Methodenartikel

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

DOI:

10.3791/54539

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4. August 2017

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1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Fettgewebe Stammzellen (ASC) leicht zu isolieren und aus dem Fett von normalen Ratten geerntet. ASC Blätter können mit Handy-Blatt Engineering erstellt werden und können in Zucker Diabetiker fetthaltige Ratten ausstellenden voll-dicke Haut Mängel mit freiliegenden Knochen und dann bedeckt mit einem Bilayer künstlicher Haut transplantiert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Künstlicher Haut erzielt erhebliche therapeutische Ergebnisse in der klinischen Praxis. Jedoch können künstliche Hautbehandlungen für Wunden bei diabetischen Patienten mit behindert Blutfluss oder große Wunden verlängern. Zellbasierte Therapien erschienen als eine neue Technik für die Behandlung von diabetischen Geschwüren und Zelle-Blatt-Technik verbessert die Wirksamkeit der Zelltransplantation. Eine Reihe von Berichten haben vorgeschlagen, dass Fettgewebe Stammzellen (ASC), eine Art mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC), therapeutisches Potenzial aufgrund ihrer relativen Fülle in Fettgewebe und ihre Zugänglichkeit für die Sammlung im Vergleich zu MSCs aus anderen Geweben zeigen. Daher erscheinen ASC eine gute Quelle für Stammzellen für therapeutische Zwecke. In dieser Studie wurden ASC Blätter aus dem epididymal Fettgewebe Fett von normalen Lewis Ratten mit Temperatur-responsive Kultur Gerichte und normalen Kulturmedium mit Ascorbinsäure erfolgreich erstellt. Die ASC-Blätter wurden in Zucker Diabetes Fettsäuren (ZDF) Ratten verpflanzt, einem Rattenmodell von Typ-2-Diabetes und Adipositas, die verminderte aufweisen Wundheilung. Eine Wunde auf der hinteren kranialen Oberfläche erstellt wurde, ASC Blätter wurden in der Wunde verpflanzt und einem Bilayer Kunsthaut wurde verwendet, um die Blätter zu decken. ZDF-Ratten, die ASC Blätter erhalten hatte besser als ZDF Ratten ohne die Transplantation von ASC Blätter Wundheilung. Dieser Ansatz war begrenzt, da ASC Blätter empfindlich gegen Trockenheit sind, erfordert die Aufrechterhaltung eines feuchten Wundmilieus. Daher wurde Kunsthaut verwendet, um das ASC-Blatt, um Austrocknen zu verhindern, dass zu decken. Die allogene Transplantation von ASC-Blatt in Kombination mit künstlicher Haut könnten auch für andere hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, wie Sie mit peripheren arteriellen Verschlusskrankheit und Kollagen-Krankheit beobachtet und könnte für Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden verabreicht werden. Somit wäre diese Behandlung der erste Schritt zur Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten für Diabetiker, die Wunde heilen.

Einleitung

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Die Bevölkerung von Diabetes-Patienten steigt weltweit und 400 Millionen in 20151erreicht; schätzungsweise 15-25 % der Patienten mit Diabetes sind durch das Fortschreiten der unteren Extremität diabetische Geschwüre2gefährdet. Untere Extremität diabetische Geschwüre sind unlösbar und therapeutische längere mit Aufbautraining nach der vollständigen Wiederherstellung erfordern möglicherweise. Periode oft lange Therapie führt zu einem deutlichen Rückgang der Lebensqualität von Patienten. So müssen neue Therapien, die zu verringern oder zu vermeiden Ärger für die Behandlung von diabetischen Wunden entwickelt werden. Um diabetische Wundheilung zu bewerten, haben wir ein diabetisches Geschwür Wundheilung Modell bei Ratten, die praktische klinischen Bedingungen imitiert, optimiert und bewertet ob Umpflanzen Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) Blätter mit Zelle-Blatt Technik beschleunigt die Wundheilung.

Mesenchymale Stromazellen Zellen (MSCs) weisen ein ausgezeichnetes Potenzial zur Beschleunigung der Wundheilung aufgrund ihrer Selbsterneuerung Kapazität, ihre immunmodulatorische Wirkung und ihre Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelle Linien3differenzieren. ASC sind eine Art von MSC abgeleitet aus Fettgewebe, und sie weisen mehrere Vorteile gegenüber MSCs aus anderen Geweben, einschließlich ihrer potenziellen angiogenen und parakrine Aktivität4,5abgeleitet. Fettgewebe ist relativ häufig in den menschlichen Körper und seine Zugänglichkeit ermöglicht Sammlung mit minimal-invasiven Verfahren. Daher wurden ASCs experimentell für Wundheilung Anwendungen6,7verwendet.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass die direkte Einspritzung von einzelligen MSC Suspensionen in Bereiche um Wunden8,9der Wundheilung beschleunigen kann. Trotz Berichte der Beschleunigung der Wundheilung in diabetische Geschwüre Modelle nach der Injektion von einzelligen Suspensionen ist die Überlebenszeit der transplantierten Zellen an der Wundstelle jedoch nicht klar.

In dieser Studie haben wir Zelle-Blatt Engineering mit Temperatur-responsive Kultur Gerichten angewandt. Diese Gerichte haben die Temperatur-responsive Polymer N- Isopropylacrylamide auf ihrer Oberfläche10kovalent gebunden. Die veredelten Polymerschicht ermöglicht temperaturgeführte Zelladhäsion, oder Loslösung von der Oberfläche der Kulturschale. Die Oberfläche der Schale wird bei 37 ° C, so dass Zellen zu halten und vermehren, während Zellen spontan von der Oberfläche zu lösen, wenn sie bei Temperaturen unter 32 ° c hydrophile wird hydrophob Kultivierte Zellen geerntet werden können, als ein zusammenhängender Zelle Blatt mit intakten Zell-Zell-Verbindungen und extrazellulären Matrizen (ECMs) einfach durch Absenken der Temperatur; so sind proteolytische Enzyme, die die ECM wie Trypsin, schädigen nicht erforderlich11. Daher kann Zelle-Blatt Engineering Zell-Zell-Verbindungen erhalten und verbessern die Wirksamkeit der Zelltransplantation.

Darüber hinaus erhöht die Zelle-Blatt Transplantation Zelle Überlebensrate im Vergleich zu Zelle Injektion12. In diesem Protokoll wurden Zucker zuckerkranke fetthaltige (ZDF) Ratten als Typ 2 Diabetes und Adipositas Modell mit verzögerter Wundheilung ausgewählt. ZDF-Ratten entwickeln spontan Übergewicht ca. 4 Wochen. Dann entwickeln sie Typ-2-Diabetes mit Fettleibigkeit zwischen 8 und 12 Wochen alt, an welcher Stelle sie Hyperglykämie Zusammenhang mit Insulin-Resistenz, Dyslipidämie und Hypertriglyceridämie13aufweisen. Verzögerte Wundheilung, verminderte Blutzufuhr in peripheren Blutgefäße und diabetische Nephropathie sind auch14,15,16beobachtet. Darüber hinaus möglicherweise ZDF Ratten ein geeignetes Modell für das Studium, die Heilung von hartnäckigen kutanen Geschwüren, wie z. B. diabetische Geschwüre.

Die Unterschiede zwischen Mensch und Nagetiere in Wundheilung Mechanismen sind anatomische Unterschiede in der Haut zugeordnet. Wundheilung bei normalen Ratten basiert auf Wunde Kontraktion, während Wundheilung beim Menschen auf erneute Epithelisierung und Granulationsgewebe Bildung beruht. In der Regel Wunde Schienung in Nager-Modelle verwendet Wunde Kontraktion zu minimieren und für die allmähliche Bildung von Granulationsgewebe17, obwohl Wunden in nondiabetic Ratten durch Kontraktion fast vollständig geschlossen sind. Doch Diabetiker Wunde Kontraktion im ZDF Ratten beeinträchtigt, und vor allem der Wundheilung erfolgt durch erneute Epithelisierung und Bildung von Granulationsgewebe; Somit ist dieser Prozess ähnlicher menschlichen Wundheilung14.

Diabetische Wunden mit freiliegenden Knochen nach Debridement sind klinisch oft anzutreffen. Frühere Studien haben 12 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken der Athymic nackte Mäuse18,19 und 10 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken von normalen Mäusen20untersucht. Um einen klinischen Modell für schwere diabetische Wunden entwickeln, größere (15 x 10 mm2) voll-dicke Hautdefekte mit Knochen ausgesetzt und ohne das Periost erstellt wurden, als zuvor beschriebenen21in Ratten mit Typ-2-Diabetes und Adipositas.

Ratte ASC (rASC) Blätter aus der ASC von normalen Lewis-Ratten wurden durch die allogene Transplantation von ASC Blätter erstellt. In der klinischen Praxis ist autologe Transplantation nicht realisierbar, weil Diabetes-Patienten mit Geschwüren zeigen oft schwere diabetische Komplikationen, wie unkontrollierte hohe Blutzuckerwerte und hohen Body-mass-Indizes und diese Komplikationen Ursache Wundheilung Störungen, die die Schwierigkeit Fettgewebe von diesen Patienten zu erhöhen. Darüber hinaus ASCs von Tieren mit Diabetes Ausstellung Eigenschaften verändert und beeinträchtigt die Funktion22. Deshalb beschreibt das Protokoll hier vorgestellten der allogenen Transplantation rASC Blätter aus normalen Ratten und die Anwendung von künstlicher Haut an diabetischen Ratten.

Die Bilayer künstliche Haut in diesem Protokoll verwendeten verhindert, dass die spontane Kontraktion der Wunden, fördert die Synthese einer neuen Bindegewebe Matrix und ähnelt der wahre Lederhaut23. In diesem Protokoll ist künstlicher Haut auf eine rASC Blatt platziert und mit Nylonfäden zur Verhinderung von Wunde Kontraktion oder Erweiterung aus losen Rattenhaut fixiert. Darüber hinaus die künstliche Haut bietet einen dreidimensionalen Rahmen für die ASC-Blätter, unterhält eine feuchte Umgebung für die transplantierten ASC Bettwäsche und Wunden und schützt die Wunden vor Infektionen und externe Kräfte. Schließlich ist ein nicht klebendes Verband gelegt, über die Wunde vor äußeren Einwirkungen schützen, pflegen ein feuchtes Wundmilieu und Exsudat aufnehmen.

Ein rASC-Blatt ist dünn, flexibel und verformbar und Verschieben von Empfänger Websites, wie z. B. ein schlagendes Herz24eingehalten werden kann. Zelle-Blatt für die Rekonstruktion der verschiedenen Geweben verwendet worden und erzeugen Heilwirkungen25,26. ASC-Blätter, die klinische therapeutisches Potenzial aufweisen könnte beschleunigen die Heilung von vielen Arten von Wunden. Darüber hinaus die allogene Transplantation von ASC Blätter, kombiniert mit dem Einsatz von künstlicher Haut, möglicherweise für die Behandlung von hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, z. B. bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit oder Kollagen-Krankheit, oder sie können verabreicht werden, um Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden. Dieser Ansatz erhöht die Effizienz der Transplantation ASC. Wundheilung ZDF Rattenmodell produziert eine schwere Wunde Erkrankung, die ähnelt die menschlichen Wundheilung und klinische Bedingungen in einem kleinen Versuchstier imitiert.

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Protokoll

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Alle unten vorgestellten Versuchsprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss der Tokyo Women's Medical University School of Medicine genehmigt und entsprechen allen Anforderungen der Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen.

1. Vorbereitung von Tieren, Instrumenten, Nährmedien und Schalen

  1. Bereiten Sie das vollständige Kulturmedium mit mindestens essentiellem Alpha-Medium vor, das 20 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält. Lagern Sie dies bis zur Verwendung mehrere Monate bei 4 °C.
  2. Verwenden Sie erwachsene männliche ZDF-Ratten als Modell für Typ-2-diabetische Adipositas. Verwenden Sie das Fettpolster männlicher Lewis-Ratten, um Fettgewebe zu isolieren und die Zellschichten vorzubereiten.

2. Isolation und Kultur von rASCs

  1. Gewinnung von Fettgewebe von Lewis-Ratten (8 - 33 Wochen alt, männlich) unter Vollnarkose unter Verwendung von Isofluran.
    1. Bereiten Sie ein mechanisches Beatmungsgerät für Nagetiere und 4% Isofluran vor. Bereiten Sie mehrere sterile Wattespitzen, saubere Gazen, ein Skalpell, einen Nadelhalter, eine Operationsschere, eine Pinzette und eine 5-0-Nylonnaht vor. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente und Zubehör.
    2. Bereiten Sie eine 100-mm-Petrischale mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor, um das gewonnene Fettgewebe vorübergehend zu konservieren. Wiegen Sie die Petrischale mit PBS mit einer Waage, bevor Sie mit der Operation beginnen, um das gesammelte Fettgewebe zu messen. Legen Sie die chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien auf ein steriles Tuch.
    3. Narkose die Ratten mit Isofluran in einer Menge von 3 - 4 % über ein mechanisches Beatmungsgerät von Nagetieren und halte die Ratten während der Operation bei 2 - 3 % Isofluran. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung jeder Ratte beobachten.
    4. Positionieren Sie die Ratte mit sterilen Handschuhen in Rückenlage auf einem sterilen Tuch. Rasieren Sie den Operationsbereich mit einem Elektrorasierer und reinigen Sie den Bauchbereich der Ratte mit steriler Gaze, die in 70%igem Ethanol getränkt ist.
    5. Legen Sie mit einem Skalpell einen ca. 5 cm langen Hautschnitt in den seitlichen Unterbauch der Ratte an. Legen Sie den äußeren schrägen Muskel frei und präparieren Sie ihn. Legen Sie dann das Nebenhodenfettgewebe frei, das den Nebenhoden umgibt. Ziehen Sie das Nebenhodenfettgewebe vorsichtig heraus.
      HINWEIS: Das Fettgewebe kann auf beiden Seiten des Bauches der Ratte entnommen werden.
    6. Exzitieren Sie nur das Nebenhodenfettgewebe, um eine Schädigung der Nebenhoden, der Hoden und der Nebenhodenblutgefäße zu vermeiden (Abbildung S1). Weichen Sie das herausgeschnittene Fettgewebe in der PBS in der Petrischale ein, um Trockenheit zu verhindern und das Gewebe zu wiegen.
    7. Verschließen Sie den Bauchmuskel mit 5-0 VICRYL und die Haut mit einer 5-0 Nylonnaht. Setzen Sie dann jede Ratte, die operiert wurde, in einen separaten Käfig zurück (eine Ratte pro Käfig).
      HINWEIS: Überwachen Sie die Ratten, bis sie sich vollständig erholt haben.
  2. Isolieren Sie rASCs aus 2 - 3 g Fettgewebe (aus einer Lewis-Ratte herausgeschnitten und nach einer zuvor beschriebenen Methode verarbeitet)27. Kurz gesagt, das exzidierte Fettgewebe mit 0,1 % Kollagenase Typ A bei 37 °C für 1 h enzymatisch verdauen, um die stromal-vaskuläre Fraktion (SVF; Abbildung S2).
    1. Bereiten Sie mehrere 100-μm-Zellsiebe, mehrere 50-ml-Röhrchen, mehrere 15-ml-Röhrchen und zwei Skalpelle auf einer biologischen Reinbank vor. Schalten Sie eine Zentrifuge ein und erwärmen Sie ein Wasserbad auf 37 °C. Bereiten Sie außerdem ca. 50 ml steriles PBS in einem 50-ml-Röhrchen mit 0,1 % (Endkonzentration) Kollagenase Typ A vor.
    2. Hacken Sie das Fettgewebe mit zwei Skalpellen in kleine Stücke.
    3. Bringen Sie das gesamte gehackte Fettgewebe in ein 50-ml-Röhrchen und fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 15 ml zu bringen.
    4. Lassen Sie das 50-ml-Röhrchen 5 Minuten lang aufrecht stehen. Entsorgen Sie die obere Schicht und sammeln Sie die untere Schicht bis auf die Ablagerungen.
    5. 0,1 % Kollagenaselösung vom Typ A werden in das 50-ml-Röhrchen gegeben, wobei PBS die obere Schicht enthält, um das Fettgewebe enzymatisch zu verdauen.
      HINWEIS: Erwärmen Sie ca. 20 mL PBS pro 2 - 3 g Fettgewebe in einem 37 °C heißen Wasserbad.
    6. Kippen und schütteln Sie das 50 mL Röhrchen vorsichtig bei 120 - 130 U/min für 1 h in einem 37 °C Wasserbad.
    7. Legen Sie das 50-ml-Röhrchen nach dem Schütteln 5 Minuten lang aufrecht.
    8. Filtrieren Sie die Lösung mit einem 100-μm-Zellsieb und gießen Sie die Lösung in ein neues 50-ml-Röhrchen. Geben Sie die gefilterte Lösung in zwei 15-ml-Röhrchen ab.
    9. Zentrifugieren Sie die Lösung in den 15 mL Röhrchen für 5 min bei 700 x g. Entfernen Sie vorsichtig die obere Schicht des Überstands und lassen Sie 5 ml der unteren Schicht der Lösung. Saugen Sie das Pellet nicht an.
    10. Geben Sie ca. 5 ml vollständiges Kulturmedium in jedes 15-ml-Röhrchen, bis zu 10 mL pro 15-ml-Röhrchen, und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig wieder.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.8 - 2.2.9. Rufen Sie dann die SVF ab.
  3. Bereiten Sie zwei 60 cmgroße 2-Kulturschalen vor. Sammeln Sie das SVF nach zwei Zentrifugen bei 700 × g für 5 min. Suspendieren Sie das SVF und geben Sie 10 ml SVF-Lösung auf jede 60 cm große 2-Kulturschale.
  4. Kultivieren Sie die Gerichte 24 h lang bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator.
  5. Bereiten Sie PBS und 0,25 % Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) vor, die bis zur Verwendung mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden kann.
  6. Waschen Sie die Zellen nach dem ersten Plattieren (24 h) 3 Mal mit PBS, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Fügen Sie frisches, komplettes Medium hinzu.
  7. Passieren Sie die Zellen, die an Tag 3 fast subkonfluent sind. 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA zugeben und die Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator für 3 - 5 min.
    HINWEIS: Führen Sie den Schritt der Trypsinisierung innerhalb von 10 Minuten durch, um Zellschäden zu vermeiden.
  8. Beobachten Sie die Zellen nach der Trypsinisierung unter einem Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass sich alle Zellen vollständig von den Schalen gelöst haben. Geben Sie dann 9 ml vollständiges Nährmedium in die Schalen
    9. .
  9. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
  10. Subkultur der Zellen bei einer Dichte von 1,7 x 103 Zellen/cm2 alle 3 Tage bis zur Passage 3. Die subkultivierten Zellen werden bei 37 °C in der befeuchteten Atmosphäre eines 5 % CO2 -Inkubators kultiviert.

3. Erstellung von rASC Sheets

  1. Bereiten Sie mehrere temperaturabhängige Kulturschalen mit einem Durchmesser von 35 mm zu. Das Geschirr mit FBS (oder einem kompletten FBS-haltigen Medium) bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator für mehr als 1 h beschichten< br /> HINWEIS: Eine temperaturempfindliche Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm ist ein im Handel erhältliches Produkt.
  2. Bereiten Sie eine Thermoplatte vor und inkubieren Sie sie bei 37 °C für die folgenden experimentellen Verfahren.
    HINWEIS: Führen Sie alle Eingriffe mit temperaturempfindlichen Kulturschalen auf einer 37 °C Thermoplatte durch, um zu verhindern, dass sich die Zellen spontan von der Schale lösen.
    1. Erwärmen Sie das gesamte Nährmedium, das in den Verfahren verwendet wurde, vor dem Experimentieren auf 37 °C.
    2. Seed-Passage: 3 rASCs von Lewis-Ratten auf eine temperaturempfindliche Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm bei einer Dichte von 1,5 x 105 Zellen/Schale für 3 Tage unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 2 ml des vollständigen Kulturmediums.
      HINWEIS: Wenn rASCs auf eine neue Kulturschale aufgebracht werden, sollte die Schale in einem Inkubator langsam hin und her sowie links und rechts geschaukelt werden, um eine gleichmäßige rASC-Aussaat und ein gleichmäßig dickes rASC-Blatt zu erreichen.
    3. Wechseln Sie 2 ml des Mediums auf 2 ml vollständiges Kulturmedium mit 16,4 μg/ml, L-Ascorbinsäure, Phosphat, Magnesiumsalz, N-Hydrat (AA) an Tag 3 nach der Aussaat in die temperaturempfindlichen Kulturschalen, die auf einer 37 °C Thermoplatte inkubiert werden.
      HINWEIS: Gelöstes AA kann monatelang bei -30 °C gelagert werden.
    4. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 4 - 5 Tage und ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage durch frisches Medium, das AA enthält.
    5. Bestätigen Sie die Proliferation und Bildung von ASCs unter einem Lichtmikroskop, um festzustellen, ob Lücken zwischen den Zellen in einem zusammenhängenden Zellblatt aufgetreten sind.
  3. Übertragen Sie die Zellblätter für 15 - 20 Minuten aus dem Inkubator auf den Tisch, um sie auf Raumtemperatur abzukühlen. Beobachten Sie, wie sich die Zellen spontan als zusammenhängende Zellblatt ablösen. Ernten Sie das rASC-Blatt mit einer Pinzette von der Oberfläche der Schale.
    HINWEIS: Normalerweise können rASC-Platten mit einer Pinzette gehandhabt werden. Bei Bedarf kann eine Transfermembran verwendet werden, um ein Zellblatt von der Kulturschale auf die Wundstelle zu übertragen, wenn das Zellblatt spröde und brüchig ist.

4. Vorbereitung des Modells der Hautdefektwunde in voller Dicke und Transplantation von rASC-Blättern

  1. Bereiten Sie ein mechanisches Beatmungsgerät für Nagetiere und 4% Isofluran vor. Bereiten Sie mehrere sterile Wattespitzen, saubere Gaze, 5-0 Nylonnaht, ein Skalpell, ein Periost-Raspatorium, einen Nadelhalter, eine Operationsschere und eine Pinzette vor. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente und Zubehör. Legen Sie die chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien auf ein steriles Tuch.
  2. Bereiten Sie PBS vor und halten Sie es bei Raumtemperatur, zusammen mit etwas künstlicher Haut und einem nicht klebenden Verband. Schneiden Sie die künstliche Haut (15 x 10 mm) und den nicht klebenden Verband (20 × 15 mm) vor. Weichen Sie die innere Kollagenschwammschicht der künstlichen Haut in Kochsalzlösung ein, bevor Sie die künstliche Haut verwenden.
    HINWEIS: Die künstliche Haut besteht aus zwei Schichten: einer äußeren Silikonschicht und einem inneren Kollagenschwamm.
  3. Verwenden Sie ZDF-Ratten (16 - 18 Wochen alt, männlich, 500 - 600 g) als Wundheilungsmodell für Typ-2-Diabetes und Adipositas.
  4. Betäuben Sie die ZDF-Ratten durch Inhalation von 4% Isofluran mit einem mechanischen Beatmungsgerät der Nagetiere. Induzieren Sie die Anästhesie mit Isofluran in einer Menge von 4 - 5 % über ein mechanisches Beatmungsgerät von Nagetieren und halten Sie sie während der Operation bei 3 - 4 %. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung jeder Ratte über ein Zehenkneifen beobachten.
  5. Während Sie sterile Handschuhe tragen, positionieren Sie die Ratte in Bauchlage auf einem sterilen Tuch. Reinigen Sie den Kopf der Ratte mit steriler Gaze, die in 70 % Ethanol getränkt ist, rasieren Sie den Operationsbereich mit einem Elektrorasierer und reinigen Sie die Haut nach der Rasur mit steriler Gaze, die in 70 % Ethanol getränkt ist.
  6. Erzeugen Sie einen quadratischen Hautdefekt in voller Dicke (15 x 10 mm2) auf dem Kopf der anästhesierten ZDF-Ratten, indem Sie das Hautgewebe von der Epidermis bis zum Periost entfernen. Exzidieren Sie die Haut und das Hautgewebe mit einem Skalpell und entfernen Sie das Periost mit einem Periostraspatory.
  7. Bringen Sie die rASCs auf der temperaturempfindlichen 35-mm-Kulturschale unmittelbar vor der Transplantation aus dem Inkubator in eine Umgebung mit Raumtemperatur.
  8. Beobachten Sie, wie sich die rASCs auf der temperaturempfindlichen 35-mm-Kulturschale nach der Bildung einer Wunde spontan als Folie von der Schalenoberfläche lösen. Ernten Sie die rASC-Blätter nach 7 Tagen Kultivierung auf temperaturempfindlichen Kulturschalen. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie das rASC-Blatt dreimal mit PBS. Weichen Sie das rASC-Blatt bis zur Transplantation in PBS ein, um ein Austrocknen zu verhindern.
  9. Legen Sie das rASC-Blatt mit einer Pinzette sofort über den Schädeldefekt. Ist das Zellblatt spröde und zerbrechlich, kann eine Membran als Gerüst verwendet werden, um das Zellblatt von der Kulturschale zur Wundstelle zu transportieren.
  10. Decken Sie das rASC-Blatt und den Defekt mit der künstlichen Haut (15 x 10 mm2) ab und verschließen Sie die Wunde mit ca. 10 Stichen mit der 5-0 Nylonnaht. Um die Wunde zu schützen, legen Sie einen nicht klebenden Verband (20 x 15 mm2) über die künstliche Haut und verwenden Sie 5-0 Nylonnähte, um das Wundmilieu feucht zu halten und Exsudate zu absorbieren.
    HINWEIS: Die nicht klebenden Verbände werden von den ZDF-Ratten innerhalb weniger Tage nach dem Auftragen entfernt. Daher ist es notwendig, die Ratten nach der Transplantation regelmäßig zu überwachen. In der Regel wird der nicht klebende Verband alle 2 Tage unter Vollnarkose gewechselt.
  11. Bringen Sie jede Ratte, die sich einer Operation unterzogen hat, in einen separaten Käfig zurück, bis sie sich vollständig erholt hat (eine Ratte pro Käfig). Nach einer Beobachtungszeit werden die Ratten mit der zugelassenen Methode der Isofluran-Überdosierung eingeschläfert.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll versucht, eine neue zellbasierte Therapie bei hartnäckigen diabetische Wunden herzustellen. Kurz (wie in Abbildung 1dargestellt), allogene rASC Blätter entstanden aus normalen Ratten mit Zelle-Blatt Engineering und wurden dann mit einem Bilayer künstlicher Haut auf eine voll-dicke Hautdefekt auf einer diabetischen Ratten verpflanzt. Lichtmikroskop Bilder ein gutes Beispiel für eine rASC Blatt (Abbildung 2A) und ein schlechtes Beispiel für...

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Diskussion

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Die kritischsten Schritte für das züchten erfolgreich eine rASC Blatt sind wie folgt: 1) die Temperatur bei etwa 37 ° C während der Kultivierung auf Temperatur reagierende Kultur Gerichte beibehalten werden. Während der Erstellung eines Blattes rASC jedes Verfahren durchgeführt wurde, auf einem 37 ° C Thermo-Teller und jedes Reagenz wurde auf 37 ° C zu verhindern, dass Zellen spontan aus der Schale31abnehmen gewärmt. (2) die Empfänger ZDF Ratten müssen überwacht werden, um die Entfernung der nicht...

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Offenlegungen

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Folgenden Autoren offenlegen finanzielle Beziehungen zu dieser Publikation: Teruo Okano ist Gründer und Direktor des Board of Cell Samen Inc., das Technik und Patente medizinische Universität Tokio Damen lizenziert, und Teruo Okano und Masayuki Yamato sind Akteure in Zelle Samen Inc. Tokyo Medical Frauenuniversität erhält Forschungsgelder aus Zelle Seed Inc. Die anderen Autoren erklären, dass sie keinen finanzielle Beziehungen relevant für diese Publikation.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Yukiko Koga der Abteilung für plastische und Rekonstruktionschirurgie, Juntendo University School of Medicine, für die praktische Beratung. Wir danken auch Herrn Hidekazu Murata der diabetischen Center of Tokyo Women Medical University School of Medicine für ausgezeichneten technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch die Schaffung von Innovationszentren für erweiterte interdisziplinäre Bereiche Forschungsprogramm des Projekts für Entwicklungsländer Innovationssysteme "Zelle Blatt Tissue Engineering Center (CSTEC)" vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Fötales Rinderserum (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140-122
Kollagenase ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Deutschland
60 cm2 Primaria GewebekulturschaleBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Kochsalzlösung (PBS)Life Technologies1490-144
0,25 % Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)Life Technologies25200-056
L-Ascorbinsäure, Phosphat, Magnesiumsalz, N-HydratWako013-19641
35-mm-Kulturschale (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokio, Japan
Mikrowarme Platte (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Nagetier-BeatmungsgerätStoelting#50206Wood Dale, IL
4% IsofluranPfizer Japan114-13340-3Tokio, Japan
Künstliche Haut (Pelnac® )Smith & NeffePN-R40060  Tokio, Japan
Nicht klebender Verband (Hydrosite plus® )Smith & Neffe66800679Bekannt als Allevyn non-adhessing® in den USA
5-0 Nylon-NahtAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Referenzen

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