Name: Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Erfahren Sie die sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur Analyse hochpolarer geladener Metabolite in biologischen Proben. Diese Methode ermöglicht die Profilierung anionischer und kationischer Verbindungen mit verbesserter Sensitivität.

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Dr. Rawi Ramautar möchte sich für die finanzielle Unterstützung durch das Veni-Stipendienprogramm der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO Veni 722.013.008) bedanken.

HINWEIS: Das Protokoll hier für die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolischen Profils Studien beschrieben ist nur für den Einsatz im Labor. Die unten beschriebenen Verfahren werden auf kürzlich veröffentlichte Arbeit 4,5 basiert. Weitere experimentelle Details finden sich in diesen Papieren zu finden. Vor dieses Protokoll zu verwenden, finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Bitte verwenden Sie alle geeigneten Laborsicherheitsverfahren, einschließlich Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe, wenn die Experimente in diesem Protokoll beschriebenen durch. 1. Vorbereitung der Reagenzien-Lösungen und Proben <ol><li> Herstellung des Hintergrundelektrolyten (BGE) <ol><li> Bereiten Sie eine neue BGE-Lösung (10% (v / v) Essigsäure, pH 2,2) jeden Tag. </li><li> In 9,0 ml Wasser in einen 10-ml-Glasfläschchen und 1,0 ml Essigsäure, um das Wasser in einem Abzug. Mischen Sie die Lösung gründlich einen Wirbel verwenden. </li></ol></li><li> Herstellung von Metaboliten standard Mischung <ol><li> Man löst 50 ul einer 50 uM Kation Standardmischung 60 kationischen Metaboliten in 50 &amp; mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch ist. </li><li> Man löst 50 ul einer 50 uM Anion Standardmischung 30 anionische Metaboliten in 50 &amp; mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bewahren Sie diese Lösung, in Aliquots Frost / Tau-Zyklen der gleichen Standardmischung, bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch zu verhindern. HINWEIS: Der Metabolit Standardmischungen für 3 Monate stabil sind, wenn sie richtig bei -80 ° C gelagert. </li></ol></li><li> Herstellung von Extrakten aus der Glioblastom - Zelllinie <ol><li> Waschen Sie die adhärenten menschlichen U-87 MG Glioblastom - Zellen dreimal mit 1 ml eiskaltem 0,9% Natriumchloridlösung 21. </li><li> 2 ml eiskaltem Methanol / Wasser - Lösung (8/2, v / v) zu den anhaftenden Zellen und kratzen mit einem Gummizellschaber 21 gekippt. </li&gt; <li> Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Lösung in einem Rohr und ultrasonicate für 2 min. </li><li> In Chloroform zu dem Methanol / Wasser-Fraktion (endgültige Verhältnis 8/8/2, v / v / v) und Zentrifuge die Probe für 10 Minuten bei 16.100 × g und 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Schicht und verdampfen diese Fraktion ein Vakuum-Konzentrators. Rekonstitution des getrockneten Materials in 50 &amp; mgr; l Wasser für die Analyse von sheathless CE-MS. Wenn nicht in Gebrauch speichern Sie die Probe bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Einstellen der sheathless CE-MS-System nach oben <ol><li> Die Installation der nackten Quarzglas Patrone mit der porösen Spitze Emitter <ol><li> Legen Sie eine neue nackten Quarzglas Patrone mit einer porösen Spitze Emitter (30 &amp; mgr; m Innendurchmesser x 90 cm Gesamtlänge) in der CE-Gerät. </li><li> Tragen Sie eine Vorwärtsspülung bei 50 psi für 15 Minuten mit der Software das CE-Gerät mit 100% Methanol zu steuern und visuell prüfen, ob Flüssigkeit aus dem capil ausströmendenLary Ausgang während dieser Spülschritt. Auch eine Spülung in die entgegengesetzte Richtung für 5 min bei 50 psi führen die BGE-Lösung visuell zu untersuchen, ob Flüssigkeit aus der leitfähigen Kapillare fließt aus. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 bei einem Druck von 100 psi, falls keine Flüssigkeit Tropfenbildung hat am Kapillarauslaß beobachtet. Installieren Sie einen neuen nackten Quarzglas Patrone, wenn keine Flüssigkeit Tropfenbildung während dieses Schritts beobachtet wurde. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit Wasser bei 50 psi für 10 min, gefolgt von 0,1 M NaOH bei 50 psi für 10 min, dann mit Wasser bei 50 psi für 10 Minuten und schließlich mit BGE bei 50 psi für 10 min. HINWEIS: Die Schritte 2.1.1 bis 2.1.4 nur für die Installation einer neuen kapillaren Kassette erforderlich sind. </li></ol></li><li> Die Kopplung der Kapillar - poröse Spitze Emitter ESI-MS HINWEIS: Vor der CE-Kapillare zu MS zu koppeln, sicherzustellen, dass die MS Instrument kalibriert worden ist und mit dem CE-System verbunden. Stellen Sie die ESI-Spannung an0. Den MS-Gerät mit einer Nanospray-Quelle. Gas 1, Gas 2 und Schnittstelle Heizungstemperatur wurden als ESI bei sehr niedrigen Flussraten erfolgt nur durch die Anwendung der Ionensprayspannung eingestellt bei 1500 V. Stellen Sie den Vorhang bei 5 psi nicht angewendet. <ol><li> Entfernen Sie die sprayer Spitze des Quarzglas Patrone aus dem Wasserrohr und installiert es im Nanospray Quellenadapter zum Koppeln mit dem MS Instruments. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der BGE Fläschchen in der CE-Instrument, um die Höhe der Spritze Spitze entsprechen. </li><li> Prüfen, für die Strömung von Flüssigkeit durch die leitfähige Kapillare durch 5 min bei 50 psi mit BGE Spülen. Während dieser Spülung eine Tropfenbildung an der Basis des Zerstäubers ESI Schritt Nadel beobachtet werden sollte. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 10 Minuten in der Vorwärtsrichtung. Tropfenbildung sollte sich an der Spitze des porösen Spitzenemitter (sprayer Spitze) bei diesem Schritt zu beachten. </li><li> Positionieren Sie die poröse Spitze Emitter mit dem Eingang des MS-Einlass in einem Abstand von cIRCA 2 bis 3 mm. </li><li> Tragen Sie eine Spannung von 30 kV eine Rampenzeit von 1 min und starten Sie den Erwerb MS - Daten in der m / z - Bereich von 65 bis 1000 m / z für Studien des metabolischen Profils zunächst eine ESI - Spannung von 0 verwenden. HINWEIS: Das Massenspektrum des Signals ungültig sein sollte, wie es sollte kein Elektro sein. </li><li> Stellen Sie die ESI-Spannung bis 1000 V, während tragen die Daten zu messen. Erhöhen Sie die ESI-Spannung in Schritten von 200 V bis zu einer konstanten Hintergrundsignal wird für mindestens 15 min beobachtet. </li><li> Optimieren Sie die poröse Spitze Emitter Position in Bezug auf die Mitte des MS-Einlass, indem er in der x, y oder z-Richtung bewegt, um zu sehen, welche Position die maximale und stabilsten MS-Signal (Gesamtionen Elektropherogramm) zur Verfügung stellt. </li><li> Nachdem die Position der porösen Spitze Emitter zu optimieren und die optimale ESI Spannung zu bestimmen, stellen Sie die ESI-Spannung auf 0 V und der CE-Spannung von 30 kV bis 1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min mit. </li><li> Erstellen Sie eine MS-Methode using die optimale ESI Spannung und eine CE-Verfahren zur Analyse von Metaboliten-Standards und biologischen Proben auf dem CE-Gerät. </li></ol></li></ol> 3. Analyse der Metabolit Standards und biologischen Proben <ol><li> Leistungsbewertung des sheathless CE-MS - System <ol><li> Transfer 20 ul des anionischen Metaboliten Standardmischung in eine leere 100 ul Microvial (PCR Fläschchen), die in einem CE-Phiole passt und setzen diese Fläschchen in der Einlassprobenschale. HINWEIS: Das Mindestvolumen erforderlich im Microvial für eine zuverlässige Einspritzung 2 ul. <ol><li> Starten Sie den MS Erwerb Negativ-Ionen-Modus Verfahren während Schritt erstellt 2.2.9 und anschließend die CE-Sequenz starten Sie die Software die Steuerung des CE-Instrument. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 3 min, gefolgt von Injektion bei 2,0 psi für 60 sec (20 nl bis 3% des Kapillarvolumens entspricht) und anschließend durch BGE Injektion bei 1,0 psi für 10sek. HINWEIS: Anschließend MS Datenerfassung ausgelöst. </li><li> Übernehmen einer Spannung von -30 kV mit einer Anstiegszeit von 1,0 min mit einem Druck von 0,5 psi für 30 min am Einlass. Nach 30 min elektrophoretische Trennung, MS die Datenerfassung zu stoppen und die CE-Spannung auf -1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min unter Verwendung (eine graduelle Abnahme der CE Spannung nach der elektrophoretischen Trennung um die Haltbarkeit der porösen Spitze kapillaren Emitters verbessert). </li></ol></li><li> Zwischen Probeninjektionen, spülen Sie die Kapillare mit Wasser, 0,1 M Natriumhydroxid, Wasser und BGE jeweils bei 30 psi für 3 min. </li><li> Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten anionischen Metabolit-Gemisch. </li><li> Beurteilen Sie, ob die anionische Metabolit Standards in der Region erscheinen zwischen 10 und 28 min. </li><li> Prüfen , ob drei strukturell verwandten Isomeren, das heißt, D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose-6-phosphatteilweise getrennt, das heißt, die Auflösung zwischen den beiden ersten Spitzen circa 0,75 und der letzten beiden Peaks ist circa 0,50 (siehe Abbildung 1). ANMERKUNG: Eine Auflösung von 1,5 weist auf eine Basislinientrennung von zwei benachbarten Spitzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für die kationische Metabolit-Gemisch. Stellen Sie sicher, dass MS-Detektion ist jetzt in positive Ionen-Modus und CE-Spannung ist 30 kV. </li><li> Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten kationischen Metabolit-Gemisch. </li><li> Beurteilen Sie, ob die kationischen Metaboliten Standards in der Region erscheinen zwischen 8 und 22 min. Überprüfen Sie, ob Isoleucin und Leucin sind zwischen 15 und 15,5 min Migration und bestimmen, ob die Auflösung circa 0,5 ist. </li></ol></li><li> Analyse von biologischen Proben <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für anionische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie. HINWEIS: Die metabolische conZelt nach der Probenvorbehandlungs daher entspricht einer Zelldichte von 20 Zellen / nl, erhalten circa, 20 nl Injektion ist das Äquivalent von 400 Zellen pro Analyse. . </li><li> Erstellen eines extrahierten Ionen Elektropherogramm für den Metaboliten Milchsäure (m / z 89,0243) unter Verwendung von 5 mDa Massengenauigkeit und prüfen Sie, ob die Signalintensität über 100.000 Zählungen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für kationische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie. HINWEIS: Eine sehr informationsreiche Gesamtionen Elektropherogramm sollte für eine 20 nl Injektion in diesem Modus beobachtet werden. </li><li> Nach den Analysen oder wenn nicht in Gebrauch, spülen Sie die Kapillare mit Wasser bei 50 psi für 15 min und speichern den Einlaßteil der Kapillare in ein Fläschchen mit Wasser und dem porösen Abschnitt (Auslassteil) in einem Rohr auch Wasser enthält. </li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts offenzulegen.

A sheathless CE-MS-Verfahren eine poröse Spitze Emitters Verwendung wurde für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten dargestellt. Ein einzigartiges Merkmal dieses Ansatzes ist, dass anionische oder kationische Metaboliten nur profiliert werden können, indem die MS-Detektion und CE Spannungspolarität umgeschaltet wird. Eine breite Palette von hochpolaren und geladenen Metaboliten in biologischen Proben mit einem hohen Abscheidegrad analysiert werden, die strukturell ähnlichen Metaboliten von entscheidender Bedeutung ist, und mit Nachweisgrenzen in der (niedrig) nanomolaren Bereich. Das dargestellte Protokoll konzentrierte sich auf die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolische Profilieren von Zellextrakten, um die Brauchbarkeit des Verfahrens zur metabolischen Profils einer biologischen Probe zu veranschaulichen. Der hier beschriebene Ansatz kann auch für die metabolische Profilieren von anderen Arten von biologischen Proben verwendet werden, wie beispielsweise menschlichem Urin 5, da eine richtige Probenvorbehandlungsverfahren verwendet wird. Die sheathless CE-MS method basiert auf einer porösen Spitze Emitters, der die Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft CE ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist ein stabiles ESI-Signal eine Voraussetzung für eine reproduzierbare metabolischen Profils Studien. Somit ist es wichtig, dass der Sprüher Spitze richtig vor dem MS Einlass positioniert ist. In diesem Set-up ist der ESI-Prozess in erster Linie abhängig von der Art des BGE und daher ist BGE Optimierung von entscheidender Bedeutung. Die sheathless Konfiguration ist weniger vielseitig im Vergleich zu hülsen Flüssigkeit CE-MS-Systemen, wo eine Vielzahl von Mantel-flüssigen Zusammensetzungen zugesetzt werden, um die Ionisationseffizienz zu verbessern. Die sheathless ESI Sprayer Nadel muss vollständig mit leitfähigen Flüssigkeit (dh BGE - Lösung) gefüllt werden. Eine instabile ESI-Signal von einem teilweise oder vollständig verstopft Kapillare führen kann. Spülen bei hohen Drücken mit BGE kann dieses Problem lösen. Anderenfalls muss die Trennkapillare ersetzt werden. Vor der Beurteilung der analytischen Leistung, ein stabiles ESI Hintergrundsignalsollte zuerst erzeugt wird, welche von einem Tag auf den anderen konsistent ist. Die analytische Leistungsfähigkeit des sheathless CE-MS-Methode für metabolischen Profils Studien muss geprüft werden täglich Metabolit Standardmischungen verwenden. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen, konsistente Migrationszeiten, dh Variation unter 3% für within-Tag (n = 10) und zwischen-Tag (n = 5) 20 nl Injektion eines Metaboliten Standardmischung unter Verwendung von (12.5 uM), peak Höhen / Bereiche (Variation von weniger als 15%) und Bodenzahlen (im Bereich zwischen 60.000 und 400.000) sollte erhalten werden. Die Nachweisgrenzen im nanomolaren Bereich für die meisten Metaboliten Standards sein sollte. Nur wenn diese Kriterien erfüllt sind, ist die Methode bereit für metabolischer Profile von biologischen Proben. Wenn nicht, muss die MS Instrument abgestimmt werden und neu kalibriert oder die poröse Spitze kapillaren Emitter geändert werden muss. Eine wirksame Spülschritt zwischen CE-MS-Analysen ist von großer Bedeutung, nicht nur umPotentialverschleppung zu verhindern, sondern auch die Trennleistung zu erhalten. Potentialverschleppung kann mit der Probe und somit durch Ersatz mit neuen BGE Fläschchen gelöst kontaminiert durch BGE Fläschchen verursacht werden. Wenn die sheathless CE-MS-Verfahren nicht verwendet wird, ist es wichtig, die Trennkapillare zu trennen und die Einlaßseite der Kapillare in Wasser zu speichern und mit der Außenseite der Schutzhülle in einem Rohr untergetauchten Wasser enthält Kapillare Lebensdauer zu verlängern. Zusammenfassend zeigt die vorgeschlagene sheathless CE-MS-Methode ein starkes Potential für metabolische Profilierung von biologischen Proben, wenn sie gemäß den in diesem Protokoll angegeben verwendet. In diesem Stadium werden Interlabor-Vergleichsdaten auf jeden Fall erforderlich für sheathless CE-MS, um die (langfristige) Reproduzierbarkeit und Robustheit dieses Ansatzes für Metabolomik zu beurteilen. Dieses Protokoll kann eine solche Studie stimulieren. Verschiedene analytische Herausforderungen müssen noch berücksichtigt werden. Für eine optimale performance sollte der CE Strom vorzugsweise unter 5 &amp; mgr; A gehalten werden, und in diesem Stadium die kapillaren porösen Spitze Emitter nur auf einer Länge von 91 cm vorgesehen ist, welche die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays beeinträchtigen kann. Außerdem wurde ein niedriger pH Trennungspuffer für anionische Metabolic Profiling verwendet, der nicht der optimalste zum Erreichen einer Basislinientrennung von strukturell verwandten Zuckerphosphaten sein. Wichtig ist auch, dass nur anionische Metaboliten analysiert werden können, die (teilweise) negativ unter den verwendeten Trennbedingungen berechnet. Der nächste Schritt ist, wie es derzeit die Brauchbarkeit der sheathless CE-MS-Methode für klinische Studien metabolischen Profils zu bewerten, eine einzige poröse Spitze kapillaren Emitter nur für die Analyse von bis zu 100 biologischen Proben verwendet werden. Insgesamt Weiterentwicklung im sheathless CE-MS - Ansatz wird eine neue Richtung im Bereich der Metabolomics öffnen, dh zu einem tieferen Verständnis der biologischen Funktionen in sreichlich eingeschränkten Fällen.

In der zeitgenössischen Metabolomik, High - End - analytische Trennverfahren ein breites Spektrum von Metaboliten Klassen , um einen Vertreter zu erhalten zu analysieren Auslesen des physiologischen Status eines Organismus 1. Das ultimative Ziel einer Metabolomics-Studie ist eine Antwort auf eine bestimmte biologische / klinischen Fragestellung zu erhalten. Derzeit wird die Human Metabolome Datenbank von mehr als 40.000 Einträge Metaboliten enthalten repräsentieren sowohl endogene und exogene Verbindungen (letztere mit Ursprung aus Nährstoffen, Mikrobiota, Drogen und anderen Quellen) 2. In Anbetracht der großen Vielfalt in physikalisch-chemischen Eigenschaften und Konzentrationsbereich dieser Metaboliten, mehrere Analysetechniken mit unterschiedlichen Trennmechanismen verwendet werden, in Verbindung, um so viele Metaboliten wie möglich Profil in einer bestimmten biologischen Probe. Zum Beispiel Psychogios et al. Verwendeten eine Kombination von fünf analytische Trennverfahren für metabolische profe ling von humanem Serum , was zur Detektion von mehr als 4.000 chemisch unterschiedlichen Metaboliten 3. In diesem Papier wird die Aufmerksamkeit auf neu entwickelte CE-MS Strategien zur metabolischen Profils von biologischen Proben 4,5 bezahlt werden. In CE, spezifischer Kapillarzonenelektrophorese (CZE, normalerweise als CE bezeichnet), sind Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Größenverhältnis getrennt und daher diese analytische Technik ist sehr geeignet für die Analyse von polaren und geladenen Metaboliten. Der Trennmechanismus von CE ist grundsätzlich verschieden von chromatographischen basierte Techniken, wodurch eine komplementäre Sicht auf die metabolische Zusammensetzung von biologischen Proben 6-8 bereitstellt. Soga und Mitarbeiter waren die ersten , die Nützlichkeit der CE-MS für die weltweite Profilierung von Metaboliten in biologischen Proben 9,10 zu zeigen. Bis jetzt hat die Machbarkeit und Nützlichkeit der CE-MS für Metabolomik worden 11-15 weit unter Beweis gestellt.CE wird in der Regel über einen Mantel-Flüssigkeit zu MS gekoppelt Technik Schnittstelle 16,17; Jedoch aufgrund der Verdünnung des kapillaren Abstrom durch die Mantel-Flüssigkeit wird die Detektionsempfindlichkeit intrinsisch beeinträchtigt. Vor kurzem wurde gezeigt , dass die Verwendung einer sheathless Schnittstelle signifikant die Nachweis Abdeckung von Metaboliten verbessert , die in verschiedenen biologischen Proben im Vergleich mit CE-MS 5,18,19 eine klassische Mantel-Flüssig - Grenzfläche verwendet wird . Zum Beispiel, circa 900 molekularen Eigenschaften wurden in menschlichem Urin durch sheathless CE-MS detektiert , während etwa 300 molekularen Eigenschaften mit Mantel-Flüssig - CE-MS 5 beobachtet wurden. Die sheathless Schnittstelle verwendet wurde auf einer porösen Spitze Emitter basiert, die durch Moini 20, erfunden wurde , die effektive Nutzung des eigen niedrigem Fließeigenschaft von CE in Kombination mit nano-ESI-MS ermöglicht. Um die Verwendung von sheathless CE-MS im Bereich der Metabolomik zu stimulieren,ein Protokoll beschreibt dargestellt, wie dieser Ansatz für die Analyse von stark polaren Metaboliten in biologischen Proben verwendet werden, wie für die Analyse von Extrakten aus der Glioblastom-Zelllinie veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die sheathless CE-MS-Verfahren für die Profilierung von kationischen Metaboliten können auch für die Profilierung von anionischen Metaboliten genau die gleichen Kapillare und Trennungsbedingungen unter Verwendung verwendet werden, wodurch die Analysezeit reduziert und eine einzige Analyseplattform für die globale Profilierung der Bereitstellung berechnet Metaboliten. Das Protokoll beschreibt auch eine Strategie für die effektive Ausrichtung der sheathless poröser Spitze Emitter mit dem MS-Instrument.

<table><tbody><tr><td>CESI 8000 Instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td>OptiMS-Adapter erforderlich zum Koppeln von CESI an MS</td></tr><tr><td>OptiMS Quarzglaskartusche, 30&nbsp; &mu; m ID x 90&nbsp; cm Gesamtlänge</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter für Sciex Nanospray III Quelle</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>CESI Fläschchen</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofläschchen</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>Verwendung im Abzug</td></tr><tr><td>Kationisches Metabolitengemisch</td> Human <td>Metabolome Technologies</td><td>H3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>Anionisches Metabolitengemisch</td> Human <td>Metabolome Technologies</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Verwendung im Abzug</td></tr><tr><td>Natriumhydroxidlösung</td><td>Sigma</td><td>72079</td><td>0,1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG Glioblastom-Zelllinie</td><td>Sigma</td><td>89081402</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Giftig; Verwendung im Abzug</td></tr></tbody></table>

sheathless kapillarelektrophorese-massenspektrometrie zur metabolischen profils von biologischen proben

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In Metabolomics wird für die weltweite Profilierung (endogen) Metaboliten in komplexen Proben eine Vielzahl von analytischen Techniken verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die Analyse von anionischen und kationischen Metaboliten in biologischen Proben durch Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) präsentiert. CE ist gut geeignet für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten als Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung zu Grßenverhältnis getrennt sind. Eine kürzlich entwickelte sheathless Schnittstellenentwurf, dh ein poröser Spitze Schnittstelle zur Kopplung CE Elektrospray - Ionisation (ESI) MS verwendet. Diese Schnittstelle Ansatz ermöglicht die effektive Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft von CE in Verbindung mit MS, für ein breites Spektrum von polaren Metaboliten Klassen in Nanomol Nachweisgrenzen führt. Das Protokoll hier vorgestellten basiert einem nackten Fused-Silica-Kapillare mit einer porösen Spitze Emitters bei niedrigen pH-Trennbedingungen für die Analyse einer auf den Einsatzbreite Palette von Metabolitenklassen in biologischen Proben. Es wird gezeigt, dass die gleiche sheathless CE-MS-Methode kann für die Profilierung von kationischen Metaboliten verwendet werden, einschließlich Aminosäuren, Nukleoside und kleine Peptide oder anionische Metaboliten, einschließlich Zuckerphosphaten, Nukleotide und organische Säuren, indem nur die MS-Erfassungsschalt und Trennspannung Polarität. Hochinformationsreichen metabolischen Profilen in verschiedenen biologischen Proben, wie Urin, können Zerebrospinalflüssigkeit und Extrakte der Glioblastom-Zelllinie, die von diesem Protokoll in weniger als 1 h CE-MS-Analyse erhalten werden.

Die vorgeschlagene sheathless CE-MS - Methode ist in der Lage hocheffiziente Bereitstellung dh Plattennummern im Bereich von 60.000 bis 400.000, Profile für die anionische und kationische Metaboliten bei nanomolaren Nachweisgrenzen unter Verwendung von 10% Essigsäure (pH 2,2) als BGE. Die Trennleistung des Verfahrens für die Analyse von stark polaren anionischen Metaboliten für drei strukturell verwandten Zuckerphosphat - Isomeren (1) gezeigt. Obwohl eine Basislinientrennung nicht für diese drei Analyten erhalten wurde, ist eine teilweise Trennung ausreichend ihre selektiven Nachweis von MS zu ermöglichen, da diese Analyten exakt das gleiche Masse haben. Das Potential des sheathless CE-MS Methode zur metabolischen Profils der begrenzten Anzahl von Zellen, dh ein 20 nl Injektion entspricht 400 Zellen (Zelldichte etwa 20 Zellen / nl), wird für die Analyse der kationischen Metaboliten in einem Extrakt nachgewiesen der Glioblastom-Zelllinie (Abbildung 2), in denen mehr als 300 molekularen Eigenschaften über einem S / N-Verhältnis ≥ 5 detektiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Abbildung 1. Analyse der Zucker - Phosphat - Isomeren durch sheathless CE-MS. Extrahiert Ion Elektropherogramm für drei Zucker - Phosphat - Isomere (25 &amp; mgr; M) , erhalten mit sheathless CE-MS im Negativ - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung von -30 kV (+0,5 psi am Einlass der CE-Kapillare angelegt); Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. Mit Genehmigung 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Isoleucin und Leucine durch sheathless CE-MS. Extrahierte Ionen - Elektropherogramm von zwei Aminosäure Isomeren (25 uM) , erhalten mit sheathless CE-MS in positiven Ionenmodus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektion, 2,0 psi für 60 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Abbildung 3. Potential von sheathless CE-MS zur Profilierung kationischen Metaboliten in einer Zelllinie Extrakt. Metabolic Profil (Gesamtionen Elektropherogramm) beobachtet in einem Extrakt eines Glioblastom - Zelllinie mit sheathless CE-MS im Positiv - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. 4 Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung </sup&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Ein Protokoll zur metabolischen Profils von biologischen Proben mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie eine sheathless poröse Spitze Interface-Design unter Verwendung vorgestellt.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) unter Verwendung einer mantelfreien Schnittstelle mit poröser Spitze zur Analyse hochpolarer und geladener Metabolite eingesetzt werden kann. Da angenommen wird, dass Metabolite häufig geladen sind und entweder kationisch oder anionisch sein können, ist die Trennung mittels elektrophoretischer Verfahren wie der Kapillarelektrophorese die am besten geeignete Methode. In den letzten Jahren war jedoch die Empfindlichkeit nicht ausreichend.Das lag an der Schnittstelle, und die Methode war außerdem nicht robust. Ich denke jedoch, dass wir beide Probleme elegant gelöst haben, indem wir eine Umhüllung als freie Schnittstelle verwenden und dieses neue Protokoll anwenden. Die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie unter Verwendung einer neuartigen hüllelosen porösen Spitzen-Schnittstelle kann zur Beantwortung zentraler klinischer Fragestellungen im Bereich der Metabolomik eingesetzt werden.Beispielsweise kann mit dieser Technologie die Profilierung hochpolarer, geladener Metabolite leicht durchgeführt werden. S-Komposite werden basierend auf dem Verhältnis von Ladung zu Größe getrennt. Häufig eignet sich diese Technik sehr gut zur Profilierung dieser Art von Verbindungen, die volumenmäßig an biologische Proben gekoppelt sind.Ein einzigartiges Merkmal der vorgeschlagenen schalenlosen CE-MS-Methode besteht darin, dass sie zur Profilierung anionischer und kationischer Metaboliten verwendet werden kann, indem lediglich die Spannungspolarität der Kapillarelektrophorese und die Detektionspolarität des Massenspektrometers umgeschaltet wird. In der Regel haben Neulinge bei dieser Methode Schwierigkeiten, da die CE-MS als eine relativ neue und komplizierte Technik gilt. Um dieses Verfahren zu beginnen, setzen Sie eine neue nackte Fused-Silica-Kartusche mit einem porösen Tipp-Emittierer in das Gerät für die Kapillarelektrophorese, oder CE-Instrument, ein.Führen Sie eine Vorwärts-Spülung mit Methanol bei 50 psi für 15 Minuten durch, wobei die Software das CE-Instrument steuert. Überprüfen Sie visuell, ob Flüssigkeit aus dem Kapillaraustritt austritt. Führen Sie anschließend eine Spülung in entgegengesetzter Richtung bei 50 psi für fünf Minuten mit dem Hintergrundelektrolyt oder BGE-Lösung durch, um visuell zu überprüfen, ob Flüssigkeit aus der leitfähigen Kapillare austritt.Wiederholen Sie den vorherigen Schritt bei einem Druck von 100 psi, falls keine Flüssigkeit aus dem Kapillaraustritt austritt. Spülen Sie anschließend die Trennkapillare mit Wasser bei 50 psi für 10 Minuten, gefolgt von 0,1 molarer Natronlauge bei 50 psi für 10 Minuten, Wasser bei 50 psi für 10 Minuten und BGE-Lösung bei 50 psi für 10 Minuten. Danach entfernen Sie die Sprühtülle der Quarzglas-Kassette aus dem Wasserschlauch und installieren sie in den Nanospray-Quellenadapter zur Kopplung mit dem MS-Gerät.Stellen Sie sicher, dass die Höhe der BGE-Lösungsgefäße im CE-Gerät mit der Höhe der Sprühspitze übereinstimmt. Überprüfen Sie den Fluss der Flüssigkeit durch die leitfähige Kapillare, indem Sie fünf Minuten lang mit BGE-Lösung bei 50 psi spülen. Während dieses Spülschritts sollte ein Flüssigkeitstropfen an der Basis der Elektrospray-Ionisierung oder der ESI-Sprühnadel beobachtet werden.Nach dem Spülen spülen Sie die Trennkappele mit BGE-Lösung 10 Minuten lang in Vorwärtsrichtung bei 50 psi durch. Während dieses Schritts sollte ein Flüssigkeitstropfen an der Spitze des porösen Tip-Emitters sichtbar sein. Positionieren Sie nun den porösen Tip-Emitters am Eingang des MS-Zulaufs in einem Abstand von etwa zwei bis drei mm.Wenden Sie eine Spannung von 30 kV mit einer Anstiegszeit von einer Minute an und beginnen Sie mit der Erfassung von MS-Daten im Massen-zu-Ladungs-Bereich von 65 bis 1000 für metabolomische Profilierungsstudien, wobei zunächst eine ESI-Spannung von null verwendet wird. Stellen Sie die ESI-Spannung auf 1000 V ein, während Sie die Daten aufnehmen. Erhöhen Sie die ESI-Spannung in Schritten von 200 V, bis mindestens 15 Minuten lang ein konstantes Hintergrundsignal beobachtet wird.Übertragen Sie 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten anionischen Metaboliten-Standardmischung in ein leeres 100-Mikroliter-Mikrovial. Stellen Sie das Mikrovial in ein CE-Vial und setzen Sie das CE-Vial in das Probeneingabefach. Starten Sie eine zuvor erstellte MS-Akquisition im negativen Ionenmodus und anschließend die CE-Sequenz mithilfe der Software zur Steuerung des CE-Instruments.Danach die Trennkappele mit BGE-Lösung bei 50 psi drei Minuten lang spülen, gefolgt von Injektionen bei zwei psi für 60 Sekunden und ein psi für 10 Sekunden. Eine Spannung von 30 kV mit einer Anstiegszeit von einer Minute und einem Druck von 0,5 psi für 30 Minuten am Einlass anlegen. Nach einer 30-minütigen elektrophoretischen Trennung die MS-Datenaufnahme stoppen und die CE-Spannung innerhalb von fünf Minuten Anstiegszeit auf 1 kV verringern.Zwischen den Probeninjektionen spülen Sie die Trennkappele mit Wasser, 0,1 molarer Natronlauge, Wasser und BGE-Lösung bei 30 psi drei Minuten lang. Sobald die Läufe abgeschlossen sind, analysieren Sie die aufgezeichneten Daten, indem Sie die Migrationszeiten und die Signalintensität der analysierten anionischen Metabolitenmischung bestimmen. Beurteilen Sie, ob die Standards der anionischen Metaboliten im Bereich zwischen 10 und 28 Minuten erscheinen.Überprüfen Sie anschließend, ob die drei strukturell verwandten Isomere, D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose-6-phosphat, teilweise getrennt werden. Die Trennleistung der schalenlosen CE-MS-Methode für die Analyse hochpolarer anionischer Metaboliten wird anhand von drei strukturell verwandten Zuckerphosphat-Isomeren demonstriert. Obwohl eine Basistrennung für diese drei Analyten nicht erreicht wurde, ist eine teilweise Trennung ausreichend, um deren selektive Detektion mittels MS zu ermöglichen, da diese Analyten dieselbe exakte Masse besitzen.Bei der Analyse biologischer Proben ist es bei Verwendung dieser mantelfreien CE-MS-Methode wichtig, die analytische Leistung über die Zeit hinweg regelmäßig mithilfe akademischer Standards zu überprüfen. Insgesamt ermöglicht die mantelfreie Methode die Charakterisierung dieser Art von Verbindungen in extrem kleinen biologischen Proben und eröffnet damit zahlreiche Möglichkeiten zur Analyse solcher Proben in den Bereichen der biomedizinischen Wissenschaften, der bioanalytischen Chemie sowie weiterer Forschungsgebiete. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CE über eine mantelfreie poröse Schnittstelle mit MS koppelt, um hochpolare und geladene Metaboliten zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

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