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Methodenartikel

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

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DOI:

10.3791/54553

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5. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die funktionelle Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen mit mittlerem bis hohem Durchsatz innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume ermöglicht. Es ist effizient, einfach zu bedienen und vielseitig einsetzbar für eine Reihe von Baumarten.

Zusammenfassung

Sekundäre Stengelwachstum in den Bäumen und die damit verbundenen Holzbildung sind signifikant sowohl von biologischen und wirtschaftliche Perspektiven. Jedoch relativ wenig über die molekularen Kontrolle bekannt, die ihre Entwicklung steuert. Dies ist zum Teil aufgrund physikalischer, Ressourcen- und Zeitbegrenzungen oft mit dem Studium der sekundären Wachstumsprozessen in Verbindung gebracht. Eine Reihe von in - vitro - Techniken verwendet wurden , sowohl in der holzigen und nicht holzigen Pflanzenarten entweder Pflanzenteil oder ganze Pflanze System beteiligt sind . Jedoch Fragen über ihre Anwendbarkeit für die Untersuchung der Nebenschaftwachstumsprozesse, die Widerspenstigkeit bestimmter Arten und Arbeitsintensität sind oft unerschwinglich für mittlere bis hohe Durchsatzanwendungen. Auch wenn an Nebenschaft Entwicklung und Holzbildung suchen die spezifischen untersuchten Merkmale könnten nur messbar werden spät in einem Baum des Lebenszyklus nach mehreren Jahren des Wachstums. In diesen Herausforderungen Alternative in vivo p Adressierungrotocols wurden entwickelt, mit dem Namen Induced Somatic Branchenanalyse, die die Schaffung von transgenen somatischen Gewebe Sektoren direkt in der Anlage Nebenschaft einzubeziehen. Das Ziel dieses Protokolls ist eine effiziente, einfach und relativ schnell Mittel zur Verfügung zu stellen transgene sekundären Pflanzengewebe für Gen und Promotor funktionelle Charakterisierung zu erstellen, die in einer Reihe von Baumarten verwendet werden können. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass transgene Nebenschaft Sektoren in allen lebenden Geweben und Zelltypen erstellt werden, in der Sekundär einer Vielzahl von Baumarten stammt, und dass Holz als auch morphologische Merkmale als Promotor-Expressionsmuster in sekundären leicht mittel bis hoch eingeschätzt werden können Stiele erleichtern Durchsatz funktionelle Charakterisierung.

Einleitung

Baum stammt eine erhebliche Menge der Planeten Biomasse umfassen und sind von immenser biologische, kulturelle und wirtschaftliche Bedeutung. Sekundäre Stielen Lebensraum schaffen, indem sie Ressourcen und Schutz für viele andere Lebensformen bieten. Sie liefern viele andere Dienstleistungen für die Ökosysteme, die sie bewohnen und wirken als nachwachsender Rohstoff für die Produktion von Holz, Zellstoff und Papier und andere Holz- und Nichtholzprodukten. Nebenschaft Entwicklung und insbesondere Holzbildung von komplexen molekularen System geregelt wird, das die Entwicklung von spezifischen Zelltypen, die biochemische Zusammensetzung ihrer Zellwände regulieren und wie sie angeordnet sind Gewebe und Organe zu bilden. Sezieren die molekulare Basis von Sekundärstammentwicklung und Holzbildung wird von vielen Faktoren ab, einschließlich der Variabilität von Holz und Stamm Eigenschaften verwechselt innerhalb und zwischen den Stämmen, lange Generationszeiten, out-Kreuzung Paarungssysteme, hohe Heterozygotie, hohe genetische Belastung, saisonale dormancy, lange reifenMerkmal Einrichtung Zeiten und die schiere physische Größe von ausgewachsenen Bäumen. Als Ergebnis, das Verständnis der Nebenschaft Entwicklung in Bezug auf die genaue Kenntnis der meisten anderen Aspekte der molekularen Kontrolle der Pflanzenentwicklung, ist immer noch in den Kinderschuhen.

Eine Reihe von in vitro - Techniken verwendet wurden Nebenschaft Entwicklung, insbesondere Holz und sekundären Zellwandbildung zu untersuchen und zu verstehen. Diese Protokolle umfassen die Verwendung von ganzen Pflanze oder der Pflanzenteil Systemen, bei denen entweder transgene Pflanzen erzeugt werden oder spezifische Sekundärzellen oder Gewebe werden für die Untersuchung von spezifischen Aspekten der Holz transformiert und / oder sekundären Schaft Entwicklung 1. Transgene Pflanzen können Post genetische Transformation aus einer Vielzahl von Pflanzengeweben und Zelltypen jedoch wiederhergestellt werden, geht nur langsam voran, vor allem, wenn Züge Holzfasern aufgrund der langen Regenerations Analyse und Reifezeiten stammen (in der Größenordnung von Jahren), hohe technische und Arbeits demands, geringen Durchsatz von Kandidatengenen sowie Schwierigkeiten in einigen holzigen Pflanzenarten. Ähnliche Techniken wurden in nicht-holzigen Modellsystem wie Arabidopsis entwickelt , die erfolgreich einige dieser Einschränkungen zu überwinden, aber nicht alle sekundären Typen Stammzelle eine in diesen Stämmen und Eigenschaften der Saisonalität oder Langlebigkeit selbst können nicht in einer solchen Art 2 untersucht werden. Alternativ Anlagenteilsysteme, wie Pinu s radiata Kalluskulturen 3 die damit verbundenen Fristen zu reduzieren. Diese Verfahren sind jedoch auf die Untersuchung eines einzelnen Zelltyp beschränkt und leiden ähnliche Einschränkungen wie für in vitro Versuche festgestellt. In ähnlicher Weise wurden apikal Stammkulturen 4 beteiligt ganze Stamm Explantate gezeigt Versprechen , aber noch nicht für die Untersuchung spezifischer Gene oder Promotoren von Interesse angewendet wurden. In jüngster Zeit ist ein alternatives Protokoll Haarwurzelkulturen beteiligt hat für Eucalypten und wurde erfolgreich entwickelt5 angelegt, wobei dieses Verfahren beinhaltet jedoch in vitro - Kultivierung erfordert immer noch, eher zweitrangig Wurzeln als Stämme und es ist auf einer einzigen Baumart zu datieren.

Induzierte somatischen Sektoranalyse (IVSS), wurde wie hier beschrieben, entwickelt eine mittlere bis hohe Durchsatz funktionelle Screening-Tool, einige dieser Probleme zu überwinden, für Gene und Promotoren mit Verdacht auf Rollen in Holzbildung und Nebenschaftgewebe Entwicklung. ISSA ist ein in vivo - Transformation und Screening - System , das entwickelt wurde , um die Zeit zu reduzieren , genommen , um transgene Zellen und Gewebe in einem intakten sekundären Schaft erzeugen , während Arbeits überwinden, technischen und Durchsatzbeschränkungen von routinemßig in vitro - Methoden verwendet. Die Protokolle hier beschrieben ermöglichen die gleichzeitige Schaffung von Hunderten von unabhängig transformierten Gewebe Sektoren und Zellen in sekundären innerhalb einer kurzen Zeit stammt, in der Baumarten und Gewebe von Interesse ohne genetic und / oder Umweltvariation innerhalb relativ kurzer Zeitrahmen und niedrigen Arbeitskosten. IVSS in - vivo - Techniken wurden zunächst für Sekundär Schaft 6 und Knospe 7 Gewebe beschrieben und seitdem in Nebenschaftgewebe durch Studien von Genen und / oder Promotoren in cambial Differenzierung beteiligt verfeinert worden und umfassen: Tubulin (TUB) 8, Fasciclin artigen Arabinogalactan ( FLA) 9, Cellulose - Synthase (CESA) 10, sekundäre Zellwand-assoziierten nac Domain (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 und wirklich interessante neue Gen (RING) H2 - Protein 13. Diese Studien wurden in sekundären geführt stammt von Pappeln und Eukalyptus Pflanzen und Einblicke in die Zellmorphologie, Zellwand Chemie und Genexpression.

Die Protokolle hier beschriebenen sollen die Erfahrung ein zusammen zu bringennd gewonnenen Erkenntnisse durch die Entwicklung und Anwendung der IVSS aus einer Reihe von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Studien im letzten Jahrzehnt. Sie konzentrieren sich auf die in - vivo - Transformation von Nebenschaftgewebe 6 und konzentrieren sich auf Studien mit Populus alba 'pyramidalis' Klon, Eucalyptus globulus sowie 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone. Dieses Dokument nimmt Forscher durch das Protokoll aus dem Anbau von Pflanzen und Bakterien, die Umwandlung von Stammzellen Gewebe, Wachstum und Ernte von Gewebe, die Identifizierung von transgenen Zellen und Geweben, die Vorbereitung auf phänotypische Einschätzungen und Verfahren zur Erhebung und Analyse von Daten. Während Techniken erfolgreich angewendet wurden Zellwand Monosaccharidzusammensetzung auch 9,11, aus Platzgründen zu messen, konzentriert sich dieses Dokument auf Techniken zur Messung der Zell- und Gewebemorphologie und das Verständnis von Genexpressionsmustern in sekundären st verwendetnur ems. Dementsprechend wird, wie das Protokoll zu denen weitere Einblicke in die Rolle und / oder Expression von Genen zur sekundären Stiele mit einem kostengünstigen, technisch einfach und mittlere bis hohe Durchsatzverfahren verknüpft zu gewinnen suchen geeignet skizziert.

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Protokoll

1. Herstellung von Pflanzenmaterial

  1. Vor dem Experimentieren, werfen neue Setzlinge der bevorzugten Baumarten aus Samen oder Schneiden und wachsen, bis der Durchmesser des Stammes in der Fläche, die für Experimente ist etwa 1 cm im Durchmesser Baum / s.
    Hinweis: Die benötigte Zeit kann variieren aufgrund Pflanzenwachstumsraten daher zwischen drei bis neun Monaten für diesen Schritt zu ermöglichen.

2. Binary Vector Creation

  1. Führen Sie Arbeiten von diesem Abschnitt zu Abschnitt 7 in einem Labor oder Gewächshaus , wo Agrobacterium tumefaciens gehandhabt werden kann , und dass geeignete persönliche für das Labor vorgeschriebene Schutzausrüstung verwendet.
  2. Vorbereiten eines binären Vektor entweder ein interessierendes Gen Zuschlags oder Überexpression Kassette und einem β-Glucuronidase (GUS) -Reportergen Kassette oder einen Promotor von Interesse fusioniert mit einem GUS-Gen in Abhängigkeit von der Art der Studie enthält.
    Hinweis: Es gibt eine Reihe von binären Vektor backbones, die im Handel oder durch Forschungsnetzwerke sowie zahlreiche Techniken zur Verfügung, zum Einfügen von Genen und Promotoren von Interesse in binäre Vektoren bezogen werden können. Im Rahmen dieses Protokolls ist es, den Experimentator, um die Entscheidung darüber zu treffen, wie einen binären Vektor zu erzeugen.
  3. Trans binären Vektors in eine entwaffnete Stamm von A. tumefaciens unter Verwendung von Elektroporation oder Hitzeschock - 14 und entsprechend speichern , benötigt bis zum Experimentieren.
  4. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für jede positive und / oder negative Kontrollen.
    Hinweis: Negative Kontrollen einen binären Vektor enthalten sollte kein Gen von Interesse für ein Gen von Interesse Studie und ein promotor GUS für einen Promotor von Interesse Studie enthält. Positive Kontrolle für einen Promotor von Interesse Studie sollte ein Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor (CaMV35S) umfassen mit einem GUS-Reporter fusioniert.

3. Herstellung von A. tumefaciens für die Inokulation

  1. Mindestens eine Woche vor der experimentation, nehmen Sie eine kleine Menge (ca. 1 & mgr; l) von A. tumefaciens vorbereitet während Schritt 2.2 und 2.3 und die Ausbreitung dünn auf separaten LB - Medium mit Agar 14 Platten mit geeigneten Antibiotika zur Bekämpfung von bakteriellen Auswahl. Wachsen bei 28 ° C in einem Inkubator kleinen Kolonien zu bilden, und dann bei 4 ° C bis benötigt.
  2. 48 Stunden vor dem Experiment zu übertragen , eine Kolonie von A. tumefaciens von jeder Platte in getrennte 50 ml mit Schraubverschluss Röhrchen 5 ml vorgewärmten (28 ° C) LB - Medium 14 mit geeigneten Antibiotika für bakterielle Selektion enthalten , und für etwa 48 Stunden bei 28 ° C bei 200 rpm auf einem Schüttelinkubator agitieren , bis Mischung ist sehr trüb.
  3. Zwischen 4-6 Stunden vor der Impfung von Pflanzenstängeln (Abschnitt 4) 1 ml der LB / A. tumefaciens Mischung in ein frisches 50 ml mit Schraubverschluss Röhrchen mit 19 ml (1:20 Verdünnung) von frischem warm (28 ° C) LB - Medium mit geeigneten Antibiotika fürBakterien Auswahl. Wenn die optische Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600, wie durch Spektroskopie gemessen) oberhalb 0,1, verdünnt weiter mit warmem LB , bis dies erreicht ist.
  4. Legen verdünnt LB / A. tumefaciens Mischung wieder auf den Schüttelinkubator und schütteln unter den gleichen Bedingungen (200 Umdrehungen pro Minute, 28 ° C) , bis die OD 600 zwischen 0,4-0,6 und zu entfernen.
  5. Zentrifuge LB / A. tumefaciens Gemisch 15 min bei 1000 xg und 4 ° C.
  6. Dekantieren Flüssigkeit und sofort suspendieren A. tumefaciens Pellet in 1 ml MS - Medium 15 gekühlt, Transfer in 2 ml Mikroröhrchen und lagern auf Eis bis zur Inokulation (Abschnitt 4) erforderlich. Diese Lösung wird als Inoculation Medien.

4. Inokulation von Pflanzen mit A. Stem tumefaciens

  1. Starten Sie Experimentieren im späten Frühjahr oder im Frühsommer mit Pflanzen in Abschnitt 1 erstellt, die eine aktive und schnell wachsenden Kambium haben. Eine gute Diagnose für eineaktiv und schnell wachsenden Kambium ist, dass das Phloem von Xylem leicht abgezogen werden kann.
  2. Finden Sie einen klaren geraden Abschnitt der Stamm in der Nähe der Basis der Pflanze und entfernen Sie alle Blätter und Zweige.
  3. Mit einem scharfen Skalpell (vorzugsweise No. 11) oder einer Rasierklinge, erstellen Sie eine 1 cm 2 'cambial Fenster' in einem klaren Abschnitt des Schaftes durch zwei vertikalen , parallelen Einschnitt Einführung durch den Bast von 20 mm in der Länge und einem 5 mm auseinander dann eine horizontaler Schnitt, der die beiden vertikale Schnitte an ihrem Basisende verbindet.
  4. Ziehen Sie die Phloem Streifen erstellt von der Schnitt nach oben Aussetzen der Entwicklung Xylemgewebe und fügen Sie ausreichend Inokulation Medien aus Schritt 3.6 die Oberfläche des freiliegenden Entwicklung Xylem zu benetzen mit einer Pipette (in der Regel 5 bis 10 & mgr; l). Unmittelbar nach dem Phloem Streifen wieder einsetzen.
  5. Binden Sie das Phloem Streifen an den Stamm fest mit Parafilm.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5 für alle weiteren cambial Fenster für das Gen (e) oder Promotor (en) von Interesse eine Schaffungny neue cambial Fenster mindestens 1 cm über oder unter anderen cambial Fenster und um 90 ° versetzt.
  7. Führen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5 für die positiven und negativen Steuervektoren (Schritt 2.4) sicherzustellen, dass jeder Vektor auf den gleichen Stamm von jedem in dem Experiment verwendete Pflanze hinzugefügt wird.
  8. Monitor-Schaftdurchmesser Wachstum in regelmäßigen Abständen und Ernte für GUS-Test (Abschnitt 5), wenn das radiale Wachstum von mindestens 5 mm hat in Stämmen beobachtet.
    Anmerkung: Die Menge der benötigten radialen Wachstum auf der Gewebemenge abhängig ist für nachgeschaltete Analyse erforderlich.

5. Ernten für GUS Histologische Assay

  1. Excise die "cambial Fenster" aus dem Stamm jedes Gewebe nicht Teil des neuen Wachstums im cambial Fenster zu entfernen.
    1. Für Studien im Zusammenhang Xylem zu reifen und Phloem Zell / Gewebemorphologie, schälen die Bast von Xylem.
    2. Für Studien, bei denen die cambial Zone intakt oder Promotor-Expressionsmuster bleiben erforderlich sind zu beurteilened, in Scheiben schneiden quer die cambial Fenster mit einer Rasierklinge oder einem anderen scharfen Messer in Scheiben zwischen 0,5 und 1 mm Dicke verwendet.
  2. Platzieren verarbeitet cambial Fenster Gewebe in 14 ml Rundbodenröhrchen und spülen zweimal in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7 14. Stellen Sie sicher , dass das Gewebe vollständig eingetaucht wird, bleibt in Lösung für mindestens fünf Minuten lang und alle überschüssige Lösung wird am Ende entfernt von die zweite Spülung.
  3. 5 ml GUS-Reagens (0,5 mM X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronsäure), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM Kalium Ferricyanid (III), 0,05 mM Kaliumhexacyanoferrat (II), die mit 0,1 mM Phosphatpuffer , pH 7 bis Endvolumen up, vgl . Hawkins et al 16) in jedes Röhrchen. Wenn Gewebe nicht vollständig unter Wasser, fügen Sie weitere GUS-Reagenz.
  4. Die Röhrchen für 10 min bei 55 ° C im Dunkeln.
  5. Die Röhrchen für weitere 12-16 h auf einem Rüttler-Inkubator bei 37 ° C im DunkelnVerwendung von leichtem Schütteln (30 bis 60 rpm) für das Mischen zu ermöglichen.
  6. Nach der Entnahme aus Schüttelinkubator zufällig den pH-Wert der GUS-Reagens in einer kleinen Untergruppe von Rohren mit Lackmuspapier mit einem pH-Bereich 0-7.
    1. Wenn jede der Röhren einen pH-Wert unterhalb von 6 haben dann beschriften. Weiter um den Rest der Rohre zu prüfen, pH-Wert zu bestätigen und kennzeichnen, wenn pH-Wert 6 oder weniger beträgt.
      Hinweis: Proben mit einem pH-Wert unter 6 kann nicht für die Analyse geeignet sein. Diese Proben sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
  7. Dekantieren GUS-Reagenz und ersetzen mit ausreichend 70% Ethanol Gewebe zu bedecken.
  8. Lagerung bei 4 ° C bis benötigt.

6. Identifizierung von transgenen Gewebe

  1. Mit einer Pinzette, nehmen Sie alle cambial Fenster Gewebe aus einem Rohr und in kleinen Schale oder Petrischale für die mikroskopische Visualisierung zu ermöglichen.
  2. Verwendung eines Präpariermikroskops zwischen 1X und 4-fache Vergrößerung, zu identifizieren und die Anzahl der Zellen oder Gewebe tallydass haben eine helle blaue Färbung. Blau gefärbte Zellen oder Gewebe werden als Sektor ab diesem Zeitpunkt bezeichnet. Tally sie auf folgende Weise.
    1. Für Proben , bei denen das Phloem (Schritt 5.1.1), zählen die Anzahl der Sektoren in cambial Gewebe auf der Oberfläche der Entwicklungs Xylem (cambial Sektor, Abbildung 1a) gefunden wurde entfernt.
    2. Bei Proben, die in Scheiben (Schritt 5.1.2) geschnitten wurden, die Anzahl Sektoren zählen in den verschiedenen Zell- oder Gewebetypen (Abbildung 1b, 1c, 1d) gefunden. Die periderm (Periderm Sektor, Abbildung 1e), Bast (Phloem Sektor, 1f), cambial Gewebe (kambiale Sektor, 1g, 1h, 1I), Wund Parenchym (Wound Parenchyma Sektor: Branchen können in den folgenden Gewebetypen gefunden werden Abbildung 1 j) und in Thyllen (Tylose Sektor, Abbildung 1k).
      1. Während mikroskopische aEURTEILUNG sicherzustellen, daß beide Seiten einer Scheibe angesehen worden sind, und dass die Sektoren, die sich über zwei Scheiben auftreten, werden so abgestimmt, dass die Zahlen nicht hoch genug eingeschätzt werden.
  3. Platzieren nur das Gewebe enthaltenden Sektoren zurück in das Röhrchen, das 70% Ethanol und zu speichern, bis sie benötigt.
  4. Wiederholen Sie Schritt 6.1 bis 6.3 für zusätzliche cambial Fenster einschließlich der positive und / oder negative Kontrolle.
  5. Berechnen Sie die durchschnittliche Transformationseffizienz für jeden Sektor Typ für jedes Gen oder Promotor von Interesse und den Kontrollen separat durch die Gesamtzahl der Sektoren durch die Gesamtzahl von 1 cm 2 cambial Fenster Dividieren einer durchschnittlichen Anzahl von Transformations - Events pro cm 2 von Cambium abzuleiten Die inokulierten (ATScm -2).
  6. Gehen 7.2 und 8 für die Analyse von Promotor-Expressionsmuster auf Schritt und 7.1, 7.2 oder 7.3 für Techniken Schritt Zell- und Gewebemorphologie in cambial Gewebe zu beurteilen.

7. Analyse vonZell- und Gewebemorphologie in kambiale Tissue

Hinweis: Im Folgenden eine Auswahl von Techniken, die erfolgreich für die Analyse von ISSA abgeleiteten Proben verwendet wurden.

  1. Analyse von Xylem Zellenbereich, Lumenfläche, Zellwanddicke und Zellwandbereich mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
    Hinweis: Dieses Protokoll minimale Probenvorbereitung erfordert und ermöglicht eine relativ hohe Durchsatz von Sektoranalyse in Bezug auf die morphologische Merkmale beschrieben.
    1. Von diesem Schritt vorwärts bitte sicherzustellen, Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe verwendet, wenn Holzgewebe wird bearbeitet und behandelt wird.
    2. Identifizieren eines cambial Sektor für die Analyse und einen Einschnitt machen etwa 0,5 mm auf beiden Seiten davon eine einzige Rasierklinge mit einer Scheibe (2a) zu erzeugen.
    3. Trim überschüssige Xylemgewebe wobei ungefähr 1 mm von Xylemgewebe zur tangentialen Seite des Sektors (Abbildung 2b).
    4. Vorsichtigly geschnitten quer durch das Zentrum des Sektors eine neue Doppel Rasierklinge (Abbildung 2c) verwendet wird .
    5. Machen Sie zwei weitere flache radiale Einschnitte auf der Querebene auf beiden Seiten der Sektor der transgenen Gewebe (Abbildung 2d) abgrenzen. Wie die GUS-Färbung entlang der radialen Dateien von Zellen auf beiden Seiten des gefärbten Gewebe nicht durchdringen wird tief in das Gewebe folgen an der cambial Oberfläche gefunden.
    6. Vorbereitet cambial Sektor Gesicht Bringen auffahren zu Stufe eines SEM Stiftstummel mit SEM leitfähiges Band (Abbildung 2e) und in Exsikkator halten , bis für SEM - Visualisierung benötigt.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 7.1.2 für alle weiteren Sektoren 7.1.6 einschließlich der aus der Negativkontrolle.
    8. Mit Hilfe eines SEM in einem niedrigen Vakuum - Modus (Energie 5 kV, Spot 3.0 nm), zu visualisieren und Fotos von Zellen / Gewebe innerhalb des Sektors nehmen sowie die Zellen / Gewebe direkt neben dem Sektor (Abbildung 2f). Der Betrag der Vergrßerungist auf die Merkmale von Interesse abhängig. Für Xylemfasern ist 2,000X geeignet (Abbildung 2 g).
    9. Sobald ein cambial Sektor visualisiert und Fotografien an einer geeigneten Vergrößerung aufgenommen, messen Xylem Zell / Gewebe morphologische Merkmale von Interesse unter Verwendung von Bildmesssoftware.
    10. Für die statistische Analyse vornehmen mehrere paarweise Analysen gepaarte t-Tests unter Verwendung der Differenz zwischen morphologischen in dem transgenen Sektor und dem benachbarten nicht-transgenen Kontrollzellen / Gewebe (gemessen innerhalb von 0,5 mm von der Sektorrand) für jeden Sektor gemessene zum Vergleich p zu bestimmen, -Wert.
    11. Wiederholen Sie Schritt 7.1.10 für die Negativkontrolle.
      1. In Fällen, in denen die positive Kontrolle eine niedrige p-Wert zeigt (α <0,05), die Berechnung der Differenz zwischen den transgenen und nicht-transgenen benachbarten Zellen / Gewebe für eine morphologische Eigenschaft. Verwenden Sie dieses "Differenzwert" in einem ungepaarten t-Test, um die Wirkung des Gens von Interesse mit dem negat zu vergleichenive Steuerung einen p-Wert zu bestimmen.
  2. Die histochemische Analyse von cambial Zell / Gewebemorphologie oder Promotor-Expressionsmuster in Stammzellen / Gewebe Lichtmikroskopie.
    Hinweis: Während mehr Zeit in Anspruch, ist diese Methode für weitere Analysemöglichkeiten einschließlich der Aspekte der cambial Dynamik ermöglicht, zB cambial Breite sowie Promotor - Expressionsmuster. Darüber hinaus, wenn nicht in der Lage eine SEM zuzugreifen, kann dieses Protokoll als Alternative für den Schritt 7.1 verwendet werden.
    1. Verbrauchsektor von Interesse Rasierklinge und einige umgebende Gewebe als kleine Blöcke (nicht mehr als 1 mm 3) und direkt in 1-3 ml 100% igem Ethanol in einem Probenfläschchen mit Schraubverschluss für mindestens 2 Tage bei 4 ° C auf einem Schüttler. Bereiten Sie die kleinen Block in einer Weise, die für die interessierende Oberfläche ermöglicht durch ein Mikrotom zugegriffen wird.
    2. Wiederholen Sie dies für alle weiteren Sektoren einschließlich der aus der Negativkontrolle.
    3. Entfernen Sie Flüssigkeit und ersetzen mit 25% Ethanol: 75% LR weiße Mischung für 2 Tage aufrechterhalten Bedingungen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 7.2.3 mit 50% Ethanol: 50% LR weiß, 25% Ethanol: 75% LR weiß und dann schließlich zweimal mit 100% LR weiß.
    5. Legen Sie kleine Block in Einbettform mit der Oberfläche von Interesse kurzen Ende ausgerichtet und sorgfältig abdecken mit frischem LR weiß und polymerisieren gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    6. Schneiden Sie 5 um Abschnitte von der Oberfläche von Interesse auf einem Rotationsmikrotom und Montage auf einem Glasträger. Verwenden Sie Safranin O (0,01%) Färbung Zellwand sichtbar zu machen und / oder in anderen Funktionen.
    7. In Eindeckmedien, legen Sie ein Deckglas und lassen Sie über Nacht zu setzen.
    8. Blick unter einem Lichtmikroskop zwischen 100X und 600X Vergrößerung und Aufnahme-Bild.
    9. Erfassen Sie morphologische Merkmale von Bildern mit Bildmesssoftware.
      1. Für die statistische Analyse der quantitativen morphologische Merkmale, setzen Sie mit Schritt 7.1.10 auf.
      2. Für die qualitative Analyse von morphologischen Merkmalen,Vergleichen und beschreiben Muster für das Gen oder Promotor von Interesse beobachtet und die negative und / oder positive Kontrolle.
  3. Analyse von microfibril Winkel (MFA) in Mazerierte Fibers Mit Lichtmikroskopie.
    1. Excise transgenen Xylemgewebe direkt von einem Sektor sowie aus nicht-transgenen Gewebe neben sie (innerhalb von 0,5 mm, Abbildung 2h) und in getrennten 1,5 - ml - Röhrchen. Wiederholen Sie dies für alle weiteren Sektoren einschließlich der aus der Negativkontrolle.
    2. Führen Sie die Schritte 7.3.3 bis 7.3.5 in einem Abzug.
    3. Nach Eintragen von 250 & mgr; l Wasserstoffperoxid und 250 ul Eisessig zu jedem Röhrchen.
    4. Platzieren Sie Rohr in Wärmeblock bei 90 ° C für 2 Stunden in Abzug durchführen.
    5. Entfernen Gewebe aus Rohren und sorgfältig spülen mit destilliertem Wasser mindestens zweimal.
    6. Mit Hilfe eines wasserlöslichen Eindeckmedien montieren Gewebe auf einem Glasträger und necken auseinander mit scharfen Zange vor einem Deckglas zu befestigen.
    7. Aussichtunter einem Lichtmikroskop und die Aufnahmen von einzelnen Fasern bei einer Vergrößerung von mehr als 400-fache.
    8. Um microfibril Winkel von Fasern, messen den Winkel zwischen den Pit - Öffnungen und / oder Zellwand Riefen und der langen Achse der Faser (Abbildung 2i) unter Verwendung von Bildmesssoftware bestimmen.
    9. Für die statistische Analyse, setzen Sie mit Schritt 7.1.10 auf.

8. Analyse von Promoter Expressionsmuster

  1. Die Analyse der Promoter Expressionsmuster in Nebenschaftgeweben.
    1. Tally die Frequenz eines jeden Sektors Typ für den Promotor von Interesse sowie die positiven und negativen Kontrollen, wie in Schritt 6.2.2 notiert.
    2. Vergleichen Sie die Häufigkeit der verschiedenen Sektortypen für den Promotor von Interesse mit der positiven Kontrolle mittels Chi-Quadrat-Tests p-Werte zu schaffen. Eine weitere Analyse der Zell- / Gewebespezifität kann unter Verwendung von Schritt 7.2 wie erforderlich durchgeführt werden.
      1. Wenn mehr als ein Promotorvon Interesse wird dann wiederholen Sie diese Analyse so dass ein Vergleich zwischen allen Promotoren von Interesse und die positive Kontrolle untersucht.
      2. Wenn Sektoren oder Blaufärbung in der Negativkontrolle beobachtet werden , dann ist dies der Analyse hinzuzufügen , oder je nach Umfang verlassen oder wenn endogene Färbung vermutet wird (siehe Diskussion).
  2. Analyse von Promotor-Expressionsmuster während der kambiale Derivative Entwicklung und Differenzierung.
    1. Verwendung eines Binokular visualisieren alle cambial Sektoren (1g, 1h, 1i) identifiziert in Schritt 6.2 und bestimmen das Vorhandensein / Fehlen der blauen Färbung in drei Gewebe - Typen aus dem Kambium abgeleitet sind ; das Phloem (P), Xylem Entwicklung (X1) oder entwickelt Xylemgewebe (X2) (3a sehen).
    2. die Häufigkeit des Vorhandenseins / Fehlens von GUS-Färbung in den P, X1 und X2 Regionen des Promotors von int gemäß Schritt 8.1.2, zu vergleichen,erest mit der positiven Kontrolle mittels Chi-Quadrat-Tests p-Werte zu schaffen. Eine weitere Analyse der Zell- / Gewebespezifität kann unter Verwendung von Schritt 7.2 wie erforderlich durchgeführt werden.
      1. Siehe Schritte 8.1.2.1 und 8.1.2.2 für weitere Überlegungen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll mit allen Live - Sekundär Stammzellen und Gewebetypen A. als anfällig erwiesen haben tumefaciens Transformationen und wurden in Sektortypen basierend auf dem Zelltyp zunächst umgewandelt und nachfolgende Entwicklungswachstumsmuster definiert. Sektor - Typen gehören periderm, Bast, cambial, Wund Parenchym und Tylose (Abbildung 1b, 1c, 1d) und kann hier gefunden werden in Einklang Standorten in den Rest d...

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Diskussion

Die IVSS-Protokoll ist ein relativ einfaches und effizientes Verfahren zur Erzeugung transgener Stamm Gewebe in Baumarten in den Raum von ein paar Monaten für die Analyse von Genen und Promotoren von Interesse an Holz beteiligt und Bildung einzudämmen. Wenig Aufwand, über Pflanzen am Leben zu erhalten, ist erforderlich , transgene Stammgewebe nach der Impfung zu wachsen, die in - vitro - Verfahren im Gegensatz steht , wo umfangreiche Kultivierung erforderlich ist , Gewebe oder Pflanzen zu erhalten, wo ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich bei der finanziellen Unterstützung für einen Aspekt der Arbeit durch Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) und LP0211919 (GB) und die Industriepartner Sappi und Mondi sowie den Australian Postgraduate Award (EM) des Australian Research Council und den Young Innovators and Scientist Award durch das Australian Department of Agriculture (LT) bedanken. Wir danken auch Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan und Simon Southerton für die vielen Diskussionen und Ideen, die sie während der Entwicklung dieses Protokolls eingebracht haben, sowie Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel und Noemie Defaix für ihre Unterstützung bei der Laborarbeit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PflanzenNANABitte wenden Sie sich bei Bedarf an die örtlichen Baumschullieferanten für Pflanzen
Agrobacterium StammNANAEs gibt viele Möglichkeiten, Agrobactrium-Stämme zu erhalten. Wir empfehlen Ihnen, sich in Ihrer lokalen Forschungsgemeinschaft zu erkundigen, da es in Ihrem Land und Ihrer Region Einschränkungen bei der Beschaffung der Bakterien geben kann.
Binärer Vektor (Gen und Promotor)NANAWir haben eine Reihe von Vektoren entwickelt, die dem ISSA-Protokoll entsprechen, indem wir das Gateway-Rekombinase-System verwenden. Dazu gehören Überexpression, RNAi-Knockouts und Promotor-Fusionsvektoren, die auf modifizierten pCAMBIA-Vektoren basieren und bei Bedarf gerne zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus gibt es viele Vektoren, die der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung stehen.
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Kaliumferricyanid(III)Sigma244023Das gleiche Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen
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LackmuspapierSigmaWHA10360300Das gleiche Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen
Einschneidige RasierklingeProSciTechL055Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
Doppelschneidige RasierklingeProSciTechL056Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
REM Pin StubProSciTechGTP16111Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
Probenfläschchen mit SchraubverschlussProSciTechL6204Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
EthanolsigmaE7023Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
LR weißProSciTechC025Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen
EinbettungsformProSciTechRL090Wir empfehlen diese Sorte, es gibt jedoch viele verfügbare Optionen
Wasser Soulable EinbettmedienProSciTechIA019Ein Beispiel für ein Eindeckmedium, das verwendet werden könnte, aber es gibt auch andere Optionen, die ausgelotet werden könnten.
WasserstoffperoxidSigma216763Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen bezogen werden
EisessigSigmaA9967Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen bezogen werden
Safranin OProSciTechC138Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen
Quanta Environmental Scanning Electron MicroscopeFEIDies ist das Instrument, das in einem Teil dieser Studie verwendet wurde, aber jedes andere REM mit einem Niedrigvakuummodus kann verwendet werden.
Die ImageJ-Bildgebungssoftwarekann von der folgenden URL bezogen werden: http://rsbweb.nih.gov/ij/

Referenzen

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
  2. Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
  3. Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
  4. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
  5. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
  6. Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
  7. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
  8. Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
  9. MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
  10. Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
  11. Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
  12. Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
  13. Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
  14. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
  17. Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
  18. Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).

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