Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation leiden weltweit 360 Millionen Menschen an Hörverlust mit tiefgreifenden Folgen für das Berufs- und Privatleben. Hörgeräte können die sensorische Funktion bei mittelschwerem Hörverlust wiederherstellen. In den schwersten Fällen ist jedoch die effektivste Behandlungsoption eine Prothese, die als Cochlea-Implantat (CI) bezeichnet wird. CIs enthalten ein lineares Elektrodenarray von bis zu 24 Elektroden, das chirurgisch in die Scala tympani der Cochlea eingeführt wird. Die Elektroden stimulieren direkt die Neuronen des Spiralganglien, wodurch der Hörnerv ¹ gebildet wird.

Mit mehr als 300.000 implantierten Geräten weltweit sind CIs sehr erfolgreiche medizinische Implantate und gehören zu den kostengünstigsten Verfahren, über die jemals berichtet wurde. Trotz seines Erfolgs weist das Cochlea-Implantat immer noch Einschränkungen auf, wie z. B. eine geringere Frequenzauflösung im Vergleich zum physiologischen Hören. Dies kann zu Defiziten in der effektiven Kommunikation in Gruppen oder lauten Umgebungen und der Fähigkeit führen, sehr komplexe Klänge wie Musik zu entschlüsseln. Diese verringerte Frequenzauflösung ist wahrscheinlich auf die Lücke zwischen den CI-Elektroden und den Neuronen der Spiralganglien zurückzuführen, was zu einer Stimulation großer Gruppen von Neuronen führt. Dieser Spalt liegt im Bereich von Hunderten von Mikrometern ^2,3. Die Beseitigung dieser Lücke würde die Stimulation kleinerer Gruppen von Neuronen pro Elektrode erleichtern, wodurch die Frequenzauflösung und die Gesamtleistung des Geräts ^{erhöht würden 4}.

Um den Einfluss des Spalts zwischen Elektrode und Neuron und die Wirkung verschiedener optimierter Stimulationsprotokolle zu untersuchen, haben wir einen in vitro Bioassay entwickelt, der auf einer nicht-invasiven elektrophysiologischen Charakterisierung von SGNs auf Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) basiert ⁵. Darüber hinaus können MEAs leicht modifiziert werden, um Elektrodenform, -größe, -material und -oberflächenrauheit zu variieren und so die Neuron-Elektroden-Grenzfläche zu optimieren. Im Folgenden finden Sie ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um reproduzierbare Aufzeichnungen aus murinen Spiralganglien-Neuronenkulturen zu erhalten und die Abhängigkeit von den oben genannten Parametern zu beurteilen.

Tierpflege und Experimente wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Schweizer Gemeinden (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Schweiz) durchgeführt.

1. Bereiten Sie Lösungen für Experimente

1. Bereiten Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) Beschichtungslösung (siehe Materialtabelle, Punkt 6): Thaw ECM - Mix auf Eis. Verdünnen Sie die ECM-Mix 1:10 in Grundkulturmedium (ohne neurotrophe Faktoren oder fötalem Rinderserum (FBS)) und auf Eis halten.
2. Bereiten Sie das Kulturmedium (siehe Materialtabelle, Punkt 1): Bereiten Sie einen Vorrat von Neurobasalmedium nicht enthält FBS oder Gehirn - derived neurotrophic factor (BDNF). Ergänzung Neurobasal Medium mit frischem FBS (10%) und BDNF (5 ng / ml) unmittelbar vor der Zellkultur hinzugefügt wird.
3. Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung (siehe Materialtabelle, Punkt 2).

2. Waschen und Sterilisation von MEAs

(1E) angeordnet ist . Jede Elektrode hat eine Größe von 40 x 40 & mgr; m ² mit einem Abstand von 200 um von Mittelpunkt zu Mittelpunkt. Die Elektroden sind aus Platin. Die Elektroden werden durch eine Schaltung mit den entsprechenden Kontakten verbunden Oxid aus Indium-Zinn. Diese Schaltung wird durch eine 5 & mgr; m Schicht aus SU-8 isoliert. Siehe Materialtabelle für Details zu dem Anbieter. Weitere MEA-Layouts können für diese Experimente geeignet sein.

1. Für neue MEAs: Spülen Sie nach 30 Sekunden in 70% Ethanol eingetaucht und wäscht mit destilliertem Wasser für 30 Sekunden. Arbeiten Sie in einem Laminar-Flow-Haube.
2. Lassen Sie die MEA trocken für 30 Minuten in einer laminaren Strömung Haube.
3. Setzen Sie jede MEA in eine individuelle sterile Petrischale (35 mm x 10 mm) und Dichtung mit Folie. Die MEAs können bis zur Verwendung gelagert werden.
4. Bei gebrauchten MEAs: Inkubieren Sie die MEAs in einer Petrischale (35 mm x 10 mm) mit 1 ml der enzymatischen solutIon (siehe Materialien Tabelle, Punkt 6) O / N auf Schüttler bei RT biologischen Material zu entfernen. Dann weiter wie in Schritt 2.1.
   HINWEIS: Behandeln Sie die MEAs mit Sorgfalt Zange mit gummierte Tipps.

3. Herstellung von MEAs für Kultur Experimente

1. Entfernen Sie die Dichtungsfolie und lassen Sie die MEA in der Petrischale (35 mm x 10 mm) für das gesamte Experiment.
2. Bestreichen Sie die MEAs mit der Lösung in 1.1 hergestellt: Verwenden Sie eine kalte 200 ul Pipettenspitze (bei -20 ° C) 50 ul Beschichtungslösung zu pipettieren zu jeder MEA, die das gesamte Elektrodenfläche.
3. Erlauben MEAs zu beschichten für 30 min bis 1 h bei RT.
4. Entfernen Sie die Beschichtungslösung mit einer Pipette. Bewerben 100 ul Kulturmedium, das mit 10% FBS und 5 ng / ml BDNF und lassen Sie es bei RT, bis das Gewebe Plattierung.
5. Platzieren 2 Petrischalen, die beschichteten MEAs in eine große Petrischale mit (94 mm x 16 mm) und eine dritte kleine Petrischale hinzuzufügen, die 1,5ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zur Befeuchtung.
   HINWEIS: eine kleine Petrischale (Schritt 3.5) mit PBS Hinzufügen von entscheidender Bedeutung ist wesentlich Verdampfung von Kulturmedium zu minimieren.

4. Spiralganglion Dissection

HINWEIS: Gross Dissektion kann außerhalb des Laminarströmungsabzug erfolgen (Schritt 4.1 bis 4.4). Für feine Dissektion sterilen Bedingungen (Laminar-Flow-Haube) sind Pflichtfelder (aus Schritt 4.5).

1. Euthanize Tiere (5-7 Tage alte Mäuse) durch Enthauptung ohne vorherige Betäubung.
2. Sterilisieren Sie den Kopf, indem sie mit 70% Ethanol gesprüht wird.
3. Durch den Kopf hält, schneiden Sie die Verbindung zwischen der Haut und dem Schädel mit einem scharfen / spitzen Schere entlang der Sagittallinie.
4. Schneiden Sie den Schädel sagittal und entfernen Sie das Gehirn mit scharfen / stumpfe Schere.
5. Schneiden Sie die zeitliche Knochen aus dem Schädel und legen Sie die in einer Petrischale mit steriler eiskalter Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS).
6. Mit Hilfe eines dissection Mikroskop, sezieren die Bulla tympanica feinen Pinzette und das Innenohr zu isolieren.
7. Entfernen Sie die Knochen der Cochlea, mit einer feinen Pinzette.
8. Entfernen Sie das Spiralband und Stria vascularis (SV) zusammen, indem sie mit einer Pinzette den basalen Teil des Spiralganglion (SG) und der SV Holding und langsam Abwickeln des SV von der Basis-to-Spitze
9. Isolieren Sie das Corti - Organ (OC), die SG und die modiolus (1A - C)
10. Trennen Sie die OC von der SG und modiolus, indem sie mit einer Pinzette den basalen Teil der SG Holding und der OC und Abwickeln langsam die OC von Basis-Spitze.
11. Geschnittene Seiten Explantate (200 bis 500 um Durchmesser) aus dem Ganglion spirale befestigt noch mit dem Modiolus (1D) eine Zange und eine Mikroskalpell verwendet.

5. Spiralganglion Explantation Kultur auf MEAs

1. Platzieren zwei Spiral Ganglion-Explantate neben den Elektroden auf der MEA zuvor hergestellten mit 100 & mgr; l Kulturmedium.
2. Legen Sie das Corti-Organ etwa 5 mm von der Elektrodenfläche.
3. Verwenden einer Pinzette die Explantate an Pin und das Corti-Organ auf die MEA unter Vermeidung der Gewebe zu schädigen.
4. Legen Sie die MEAs vorsichtig in den Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5% CO _2. Am nächsten Tag, visuell überprüfen, dass die Explantate auf der MEA angebracht haben.
   HINWEIS: Wenn Explantate nicht O / N gebunden haben, werden sie nur selten so in den nächsten Tagen tun. Das OK ist für trophische / neurotrophic Unterstützung neben der Kultur gelegt.
5. Füge 100 & mgr; l Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und BDNF täglich für 5 aufeinanderfolgende Tage.
6. Am Tag 6 2 ml Kulturmedium werden 10% FBS und 5 ng / ml BDNF und Kultur das Gewebe für weitere 13 Tage enthält.

6. elektrophysiologischen Ableitungen Spontan und Elektrodenstimulation abhängige Aktivität zur Untersuchung

1. Waschen Sie die MEA Kultur mit extrazellulären solution vorbereitet 1.3, bei RT in Schritt.
2. Trocknen Sie die Kontakte mit einem Gewebe und montieren Sie die MEA auf der MEA-Setup.
   HINWEIS: Damit die Kultur feucht während der Montage, einen kleinen Tropfen der extrazellulären Lösung der Kultur hinzuzufügen.
3. In 300 ul extrazellulären Lösung und warten Sie 10 Minuten vor der Aufnahme, damit das System zu stabilisieren.
4. Nehmen Sie spontane Aktivität für 2 min von allen Elektroden auf der Platte drücken / erwerben Taste der Software und der Aufzeichnungselektroden zu identifizieren.
5. MEA Elektrodenstimulation: Wählen Sie die Amplitude / Dauer / Form des Reizes auf die entsprechende Software und gelten für mehrere Elektroden nacheinander als ¹³ beschrieben. Wählen Sie die Elektroden auf der Basis auf die, die zeigt spontane Aktivität (wie in Schritt 6.4). Die Bilanz von all den übrigen Elektroden.
6. Auf Stimulation Artefakt auszuschließen, stimulieren aus derselben Elektrode 10 mal. Wenn die Kultur mindestens 8 von 10 mal reagiert, kann es als ein ausgegangen werden,positive Reaktion auf Elektrode induzierte Stimulation.
7. Zur Identifizierung von Hintergrundrauschen, gelten Tetrodotoxin (TTX) an den cultureat einer Konzentration von 1 & mgr; M zu blockieren spannungsgesteuerten Natriumkanäle und Rekord für 2 min. Verwenden Sie diese Spike-Erkennung durchführen (7.1 und 7.2).

7. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse wurde im Detail in ⁶ und ⁵ zuvor beschrieben. Für Einzelheiten zur Software in dieser Studie verwendeten siehe Materialien Tabelle, Punkt 7.

1. Mit der entsprechenden Software erkennen spontane Aktivität für jede Elektrode einen Detektor auf Basis von Standardabweichungen und einem anschließenden Unterscheider verwendet wird. Dieses Verfahren ist in ⁶ beschrieben. Aktivität wird als schnelle Spannungsspitzen (<5 ms).
2. Wählen Sie eine Schwelle, die in keiner Aktivität resultiert, wenn die TTX Analyse behandelt samples.Adapt den Schwellenwert für jedes Experiment zwischen falsch positiv zu diskriminierene und falsch negativen Erkennungen.
3. Verwendung geeigneter Software beobachten die detektierte neuronale Aktivität jeder Elektrode als Rasterstück nach Standardverfahren (siehe 2A - C).
4. durch Addition aller erfassten Ereignisse innerhalb eines Schiebefensters von 10 ms, verschoben um 1 ms Schritten ermitteln und die gesamte Netzwerkaktivität anzuzeigen.
5. Detect Stimulation induzierte Aktivität durch die Rohdaten mit Hilfe geeigneter Analysesoftware angezeigt wird. Identifizieren Sie die offline manuell einzelne Spikes. Einzelne Spitzen erscheinen als schnelle Spannungsspitzen, auftreten nach der Stimulation Artefakt (Pfeilspitze in Abbildung 2E). Ein Beispiel ist in Figur 2E dargestellt ist .
6. Je nach Experiment, analysieren , um die Anzahl der Elektroden reagiert, den Schwellenwert erforderlich , um eine Reaktion, die Anzahl der Aktionspotential ⁵ pro Elektroden und andere Parameter von Interesse zu erreichen.

8. Gewebefixierung und Immunohistochemistry

HINWEIS: Der Färbeprozess der MEA zerstören wird. Siehe Materialtabelle (Punkt 4) für Reagenzien.

1. Direkt nach der Aufnahme waschen die Kulturen mit 37 ° C warmem PBS dreimal. Verwerfen Sie den PBS und anzuwenden 4% Paraformaldehyd (PFA) (in PBS), vorgewärmt auf 37 ° C für 10 min.
   ACHTUNG: PFA ist giftig. Die Arbeit in einer chemischen Haube mit angemessenen Schutz und Ablagelösung gemäß den Richtlinien.
2. Waschen Sie die Kulturen dreimal mit PBS und Blockieren mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (0,01% Triton-X100) für 2 Std.
3. Fügen Sie den ersten Antikörper (Anti-βIII Tubulin, TUJ Antikörper), verdünnt in PBS (2% BSA und 0,01% Triton-X100) und O / N bei 4 ° C belassen. Waschen Sie die Kultur dreimal mit PBS.
   HINWEIS: Von nun an die Probe halten im Dunkeln so oft wie möglich Bleichen des sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper zu minimieren.
4. Fügen Sie den sekundären Antikörper, verdünnt in PBS (2% BSA eind 0,01% Triton-X100) und für 1 bis 2 h bei RT inkubiert. Beflecken Kerne hinzufügen 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml Brühe) für 10 min.
5. Waschen dreimal mit PBS und montieren Sie die Proben nach hinten zu dünnen Deckgläser (24 x 50 mm ²⁾ mit Befestigungsmedium (siehe Materialien Tabelle, Punkt 4). Bild eines Fluoreszenzmikroskops mit 5X und 20-facher Vergrößerung verwendet wird.

Abbildung 1 fasst das Verfahren zur Gewebe Isolierung, Herstellung und Kultur auf MEA. Wir zeigen die aufeinanderfolgenden Schritte der Gewebedissektion die Spiralganglion (SG) aus dem Sinnesepithel des Corti - Organ (OC) und Stria vascularis (SV) und im Anhang Spiralband (Abbildung 1 A - C) zu isolieren. Spiralganglion Explantate (3-4 an der Zahl) werden geschnitten mit Mikroscheren aus dem Ganglion , wie schematisch in Figur 1D dargestellt und auf MEA (Abbildung 1E), über die Elektrode belegte Fläche (2,2 mm 2). Der OC ist in der Nähe, außerhalb der Elektrodenoberfläche gebracht. Das Wachstum der Kultur kann im Laufe der Zeit (Figur 1G) überwacht werden. Ein schematisches Diagramm des Protokolls ist in Figur 1F gezeigt ist . Elektrophysiologischen Aktivität kann nach 6 Tagen der Kultur nachgewiesen werden, was bei längerer Kultivierungszeit erhöhen. Wir sindecommend Beurteilung 18 Tage Kulturen , die deutlich höhere Anzahl von Aufzeichnungselektroden produzieren im Vergleich zu früheren Zeitpunkten 5.

Abbildung 1. Zellkultur Vorbereitung. (A) Frisch Maus Innenohr seziert. Weiß gestrichelte Linie zeigt die Lage der Cochlea, schwarz gestrichelte Linie die vestibulären Region anzeigt. (B) Maus Innenohr nach dem Entfernen der Cochlea Knochenwand. Cochlea-Windungen sind durch weiße gestrichelte Linien angedeutet. (C) Das Spiralganglion (SG) und modiolus, das Corti - Organ (OC) und die Stria vascularis (SV) und Ligamentum spirale sind nach der Sektion gezeigt. (D) Schematische Darstellung der SG und OC Dissektion und SG Explantatherstellung {figure 5 mit Genehmigung des Herausgebers angepasst}. (E) Illustration des Multi - Elektrodenanordnung in dieser Studie verwendet. UmschlüsselungElektroden sind in einem rechteckigen Raster in der Mitte und nehmen eine Fläche von 2,2 mm 2 durchgeführt. 4 Erdungselektroden und Seitenkontakte dargestellt. (F) Schematische Darstellung des Kulturprotokoll. Die Aufnahmen werden am Tag 18 (G) Repräsentative Bilder (Hellfeld - Bilder) und Systeme der SG - Explantate auf MEA in Kultur am Tag 1, 6 und 18 Maßstabsbalken = 400 & mgr; m. Überwacht durchgeführt Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Spontane Aktivität kann auf MEA detektiert werden und als Raster Plot gezeigt, wo jede Zeile der Plot eines erfassten Spitze darstellt. Ein repräsentatives Beispiel spontane Aktivität von mehreren Elektroden (verschiedene Farben in den Diagrammen) detektiert zeigt gezeigt (2A, 2B und 2C).

(Figur 2D), 5 reagiert Elektroden (rot Spuren) und nicht-antwort Elektroden (blau Spuren) zeigt , ist in Figur 2E dargestellt ist . Für diese Experimente wurde zur Stimulation und all die anderen Elektroden für die Aufnahme einer Elektrode verwendet. Einzelaktionspotentiale erschienen 1 ms nach der Stimulation Artefakt (schwarzer Pfeil Kopf). Die MEA kann am Ende des Verfahrens werden, um immunhistochemisch die Abdeckung der neuronalen Prozesse über die Elektrodenfläche zu bewerten. Die Elektrode in grün in 2F angegeben wurde zur Stimulation verwendet, und die in rot angezeigt Elektroden wurden verwendet , um Antworten (Abbildung 2E) aufzeichnen.

Abbildung 2. Datenaufzeichnungen auf MEA. (A </ Strong>) Spuren von Original-Aufnahmen von sechs von 63 Elektroden spontane Aktivität zeigt. (B) Raster - Plot der sechs Elektroden von 2A nach Spike - Erkennung. Jeder Balken stellt ein Aktionspotential. (C) Raster Grundstück einschließlich aller Elektroden (wie in A und B) Die Aktivität wird von 63 Elektroden (Kanäle Zahl 0-63) für 2 min aufgezeichnet. (D) Eine zweiphasige Anregung mit Gesamtdauer von 80 us und einer Amplitude von 80 & mgr; A wurde zur Stimulation der Kultur von einer Elektrode (E58 in Figur 2F) verwendet. (E) Ein repräsentatives Beispiel von Rohdaten Spuren nach der Stimulation von der Elektrode erhalten 58 zeigt Aktionspotentiale (rote Spuren) oder ohne Antworten (blaue Spuren) nach Stimulation (schwarzer Pfeil-Kopf). (F) Ganglion spirale Kultur auf MEA immunhistochemisch für den neuronalen Marker TUJ (grün) am Ende des Experiments neuro zu visualisieren nal Abdeckung des Elektrodenfläche {Figur angepasst 5 mit Genehmigung des Herausgebers}. Die Elektrode 58 für die Stimulation verwendet wird in grün angezeigt, reagiert Elektroden werden in rot angezeigt. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Schließlich ermöglicht die MEA-Setup möglich Elektrodenoberflächenmodifikation für das Studium, die Aufzeichnungsempfindlichkeit erhöhen. Zwei im Handel erhältliche MEA-Elektroden wurden in dieser Studie mit zwei unterschiedlichen Platinoberflächen verwendet: Grau Platin (Grau Pt), bestehend aus einer 150 nm dicken Pt-Schicht (Impedanz: 400 kOhm / 1 kHz) und Schwarz Platin (Schwarz, Pt), durch elektrochemische Abscheidung von Pt an dem Ende des Mikroherstellungsprozesses erhalten (Impedanz: 20 K & Omega; / 1 kHz). Siehe Werkstoff - Tabelle (Punkt 6) für weitere Einzelheiten.

Abbildung 3. Vergleich von Grau vs Schwarz Pt - Elektroden. Zwei Arten von Elektroden (grau und schwarz Pt) wurden an Seite verglichen Seite 12 unabhängige MEA Kulturen, 6 auf jeder MEA - Typ. (A) Die Gesamtzahl der Wiederchenden Elektroden pro Experiment gezeigt. (B) Amplitudenschwelle eine Antwort zu entlocken, gemessen 30-35 unabhängige Elektrodenpaare in 6 unabhängigen MEA Experimenten unter Verwendung gezeigt. Daten sind als Mittelwert +/- SD gezeigt. (Student t - Test p <0,001) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.