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Methodenartikel

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in

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⸱

DOI:

10.3791/54544

⸱

28. November 2016

 , 
1The Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Oncological Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Viele Parallelen zwischen der Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systems, obwohl Drosophila die lymphoiden Linie fehlt , die Säugetier-adaptive Immunität zu charakterisieren. Drosophila und Säugetieren Hämatopoese treten in räumlich und zeitlich getrennten Phasen mehrere Blutzelllinien zu erzeugen. Beide Systeme halten Stauseen von Blutvorläuferzellen mit dem reifen Linien zu erweitern oder zu ersetzen. Das hämatopoetische System ermöglicht Drosophila und Säugetieren zu reagieren und die Immun Herausforderungen anzupassen. Wichtig ist, dass die Transkriptionsregulatoren und Signalwege, die die Erzeugungssteuerung, Wartung und Funktion des hämatopoetischen Systems von Fliegen zu Säugetieren konserviert. Diese Ähnlichkeiten lassen Drosophila genetisch Modell hämatopoetischen Entwicklung und Krankheit verwendet werden.

Hier stellen wir ausführlich Assays , die die hämatopoetische System von Drosophila - Larven zu untersuchen. ImInsbesondere haben wir Methoden skizzieren Blutzellzahlen und Konzentration zu messen, eine bestimmte reife Linie in vivo sichtbar zu machen , und führen Sie die Immunhistochemie auf Blutzellen im Umlauf und in der hämatopoetischen Organ. Diese Assays können offenbaren Veränderungen in der Genexpression und zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen Hämatopoese über. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge zur Verfügung , in Drosophila können diese Assays verwendet werden , um das hämatopoetische System auf definierten genetischen Veränderungen zu bewerten. Während hier nicht näher erläutert, können diese Assays auch die Wirkung von Umweltveränderungen, wie Infektionen oder Diät, auf das hämatopoetische System zu prüfen, verwendet werden.

Einleitung

Die komplexen Mechanismen, um die Transkriptionsfaktoren und Signalwege regulieren, die die Entwicklung des hämatopoetischen Systems und dass eine Fehlfunktion in hämatologischen Erkrankungen koordinieren bleiben schlecht verstanden. Diese Transkriptionsfaktoren und Signalwege sowie deren Regulation, zwischen Drosophila und Säuger Hämatopoese 1-5 hoch konserviert. So stellt das Drosophila hämatopoetische System ein hervorragendes genetisches Modell der molekularen Mechanismen zu definieren Hämatopoese und hämatologischen Krankheiten zu steuern.

Ähnlich wie bei Säugetieren, erzeugen Drosophila Blutzellen, genannt hemocytes, in räumlich und zeitlich getrennten Phasen der Hämatopoese. Traditionell wurde Drosophila Hämatopoese dachte in der embryonalen Mesoderm und im Larven Lymphdrüsen auf die Phasen beschränkt. Aktuelle Studien belegen, dass die Hämatopoese tritt auch in Larven sessil clusters und im erwachsenen Bauch 6-8. Alle hämatopoetischen Phasen produzieren zwei Arten von reifen Blutzellen: plasmatocytes und Kristallzellen. Plasmatocytes sind Makrophagen wie in Phagozytose, angeborene Immunität beteiligten Zellen und Wundheilung. Kristallzellen enthalten pro-Phenoloxydasen für melanization erforderlich, eine Reaktion in Insektenimmunreaktionen und Wundheilung eingesetzt. Larval Hämatopoese kann eine dritte reifen hemocyte Typ erzeugen, eine so genannte lamellocyte, als Reaktion auf bestimmte Immun Herausforderungen wie Legimmen Infektion 9,10. Lamellozyten sind groß, anhaftenden Zellen , die mit plasmatocytes und Kristallzellen in Verbindung funktionieren, Wespe Eier in Drosophila - Larven gelegt zu kapseln und zu neutralisieren. In Abwesenheit von Parasitierungsleistung, Lamellozyten sind nicht in Wildtyp-Larven gefunden. Melanotische Massen ähneln melanisierten, verkapselte Wespe Eier; viele Mutantenstämme entwickeln Drosophila melanotic Massen in Abwesenheit von Parasitierungsleistung. Die Anwesenheit von lamellozyten und / oder melanotischen Massen können indikativ hämatopoetischer Anomalien sein. In der Tat hat die melanotic Massen Phänotyp verwendet worden in der Hämatopoese 11-14 beteiligten Gene und -wege zu identifizieren.

Die Larven hämatopoetische System ist das am intensivsten die bisher untersucht. Es besteht aus Hämocyten in der Hämolymphe Zirkulieren sessile hemocyte Clustern unter der Cuticula strukturiert und Hämozyten in der Lymphdrüsen wohnen. Die Lymphdrüsen ist eine Reihe von bilateralen Lappen zur dorsalen Gefäß angebracht ist. Jede Primärkeule der Lymphdrüsen gliedert sich in drei Hauptzonen. Die äußerste Zone wird als der Rindenzone bekannt und enthält Reifung Hämocyten. Die innerste Zone wird der Markzone bezeichnet und ruhender hemocyte Vorläufern besteht. Die dritte Zone, die posterior Signalisierungszentrum, ist eine kleine Gruppe von Zellen an der Basis der Lymphdrüsen, die als Stammzelle artige Nischen wirken. Frühe Arbeiten etablierte kritische Funktionen für Notch 15-18 , Igel 19,20, JAK-STAT 18 und Aktivität Wingless 21 Larven Lymphdrüse Entwicklung zu regulieren. Neuere Studien haben gezeigt , dass BMP 22, FGF-Ras 23 und Hippo 24,25 Signalisierung auch innerhalb der Larven Lymphdrüse funktionieren.

Vier Larven hämatopoetischen Assays hier umrissenen beschreiben 1) Messung zirkulierender hemocyte Konzentration, definiert als Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit, 2) Isolieren und Befestigungs hemocytes für die Immunhistochemie zirkulierende, 3) Kristallzellen in vivo zu visualisieren, und 4) zu sezieren, Fixierens und Befestigungs Lymphdrüsen für die Immunhistochemie. Diese Assays können als hämatopoetische Ablesungen verwendet werden, um die Funktionen und Regeln von Signalwegen im Larven hämatopoetische System zu bewerten. Während diese Verfahren bisher in dem Gebiet, visuelle Dokumentation dieser Assays verwendet wurde erst vor kurzem begonnen 8,26-30. Mehrere Veröffentlichungen hier zitiert sind Hilfeful Ressourcen beschreiben ähnliche Verfahren und hämatopoetischen Marker 26,31-33. Zusätzlich Trol und Viking sind nützliche Marker der Lymphdrüsen Basalmembran.

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Protokoll

1. Zirkulierende Hemocyte Konzentration

  1. Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
  2. Sammeln Larven in Sezieren dish Vertiefungen gefüllt mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Tabelle 1).
  3. Für jede Larve legen 10 ul 1x PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und 10 ul 1x PBS auf eine saubere Sezieren Pad. Legen Sie das Sezieren-Pad auf einem beleuchteten Stereobasis.
  4. Trocknen eine individuelle Larve, indem es auf ein Gewebe platzieren wischen, bevor es zu einer PBS Tropfens auf der Dissektion Pad zu übertragen.
  5. Mit einer Pinzette, reißen sanft öffnen und vorsichtig die Kutikula invertieren die Hämolymphe zu lösen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf , nicht die Nagelhaut zu kratzen oder jab , da dies möglicherweise sessil hemocytes 29 freigeben könnte.
  6. Mit Hilfe einer Pipette, sammeln die Hämolymphe aus dem Sezieren Pad. vermeiden Sie collecting Larven Trümmer wie Fettkörper.
  7. Fügen Sie die Hämolymphe zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen durch Pipettieren von oben und unten.
    HINWEIS: Mehrere Proben können für bis zu einer Stunde auf einmal und auf Eis gehalten gesammelt werden.
  8. Optional: Mix Trypanblau mit der Hämolymphe Probe in gleichen Teilen zu färben und tote Zellen auszuschließen. Zählen von Zellen innerhalb von 3 Minuten der Zugabe von Trypanblau, weil es toxisch für Zellen ist.
  9. Mischen Sie die Probe durch Pipettieren von oben und unten vor 10 ul in einem Hämocytometer Kammer geladen werden.
  10. Bei der Verwendung eines automatisierten Zellzähler, eingestellt entsprechenden Parameter für die Zellgröße und Zirkularität. Sie können beispielsweise eine Mindestzellengröße von 2 & mgr; m, eine maximale Zellgröße von 22 & mgr; m und einer Zirkularität von 75-80% Rundung auf normale, runde hemocytes 34 erkennen. Experimentieren Sie mit verschiedenen Parameter erfassen, um größere und spindelförmige hemocytes, wie Lamellozyten. Alternativ können Sie einen Hemocytometer manuell hemocytes zählen.

2. Circulating Hemocyte Immunhistochemie

  1. Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
  2. Legen Sie ein Deckglas in jeder Vertiefung einer 6- oder 12-Well-Platte.
    HINWEIS: Quadrat Deckgläser (22 mm) passen in 6-Well-Platten und runden Deckgläschen (18 mm Durchmesser) passen in 12-Well-Platten.
  3. Sammeln Larven in Sezieren Schale Brunnen mit 1x PBS gefüllt.
  4. Platz 5 ul 1x PBS in der Mitte jedes Deckglas.
  5. Legen Sie die Platte auf einer beleuchteten Stereobasis.
  6. Trocknen Sie eine einzelne Larve auf einem Gewebe wischen und dann in der PBS auf dem Deckglas.
  7. Mit einer Pinzette vorsichtig reißen und vorsichtig die Kutikula invertieren. Bevor die Larven Kadaver entfernt haben, verwenden sie die Hämolymphe gleichmäßig zu verteilen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf , nicht die Nagelhaut zu kratzen oder jab , da dies möglicherweise sessil hemocytes 29 freigeben könnte.
  8. Repeat für alle Larven, die Hämolymphe eine Larve pro Deckglas zu sammeln. Erlauben Hämozyten zu den Deckgläsern für 5 anhaften - 8 Min . Bei Raumtemperatur RT Nicht 30 min vor der Fixierung überschreiten.
  9. Fix Hämocyten durch Zugabe von 5 & mgr; l von 7,5% igem Formaldehyd (Tabelle 1) zu jedem Deckglas für 15 min bei Raumtemperatur.
  10. Wash Deckgläschen dreimal mit 1x PBS. Tipp der Platte und absaugen PBS nach jeder Wäsche. Um Run-off der Permeabilisierung Lösung im nächsten Schritt zu verhindern, verwenden Sie die Saugvorrichtung Überschuss PBS aus Umfang der Deckgläser zu entfernen.
  11. Füge 100 & mgr; l Permeabilisierung Lösung (Tabelle 1) zu jedem Deckglas 20 min bei RT.
  12. Tipp und vorsichtig auf die Platte tippen Sie auf die Permeabilisierung Lösung abzusaugen.
  13. Verdünnte primärer Antikörper mit Antikörperlösung (Tabelle 1) gemäss Anbieterangaben. Hinzufügen, mindestens 500 & mgr; l primärer Antikörper-Lösung Deckgläser in 12-Well-Platten.Fügen mindestens 1,5 ml in 6-Well-Platten. über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
  14. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Deck mit 1x PBS für 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler, dreimal.
  15. Verdünnen sekundären Antikörper mit Antikörperlösung gemäss Anbieterangaben. Hinzufügen, mindestens 500 & mgr; l sekundärem Antikörper Lösung Deckgläser in 12-Well-Platten. Fügen mindestens 1,5 ml für 6-Well-Platten. Inkubieren für mindestens 2 h bei RT.
  16. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und wasche Deck mit 1x PBS für 10 min auf einem Orbitalschüttler, wie in Schritt 2.10, dreimal.
  17. Während der Waschschritte, gleitet saubere Glasmikroskop mit 70% Ethanol (Tabelle 1) unter Verwendung von Gewebetüchern. Für jedes Deckglas legen 5 ul Befestigungspuffer (Tabelle 1) auf dem Glasobjektträger.
    HINWEIS: Zwei Deckgläser passen auf einer Folie.
  18. Saugen Sie das letzte Waschung PBS.
  19. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Deckgläser von den Platten entfernen und Platz, Inverted, auf der Oberseite des Montagepuffers.
    Hinweis: Die Objektträger können vor der Bilderzeugung bei 4 ° C gelagert werden. Maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der Antikörper verwendet. 6- und 12-Well-Platten kann gespült und wiederverwendet werden.

3. In - vivo-Zelle Melanisierung

  1. Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2-6 Stunden.
  2. Bevor Sie beginnen, eingestellt bei 60 ° C eine Heizquelle.
    HINWEIS: Ein Thermocycler-Programm von 60 ° C für 10 min (gefolgt von einem 25 ° C halten) funktioniert am besten, aber ein Wasserbad oder eine andere Wärmequelle ist ausreichend, solange die Wärme einheitlich verteilt und gleichmäßig über jede Larve.
  3. Sammeln Larven in Sezieren Schüssel Vertiefungen gefüllt mit 1x PBS (Tabelle 1).
  4. Ein zu einer Zeit, trocknen eine Larve auf einem Gewebe wischen und Platz an der Unterseite eines Rohres PCR. Platzieren Sie jede Larvein einem separaten PCR-Röhrchen. (Siehe Abbildung 3A) .
  5. Um eine konstante Qualität zu gewährleisten, dass die Larven Aufenthalt am Boden der PCR-Röhrchen von Larven in den Rohren bei 4 ° C Kühlung 10 - 15 min und / oder sanft die Rohre vor dem Erhitzen tippen.
  6. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler (oder Wasserbad). Hitze bei 60 ° C für 10 min.
  7. Entfernen Sie vorsichtig Larven aus den PCR-Röhrchen in die Schüssel Sezieren Brunnen mit frischem 1x PBS gefüllt.
  8. Trockene Larven auf einem Gewebe wischen und auf einer ebenen Fläche für die Bildgebung unter einem Stereomikroskop.
  9. Spiel Bilder von Larven blind durch mehrere Personen.

4. Larval Lymphdrüse Immunhistochemie

HINWEIS: Die Drüse Lymphe befindet sich etwa ein Drittel der Länge von dem vorderen Ende einer Larve leicht unter dem Gehirn auf der Rückenseite. (Siehe Pfeil in 3B) . Die Lymphdrüsen Flanken des Schiffes dorsalen und wird am einfachsten an den Mund hoo seziertks oder an das Gehirn. Wildtyp, dritten Häutungsstadium Lymphdrüsen sind sehr kleine Strukturen; Die primären Keulen sind ungefähr 100 bis 200 & mgr; m in der Länge. (Siehe Abbildung 4A) .

  1. Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
  2. Lymphdrüsen Dissektion
    1. Für jede Versuchsbedingung, 1 ml 1x PBS (Tabelle 1) eine Vertiefung einer 24-Well - Platte.
    2. 1 Tropfen von 0,1% PBST (Tabelle 1) in jede Vertiefung eine Einweg - Transfer - Pipette.
      HINWEIS: Detergens, wie Tween 20, zugegeben, um die Oberflächenspannung zu senken, so dass das Gewebe an den Boden des Bohrlochs zu versenken.
    3. Legen Sie die Platte flach auf dem Eis.
    4. Sammeln Larven in Sezieren Schale Brunnen mit 1x PBS gefüllt.
    5. Setzen Sie eine saubere Sezieren-Pad auf einem beleuchteten Stereobasis. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette Smal zu platzierenl Tropfen von 0,01% PBST (Tabelle 1) auf der Unterlage. Übertragen Sie eine Larve zu einem PBST Tropfen für die Präparation.
    6. Halten Sie die Larve mit einer Zange etwa ein Viertel der Länge von dem hinteren Ende, Rückenseite nach oben.
    7. Verwenden Sie eine andere Zange die Kutikula zu greifen sofort an die Zange anterioren, die die Larve halten. Ziehen Sie die Nagelhaut zu dem vorderen Ende, bis die Mundhaken ausgesetzt sind.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, die Kutikula zu schälen, ohne irgendwelche internen Strukturen zu stören.
    8. Lassen Sie die Kutikula und verwenden beide Zange die Larve in zwei zu schneiden. Entfernen Sie das hintere Ende aus dem PBST Tropfen.
      HINWEIS: Wenn die Kutikula nicht den ganzen Weg zu den Mundhaken nicht schälen, schneiden Sie die Larve in zwei und das hintere Ende zu entfernen. Verwenden Sie eine Zange den Rand der Kutikula zu halten, und mit der anderen Zange die Mundhaken durch die Öffnung zu schieben. Dadurch wird die Kutikula invertieren und die Mundhaken aus. Dies kann als altern verwendet werdenaß auch Dissektion Methode.
    9. Verwenden Sie eine Zange die Kutikula festzunageln (entweder die ventrale Kutikula, die dorsale Kutikula Klappe oder beides) für Stabilität.
    10. Verwenden Sie eine andere Zange die freiliegenden Mund Haken zu greifen und sie vorsichtig heraus.
      Hinweis: das wird die Kutikula von den inneren Strukturen zu trennen. Idealerweise wird das Auge / antennal Imaginalscheiben, Gehirn, Ring Drüse und Lymphdrüsen flankieren das Rückengefäß an den Mundhaken befestigt bleiben.
    11. Während noch die Mundhaken halten, vorsichtig entfernen unerwünschte Strukturen wie die Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm.
      HINWEIS: Wenn das Gehirn aus den Mundhaken trennt, kann die Lymphdrüsen noch zu und mit dem Gehirn gesammelt angebracht werden. In diesem Fall halten Sie die Bauchmark statt der Mundhaken.
    12. Unter Verwendung der Mundhaken oder Bauchmark als Griff, übertragen Sie den sezierten Komplex die Lymphdrüsen zum Brunnen auf Eis enthält. Nicht mehr als 30 Minutenvor der Fixierung.
  3. Fixierung und Immunhistochemie
    1. Legen Sie die 24-Well-Platte auf der Stereobasis.
    2. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBST aus dem Bohrloch zu entfernen.
      HINWEIS: Leer, sind benachbarte Brunnen nützlich vorübergehend Abfall zu deponieren.
    3. Fügen Sie vorsichtig 200 ul 3,7% Formaldehyd (Tabelle 1) an der Seite des Brunnens und schwenken Sie die Platte , um sicherzustellen , dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind.
    4. Bringen Sie die Platte auf Eis für 30 min. Wenn die Lymphdrüsen fluoreszierendes Protein (e) exprimieren, halten Sie die Platte Photobleichens zu verhindern abgedeckt.
    5. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig das Fixiermittel zu entfernen.
    6. Waschen mit 200 ul 1x PBS zum gut Zugabe und die Platte auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur setzt. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBS zu entfernen.
      HINWEIS: Fest Lymphknoten können bis Lymphdrüsen auf Eis in PBS gelassen werden für alle experimentellen Bedingungen dissected und fixiert.
    7. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male die Schritte.
    8. In 200 ul Permeabilisierung Lösung (Tabelle 1) auf den Brunnen. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 45 min bei RT.
      HINWEIS: 45 min ist der "Goldstandard" für die Permeabilisierung Lymphdrüse aber die Autoren haben Erfolg nach nur 20 Minuten.
    9. Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette p200.
    10. Verdünnte primärer Antikörper mit Antikörperlösung (Tabelle 1) gemäss Anbieterangaben. In 300 ul primären Antikörperlösung zum Brunnen und sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    11. Verwenden Sie eine p200 Pipette den primären Antikörper zu entfernen.
    12. Waschen mit 200 ul 1x PBS zum gut Zugabe und die Platte auf einem Orbitalschüttler platziert für 10 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBS zu entfernen.
    13. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male die Schritte.
    14. Verdünnen Sekundär einntibody mit Antikörperlösung gemäss Anbieterangaben. In 300 ul sekundären Antikörper-Lösung zum Brunnen und sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. Inkubieren auf einem Orbitalschüttler für mindestens 2 h bei RT.
    15. Verwenden Sie eine p200 Pipette den sekundären Antikörper zu entfernen und waschen wie in den Schritten 4.3.12 & 4.3.13 beschrieben. Sie nicht die PBS nach der letzten Wäsche zu entfernen.
  4. Lymphdrüsen Montage
    1. Saubere Glasobjektträger 70% Ethanol (Tabelle 1) und Gewebetücher verwenden.
    2. Für jede experimentelle Bedingung, einen Tropfen Puffer (Tabelle 1) auf dem Glasträger Befestigungs.
      HINWEIS: Zwei Bedingungen passen auf einer Folie. Puffervolumen hängt Drüsen auf die Anzahl der Lymphe Montage montiert werden. Verwenden 2 & mgr; l für etwa 18 bis 20 Lymphknoten, 1 & mgr; l für 10 bis 12 und 0,5 & mgr; l für 5 oder weniger.
    3. Platzieren Sie den Objektträger auf einer beleuchteten Stereobasis.
    4. Für bis zu zwei Bedingungen zu einer Zeit, übertragen alle der Lymphdrüsen aus dem Bohrloch zu dem Montagepuffer mit einer Pinzette, die Mundhaken oder Bauchmark als Griff verwendet wird.
    5. Raum, um die sezierten Gewebe gleichmäßig in einer kreisförmigen oder rechteckigen Form, die Montagepuffer in dem Prozess zu verbreiten.
    6. Für jede der sezierten Gewebe, einzeln Schieben einer Zange der Zange unter die dorsale Gefäß und sanft in Richtung auf die Peripherie des Montagepuffers ziehen.
      Hinweis: das wird die Lymphe Drüse aus dem Rest der sezierten Gewebe ziehen und die Lymphdrüsen auf dem Glas glätten.
    7. Mit einer Zange der Zange und eine Sägebewegung, schneiden Sie das Rückengefäß zwischen der Lymphdrüsen und das Gehirn.
    8. Bewegen Sie den Rest der sezierten Gewebe zu der gegenüberliegenden Seite der Lymphdrüsen, am äußersten Rand des Puffers.
      HINWEIS: Die unerwünschten sezierten Gewebe werden schließlich einen Umfang um die Lymphknoten bilden und als Unterstützung bei whic dienenh das Deck ruhen wird.
    9. Wiederholen, bis alle der Lymphknoten aus den sezierten Gewebe getrennt sind, eine der unerwünschten zergliederte Gewebe Reservierung in der Mitte zu platzieren.
    10. Nehmen Sie ein Deckglas zwischen zwei Fingern. Überprüfen Sie, ob das Deckglas frei von Staub und Fingerabdrücke. Verwenden Sie bei Bedarf ein Gewebe wischen und 70% Ethanol, um das Deckglas zu reinigen.
    11. Sicherzustellen, dass der Rand des Deckglases an der Kante des Objektträgers parallel ist, sorgfältig das Deckglas über dem Montagepuffer senken.
      HINWEIS: Die Objektträger können vor der Bilderzeugung bei 4 ° C gelagert werden. Maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der Antikörper verwendet. 24-Well-Platten gespült und wiederverwendet werden.

5. Imaging

  1. Bild fixiert hemocytes und montiert Lymphdrüsen auf einem geeigneten Standard-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskop bei 20facher oder höherer Vergrößerung nach Herstellerbetriebsanleitung. Bild ganze Larven auf einem Ständerard Stereomikroskop bei 2-facher Vergrößerung Bedienungsanleitung des gemäß Hersteller.
  2. Folgen Softwareanbieter Anweisungen für Dekonvolution, falls gewünscht.
Lösung Zusammensetzung Lagerung Bemerkungen
1x PBS 200 mg / l Kaliumchlorid Zimmertemperatur
200 mg / l monobasisches Kaliumphosphat
8000 mg / L Natriumchlorid
1.150 mg / l Natriumhydrogenphosphat
dH 2 O
Fixativ 3,7% oder 7,5% Formaldehyd in PBS 1x Raumtemperatur im Dunkeln Formaldehyd ist toxisch.
Permeabilisierung Lösung / Antikörper-Verdünnungsmittel 0,4% Triton 4 ° C Die Standardformel verwendet 0,4% Triton aber die Autoren verwenden 0,1% Tween 20 mit Erfolg. Verwenden Sie zur primären und sekundären Antikörper verdünnt nach Anbieter empfohlenen Konzentrationen.
5% Rinderserumalbumin, normales Ziegenserum oder normalem Eselserum
1x PBS
70% Ethanol 70% 200 Proof Ethanol in dH2O Zimmertemperatur
Montagepuffer 0,5% N-Propylgallat 4 ° C im Dunkeln N-Propylgallat ist schädlich. DAPI ist ein mutagen.
80% Glycerol
Optional: 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)
1x PBS
0,1% PBST 0,1% Tween 20 in 1x PBS Zimmertemperatur
0,01% PBST 1:10 Verdünnung von 0,1% PBST Zimmertemperatur

Tabelle 1. Lösungen in diesem Protokoll verwendet.

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Ergebnisse

Zirkulierende Hemocyte Konzentration

Hemocyte Zahlen erhöhen gesamten Larvenentwicklung 35. Zu veranschaulichen, dass diese Methode erkennt Unterschiede in hemocyte Zahlen und Konzentration, unabhängig von der biologischen Ursache wir gemessen hemocyte Konzentrationen von verzögerten und unverzögerten Larven. Der Verlust der Prothorakotropes Hormon (PTTH) durch genetische Ablation von PTTH produzierenden Neuronen (PTTH...

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Diskussion

Bei genetische oder umweltbedingte Veränderungen, die vier hier beschriebenen Verfahren können einzeln oder in Verbindung verwendet werden , um unterschiedliche Prozesse während der Hämatopoese analysieren wie Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung Drosophila Hämatopoese ist ein dynamischer Prozess. die Anzahl der Hämozyten pro Tier erhöht 35 und die Struktur und die Genexpression der Lymphdrüsen ändert 32 während der Entwicklung. Vor dieser Tests durchführen, deshalb...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine oder finanzielle Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi und Andreas Jenny für die Unterstützung. Wir danken István Andó für plasmatozytenspezifische Antikörper, Utpal Banerjee für dome-meso-EBFP2-Fliegen, Julian Martinez-Agosto für antp>GFP-Fliegen und Michael O'Connor für ptth und ptth>grimmige Fliegen. Diese Methoden wurden mit Unterstützung der Kimmel Foundation, der Leukemia & Lymphoma Society, des NIH/NCI R01CA140451, des NSF 1257939, des DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 und des NIH/NCI T32CA078207 entwickelt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PBS TablettenMP Biomedicals2810305
PräparierschaleCorning7220-85
MikrozentrifugenröhrchenDenvilleC2170
Silikon-Präparierpad, hergestellt aus Sylgard 184 KitKrayden (Vertrieb über Fisher)NC9644388 (Fisher Katalognummer)Hergestellt in der Petrischale durch Mischen der Komponenten des Sylgard-Elastomer-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
StereomikroskopMorrell Instruments (Nikon-Händler)mna42000, mma36300Nikon-Modelle SMZ1000 und SMZ645
GewebetuchVWR82003-820
PinzetteElektronenmikroskopie Sciences72700-DZ
p200 PipetteEppendorf3120000054
Countess Automatisierter ZellzählerInvitrogenC10227
Gräfin Zellzählkammer ObjektträgerInvitrogenC10283
HämozytometerHausser Scientific3200
Trypanblau-FärbungLife TechnologiesT10282
FormaldehydFisherBP531-500
TritonFisherBP151-500
Tween 20FisherBP337-500
RinderserumalbuminRocky Mountain BiologicalsBSA-BSH-01K
normales ZiegenserumSigmaG9023-10ML
normales EselserumSigmaD9663-10ML
200 Proof EthanolVWRV1001
N-PropylgallatMP Biomedicals102747
GlycerinVWREM-4750
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)Fisher62248
6-Well-PlatteCorning351146
12-Well-PlatteCorning351143
Mikroskop-Deckglas, 22 mm quadratischFisher12-544-10
Mikroskop-Deckglas, 18 mm kreisförmigFisher12-545-100
Objektträger für GlasmikroskopeFisher22-034-980
ThermocyclerEppendorfE950010037Mastercycler EP Gradient S
PCR-RöhrchenUSA Scientific1402-2700
24-Well-PlatteCorning351147
Einweg-TransferpipetteFisher13-711-9AM
Fluoreszenz MikroskopZeissAxio Imager.Z1

Referenzen

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