukturell verwandte Zuckerphosphat-Isomere demonstriert. Obwohl für diese drei Analyten keine Ausgangstrennung erzielt wurde, ist eine partielle Trennung ausreichend, um ihren selektiven Nachweis durch MS zu ermöglichen, da diese Analyten genau die gleiche Masse haben.

Bei der Analyse biologischer Proben ist es mit dieser mantellosen CE-MS-Methodik wichtig, die analytische Leistung im Laufe der Zeit regelmäßig nach akademischen Standards zu überprüfen. Insgesamt ermöglicht die mantellose Methodik die Profilierung dieser Art von Verbindungen in ultrakleinen biologischen Proben, wodurch viele Möglichkeiten für die Analyse dieser Art von Proben in den Bereichen der biomedizinischen Wissenschaften, der bioanalytischen Chemie und der Forschungsbereiche außerhalb eröffnet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie CE an MS über eine mantellose poröse Grenzfläche koppeln können, um ein Profil von hochpolaren und geladenen Metaboliten zu erstellen.