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Methodenartikel

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

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DOI:

10.3791/54550

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19. Oktober 2016

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. In dieser Studie werden wesentliche Faktoren diskutiert, die die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessung beeinflussen.

Zusammenfassung

Die zellfreie Schicht ist definiert als die parietale Plasmaschicht in der Mikrogefäßströmung, die frei von roten Blutkörperchen ist. Die Messung der in vivo zellfreien Schichtbreite und ihrer räumlich-zeitlichen Variationen kann ein umfassendes Verständnis der Hämodynamik in der Mikrozirkulation liefern. In dieser Studie verwendeten wir ein intravitales mikroskopisches System, gekoppelt mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera, um die zellfreien Schichtbreiten in Arteriolen in vivo zu quantifizieren. Der Cremaster-Muskel von Sprague-Dawley-Ratten wurde chirurgisch exteriorisiert, um den Blutfluss sichtbar zu machen. Außerdem wurde ein eigens entwickeltes Bildgebungsskript entwickelt, um die Bildverarbeitung und Analyse der zellfreien Schichtbreite zu automatisieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung raumzeitlicher Variationen konsistenter als bisherige manuelle Messungen. Die Genauigkeit der Messung hängt jedoch zum Teil von der Verwendung eines Blaufilters und der Auswahl eines geeigneten Schwellenwertalgorithmus ab. Insbesondere bewerteten wir den Kontrast und die Qualität von Bildern, die mit und ohne Verwendung eines Blaufilters aufgenommen wurden. Darüber hinaus haben wir fünf verschiedene Bildhistogramm-basierte Schwellenwertalgorithmen (Otsu, Minimum, Intermode, iterative Auswahl und fuzzy entropic thresholding) verglichen und die Unterschiede bei der Bestimmung der zellfreien Schichtbreite veranschaulicht.

Einleitung

In vivo Tierversuche sind entscheidend für die Grundlagenforschung zum Verständnis der menschlichen Physiologie und Pathologie. Insbesondere können mikrohämodynamische In-vivo-Studien die mögliche Beeinträchtigung der Mikrozirkulationsfunktionen aufklären, die durch abnormale rheologische Bedingungen des Blutes verändert werden. In einer Reihe früherer mikrohämodynamischer Studien1 wurde das Cremaster-Muskelmodell der Ratte zur Visualisierung des mikrovaskulären Blutflusses verwendet. Der Cremaster-Muskel ist eine dünne Schicht quergestreifter Muskeln, die die Hoden umgibt. So kann der Blutfluss im Muskel mit einem Durchlichtmikroskop mittels chirurgischer Belichtung sichtbar gemacht werden. Dies ermöglicht es uns, die in vivo Blutflussbilder ohne den Einsatz von Fluoreszenz- oder Kontrastmitteln zu erfassen. Darüber hinaus kann die gesamte Durchblutung des Muskelnetzes gesteuert werden, indem bei einem Bauchaortenverschluss der vorgelagerte Blutflussreduziert wird 2. Aufgrund dieser Vorteile wurde das Cremaster-Muskelmodell häufig verwendet, um die Bildung der zellfreien Schicht (CFL) in Mikrogefäßenzu untersuchen 1,3.

Die CFL-Breite ist ein wichtiger hämodynamischer Parameter in der Mikrozirkulation, der aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Regulierung der Mikrozirkulationsfunktionen von großem Interesse ist. Die CFL wird durch die scherinduzierte transversale Einwanderung der roten Blutkörperchen (RBCs) in Richtung des Flusszentrumsgebildet 4. Folglich führt diese Migration zu einem Abbau der Erythrozyten in der Nähe der Gefäßwände, was schließlich zu einer zellfreien Plasmaschicht führt. Dementsprechend wird die parietale CFL auf natürliche Weise zu einer Diffusionsbarriere für die Abgabe von Sauerstoff (O2) aus dem Erythrozytenkern an das Gewebe und für das Abfangen von Stickstoffmonoxid (NO) durch die Erythrozyten5,6. Darüber hinaus kann die Produktion von NO auch durch die dynamischen Schwankungen der CFL-Breite7,8 moduliert werden. Daher muss die Rolle der CFL sowohl beim Gastransport als auch bei der Regulation der Homöostase in der Mikrozirkulation vollständig geklärt werden, um den Blutfluss in der Mikrozirkulation besser zu verstehen. Neuere Studien haben sich auf die Überbrückung der Hämodynamik und der Gastransportfunktionen des CFL in der Mikrozirkulation9-12 konzentriert. Darüber hinaus wurde in einer separaten Reihe von Studien untersucht, wie die pathologische Erhöhung der Erythrozytenaggregation die CFL-Bildung moduliert und wie sie sich auf die Bioverfügbarkeit von O2 und NO in Geweben auswirkt13,14.

Die Rolle der CFL wird in der Mikrozirkulation wichtiger, wo die relative Größe der CFL-Breite zum Gefäßdurchmesser im Vordergrund steht. Dies erfordert einen effektiven Ansatz zur Quantifizierung der CFL im in vivo Blutfluss. Insbesondere die Bildaufnahme und die Bildanalyse sind die beiden Schlüsselkomponenten, die die Genauigkeit der CFL-Breitenmessung bestimmen. Einer erfolgreichen Visualisierung des Gewebeblutflusses sollte eine geeignete chirurgische Präparation des Tiermodells vorausgehen. Darüber hinaus ist eine geeignete Bildanalysetechnik erforderlich, um die Einschränkungen herkömmlicher manueller Messungen zu überwinden, die meist durch menschliche Fehler verursacht werden15,16. Mit Fortschritten bei optischen Instrumenten und Rechenleistung für die digitale Bildverarbeitung ist es jetzt möglich, eine genauere und konsistentere Messung derCFL-Breite 17-19 zu erreichen. Nichtsdestotrotz hängt die Genauigkeit dieser Messungen, da sie bildbasiert sind, letztendlich immer noch von der Qualität der Bilder ab.

Daher untersucht diese Studie die Faktoren, die die Messung der in vivo CFL-Breite beeinflussen. Wir konzentrierten uns insbesondere auf die Demonstration der chirurgischen Vorbereitung und der digitalen Bildanalyse für Messungen der CFL-Breite in Arteriolen des Cremaster-Muskels der Ratte.

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Protokoll

Diese Studie ist in Übereinstimmung mit der National University of Singapore Institutional Animal Care und Use Committee (genehmigten Protokoll Nr. R15-0225).

1. Chirurgische Vorbereitung des Tiermodells

  1. Vessel Kanülierungen
    1. Anästhesieren eine männliche Sprague-Dawley-Ratten (6 bis 7 Wochen alt) mit einem Gewicht von (203 ± 20) g mit Ketamin (37,5 mg / ml) und Xylazin (5 mg / ml) Cocktail durch intraperitoneale (ip) Injektion (2 ml / kg) . Nicht an die Nadel rekapitulieren oder aus der Spritze nach der Injektion entfernen.
    2. Sobald das Tier (bestätigt durch Zeh kneifen) anästhesiert wurde, legen Sie es auf einem Heizkissen auf seine Körpertemperatur auf 37 ° C halten. rasieren das Haar sanft auf den Schulterblättern, vorderen Gebärmutterhals, Unterbauch, medialen Hinterbein und Hodensack. zurückhalten Sie vorsichtig die Beine Papierklebebändern verwendet wird.
    3. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe microdissection Schere und Pinzette abgewinkelt, während Sie durchein Stereomikroskop. Legen Sie alle scharfen chirurgischen Werkzeuge auf einem stichfesten Tablett Verletzung während der Operation zu verhindern.
    4. Schrubben Sie alle Operationsstellen 3-mal mit wechselnden Jod und 70% Alkohol, bevor der Schnitt durchgeführt wird. Spülen Sie alle Katheter mit 30 IU / ml Heparin-Kochsalzlösung.
    5. Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Mittellinie Hautschnitt auf den Schulterblättern ein Paar chirurgische Scheren über die rechte Halsvene verwenden. Trennen Sie die Blende durch stumpfe Dissektion die Halsvene zu entlarven und kanülieren es mit einem Polyethylenrohr (PE-50), gefüllt mit Heparin-Kochsalzlösung unter Verwendung von 5-0 Seidennähten. Infundieren zusätzliche Anästhesie bei Bedarf (1/3 bis 1/2 der Anfangsdosierung, intravenös (iv)), im Verlauf der Operation und Experiment.
    6. Führen Sie Tracheotomie Atemwegsdurchgängigkeit zu halten. Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Schnitt im vorderen Halsbereich. Kanülieren die Trachea ein Polyethylenrohr (PE-205) mit 2-0 Seidenfäden mit dem Katheter an Ort und Stelle zu sichern.
    7. Überwachen Sie den Blutdruckdurch Kanülierung in der Arteria femoralis. Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Schnitt an der linken medialen Oberfläche des Hinterbein. Trennen Sie die Oberschenkelarterie durch stumpfe Präparation. Kanülieren die Femoralarterie mit einem Polyethylenschlauch (PE-10), gefüllt mit Heparin-Salzlösung 5-0 Seidennähten verwendet wird.
  2. Cremaster Muscle Vorbereitung und Strömungsvisualisierung
    1. Legen Sie eine 5-0-Seidenfaden durch die Spitze des Hodensack, sie zu verlängern. Einen Einschnitt entlang der ventralen Oberfläche des Hodensack. gelten regelmäßig Warm isotonischen Lösung (37 ° C; pH 7,4) mit dem freiliegenden Muskel.
    2. Entfernen Sie umgebende Bindegewebe sorgfältig und gründlich mit einem Wattestäbchen auftragen.
    3. Legen Sie eine 5-0-Seidenfaden durch die Spitze des M. cremaster. Schneiden Sie die Naht in zwei Stücke von gleicher Länge und einen Knoten auf jeder Seite zu binden. Schneiden Sie den Muskel zwischen den beiden Knoten und dehnen sie auf eine maßgeschneiderte transparente Plexiglas-Plattform, indem Sie vorsichtig die Naht ziehen. Fixdas Ende des Fadens auf die Plattform mit blauem tack.
      HINWEIS: Eine gründliche Entfernung von Bindegewebe umgeben ist von entscheidender Bedeutung bei der Beschaffung von optimalen Bildkontrast.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3 bis 5 bis 6 Fixierungen vorgenommen werden. die Cremaster Muskel aus dem Nebenhoden mit hoher Temperatur Kauter vorsichtig entfernen. Superfuse warme isotonischen Lösung mit dem freiliegenden Muskel Dehydratisierung des Gewebes zu verhindern.
      1. Umgeben den Cremaster Muskel mit gefalteten Stücke aus Gaze. Decken Sie die freiliegenden Muskel mit einem Polyvinylfilm. Die Gaze Stück mit dem Film bilden ein flaches Becken warme isotonischen Lösung für die Wassereintmikroskopobjektiv (1A) zu halten.
    5. Übertragen Sie das Tier auf die Tierstufe eines intravital Mikroskop (Abbildung 1C). Schließen Sie den arteriellen Kanülierung auf einen physiologischen Daten-Erfassungssystem für die kontinuierliche Drucküberwachung (Abbildung 1E).
    6. Pflegen Sie den Muskel temperature bei 35 ° C mit einem Heizelement unterhalb der Tier Plattform (1B) angebracht ist . Legen Sie eine Temperatursonde neben dem Muskel negative Rückkopplung zu den Leistungsregler des Heizelementes (1D) zur Verfügung zu stellen.
    7. Verlassen das Tier auf der Bühne für 15 min mit der Umgebung zu äquilibrieren.
    8. Visualisieren Blutfluss unter einem intravital Mikroskop mit einem 40x Wasser Immersionsobjektiv und einem langen Arbeitstag Kondensator.
    9. Wählen Sie einen unverzweigten arteriole (<60 & mgr; m) auf der Grundlage einer klaren Bildschärfe und Kontrast zwischen der RBC-Kern, CFL und Gefäßwänden, um das Mikroskop auf der diametralen Ebene des Blutgefäßes zu konzentrieren. Drehen Sie die Kamera auf das Mikroskop angebracht vertikal, um die Gefäßwand auszurichten.
    10. Aufzeichnen der Blutfluss unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Videokamera mit einer Bildrate von 3000 / sec für 1 sec. Speichern Sie das aufgenommene Video als unkomprimiertes 8-Bit-Graustufen-AVI-Format die Bildqualität zu erhalten.
      HINWEIS: Eine minimale Aufzeichnungsbildrate von 3000 Bildern / sec wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die CFL Messung mindestens einmal pro RBC unter Strömungsbedingungen physiologischen arteriolar durchgeführt werden kann.
    11. Verwenden, um ein Blaufilter mit einer Spitzendurchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 394 nm und der spektralen Bandpass bei 310 bis 510 nm den Kontrast zwischen den RBCs und Plasma zu verbessern.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Lichtspektrum von der mikroskopischen Lichtquelle durch den blauen Filter passiert (100 W-Halogenlampe) mit niedriger Lichtintensität ist eine mögliche Gewebeschäden zu verhindern.
    12. Am Ende des Experiments euthanize das Tier mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium.

2. Bildanalyse

  1. Vorverarbeitung für die Messung CFL Breite
    1. Öffnen Sie MATLAB und führen Sie die 'CFL_pre.m' Datei. (Diese und andere MATLAB-Dateien können im Verzeichnisip "> Supplemental MATLAB - Archiv.)
    2. Klicken Sie auf "Datei öffnen", um die Videodatei auszuwählen zu analysieren.
    3. Stellen Sie die "Rotation" Schieber die Gefäßwände vertikal auszurichten.
      HINWEIS: Die Anwender können durch die Auswahl der "Grid On 'Radio-Button, und stellen Sie die Zoomstufe des Bildes durch Verschieben des" Zoom "Schieber, um die Unterstützung der Gitterlinien für das Schiff Ausrichtung anzuzeigen.
    4. Klicken Sie auf die "Eingabe bestätigen", um die Gefäß Ausrichtung zu bestätigen.
    5. Klicken Sie auf die 'Set-ROI Ernte ", um die Region von Interesse (ROI) zu definieren. Das ausgerichtete Bild wird in einem Popup-Fenster angezeigt werden. Stellen Sie den rechteckigen Ziel auf das Bild, und klicken Sie doppelt auf den ROI zu bestätigen. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Zuschneiden des Bildes ist nicht erforderlich.
      HINWEIS: Nur umfassen ein einziges Schiff in der ROI der CFL Breite aus dem Behälter zu analysieren. Klicken Sie auf die "Bild zurücksetzen", um das Bild in seiner ursprünglichen Form wieder herzustellen, falls erforderlich.
    6. Drücke den9; Extrahieren von Bildern ", um alle bearbeiteten Video-Frames in aufeinanderfolgende Bitmap-Bildern zu extrahieren (8-Bit-Graustufen 'bmp' Format). Die extrahierten Bilder können in den Ordner mit dem gleichen Namen wie die ausgewählte Videodatei zu finden.
  2. Die Messung der CFL Breite
    1. Öffnen Sie MATLAB und führen Sie die 'CFL_measure.m' Datei.
    2. Klicken Sie auf "Ordner auswählen" den Ordner auszuwählen, die extrahierten Bilder enthält.
    3. Klicken Sie auf den Ordner, um die Bilder und klicken Sie auf "Ordner auswählen" enthält. Der erste Bildrahmen in dem Ordner werden in der "Graustufenbild" Platte, zusammen mit seiner grauen Intensität Histogramm in der "Bild-Histogramm" Platte geladen und angezeigt werden.
    4. Wählen Sie die gewünschte Bildrahmen aus dem Listenfeld die Analyse durchzuführen, andernfalls wird der erste Bildrahmen ausgewählt.
    5. Klicken Sie auf 'Suchen Gefäßwände' die innere Gefäßwand in dem Bild zu identifizieren, die an der Stelle bestimmt, wo dieLichtintensitätsprofil Spitzen Transite von dunkel über zwei Pixel zu beleuchten.
    6. Prüfen "Median-Filter 'ein Medianfilter auf das Bild anzuwenden, um das" Salz und Pfeffer "Lärm zu reduzieren.
    7. Prüfen "Auto-Kontrast", um die Bildintensitäten anzupassen digital den Bildkontrast zu erhöhen.
    8. Wählen Sie eine Schwellwertbildung Algorithmus in der Liste, die automatisch eine Schwellenwert bestimmt (τ), die die Graustufen in zwei Klassen unterteilt - weiße Pixel mit Graustufen über τ (CFL) und schwarze Pixel mit Graustufen unter τ (RBC-Kern).
      HINWEIS: Als alternatives Verfahren, verwenden Sie die manuelle Schwellwertbildung, wenn keiner der automatisierten-Thresholding-Algorithmus ein entsprechendes Bild Thresholding zur Verfügung stellt. Klicken Sie auf das "Manual" Radio-Button und stellen Sie den Regler, um die manuelle Schwellenwert zu definieren.
    9. Um die räumliche Variation der CFL Breiten messen, geben Sie die Pixelauflösung in der "Pixel-Auflösung 'Box (die AuflösungMit diesem Versuchsaufbau betrug 0,42 & mgr; m / Pixel).
    10. Klicken Sie auf den "Berechnen", um die räumliche Variation der CFL Breiten zu erhalten. Klicken Sie auf "Export CSV" die CFL Breitendaten in Tabellenformat zu exportieren.
    11. Um die zeitliche Variation der CFL Breiten messen bei einer bestimmten Analyse Linie entlang des Gefäßes, klicken Sie auf den "Temporal Variation" Radio-Button und geben Sie die Frame-Rate-Informationen (die Framerate in diesem Versuchsaufbau verwendet wurde, war 3000 Frames / sec).
    12. Geben Sie den ersten Frame und letzten Frame der Bilder für die Analyse in den "Start Frame 'und' Last Frame 'Boxen sind.
    13. Wählen Sie die Position der Analyse Linie entlang des Gefäßes durch die "Analyse Line 'Gleitschiene gleitet. Bestätigen Sie die Position der Analyse-Linie, die sowohl auf der "Graustufenbild" dargestellt ist und 'Binary Bild'.
    14. Klicken Sie auf "Berechnen" die zeitliche Variation der CFL Breiten zu erhalten. click "Export CSV" die CFL Breitendaten in Tabellenformat zu exportieren.

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Ergebnisse

Die Visualisierung der CFL in vivo ist weitgehend abhängig von den chirurgischen Vorbereitungen des Tieres. Übermäßige Blutverlust oder längere Operationsdauer kann das Tier auch keinen Erschütterungen und den Blutfluss Verirrungen. Aufrechterhaltung der Gewebetemperatur ein Heizkissen sowie eine angepasste Plattform während der Operation und Experiment unter Verwendung ist auch entscheidend die physiologischen Bedingungen der Ratte zu halten. Unter Verwendung einer 100-W-Halogenlampe im Mikroskopsystem, keine ...

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Diskussion

Die Messung der CFL Breite ist für ein besseres Verständnis der Hämodynamik in der Mikrozirkulation wesentlich. Insbesondere wurde die Messung der CFL Breiten in mesenterischen 6 durchgeführt wurde, spinotrapezius 24 und cerebral 25 microcirculations. Herkömmliche Messung der in vivo CFL Breiten wurde durch manuelle Inspektion der aufgezeichneten Video - Frames Schätzungen beschränkt. Die manuelle Messungen erforderlich , um die Mittelung von mehreren aufeinanderfolgenden Videob...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IntravitalmikroskopOlympusBX51WIAusrüstung
HochgeschwindigkeitskameraPhotron1024PCIAusrüstung
BlaufilterHOYAB390Ausrüstung
Drucksensor & Biopac-SystemBiopac-System TSD104A, MP100Ausrüstung
TemperaturreglerShimadenSR 1Ausrüstung
Plasma Lyte ABaxterNDC:0338-0221Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Kochsalzlösung 0,9%Braun
Heparin (5.000 I.E./ml)LEO
PE-10 Polyethylen TubeBecton Dickinson427400.024" OD x .011" ID 
PE-50 Polyethylen-SchlauchBecton Dickinson427411.038" OD x .023" ID
PE-205 Polyethylen-SchlauchBecton Dickinson427446.082" OD x .062" ID
2-0 nicht resorbierbares SeidennahtDeknatel113-S
5-0 nicht resorbierbares SeidennahtDeknatel106-S
Gaymar
WasserbadFisher ScientificIsotemp 205Ausrüstung
Sterile Baumwollgaze Fisher Scientific22-415-468
Applikatoren mit WattespitzeFisher Scientific23-400-124
Dumont PinzettenKent ScientificINS14188Chirurgisches Instrument
MikrodisparierzangeKent ScientificINS15915Chirurgisches Instrument
Iriszange 1 x 2 ZähneKent ScientificINS15917Surgical Instrument
KanülenzangeKent ScientificINS500377Chirurgisches Instrument
MikroschereKent ScientificINS14177Chirurgisches Instrument
IrisschereKent ScientificINS14225Chirurgisches Instrument
GefäßclipKent ScientificINS14120Chirurgisches Instrument
Gemini KautersystemBraintree ScientificGEM 5917Chirurgisches Instrument
Wasserzirkulierendes Heizkissen

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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