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In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

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DOI:

10.3791/54576

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25. Oktober 2016

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1Laboratory of Experimental Medicine and Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of Antwerp, 2Visceral Pain Group, Discipline of Medicine, University of Adelaide, 3Department of Biomedical Sciences, University of Sheffield, 4Department of Pharmacy, Pharmacology and Postgraduate Medicine, University of Hertfordshire, 5Department of Gastroenterology and Hepatology, Antwerp University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mesenteriale afferente Nerven übermitteln Informationen aus dem Magen-Darm-Trakt zum Gehirn bezüglich der normalen Homöostase sowie der Pathophysiologie. Die Aktivität des gastrointestinalen afferenten Nervs kann beurteilt werden, indem isolierte Darmsegmente mit angeschlossenen afferenten Nerven in ein Organbad eingebaut, der Nerv isoliert und die basale sowie stimulierte Aktivität beurteilt werden.

Zusammenfassung

Afferenten Nerven nicht nur Informationen über die normale Physiologie vermitteln, sondern auch die Signal gestörter Homöostase und pathophysiologischen Prozessen der verschiedenen Organsysteme von der Peripherie in Richtung des zentralen Nervensystems. Als solche hat die erhöhte Aktivität oder "Sensibilisierung" von mesenterischen afferenten Nerven wurde eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der viszerale Hypersensitivität und Bauchschmerzsyndromen zugeordnet.

Mesenteriale afferenten Nerven - Aktivität in vitro in einem isolierten Darm-Segment gemessen werden , die in einem eigens errichteten Organbad montiert ist und aus dem die Splanchnicus isoliert ist, so dass die Forscher direkt Nervenaktivität neben dem Magen - Darm - Segment zu beurteilen. Aktivität kann in standardisierten Bedingungen an der Basislinie aufgezeichnet werden, während der Aufblähung des Segments oder nach der Zugabe von pharmakologischen Verbindungen geliefert intraluminal oder serös. Diese Technik ermöglichtdie Forscher leicht die Wirkung von Medikamenten untersuchen das periphere Nervensystem in Kontrollproben ausgerichtet sind; Außerdem liefert es wichtige Informationen darüber, wie die neuronale Aktivität während der Krankheit verändert. Es sollte jedoch beachtet werden , dass nur afferente neuronale Aktivität Messung der Aktivität einer Relaisstation in der komplexen neuronalen bildet Signalkaskade, und Forscher sollten bedenken , nicht auf die neuronale Aktivität auf anderen Ebenen (zB Dorsalwurzelganglien, Rückenmark oder das zentrale Nervensystem übersehen ), um die komplexen neuronalen Physiologie in Gesundheit und Krankheit vollständig aufzuklären.

Häufig verwendete Anwendungen umfassen die Untersuchung der neuronalen Aktivität in Reaktion auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid und das Studium der afferenten Nerven-Aktivität in Tiermodellen von Reizdarmsyndrom. In einem translationalen Ansatz kann der isolierten Maus intestinalen Segment colonic Überständen von IBS-Patienten ausgesetzt werden. Weiterhin ist eine Modifikationdieser Technik in menschlichen Kolon-Proben vor kurzem anwendbar erwiesen hat.

Einleitung

Sensory-Signalisierung und die Schmerzwahrnehmung ist ein komplexer Prozess, der zwischen afferenten Nerven, Rücken Neuronen, auf- und absteigende fazilitierenden und hemmenden Bahnen und verschiedene Hirnregionen aus einem komplizierten Zusammenspiel ergibt. Als solche Änderungen an einer oder mehreren dieser Stufen in veränderte sensorische Signalgebung und viszeralen Schmerzen bei Krankheitszuständen führen können. Um all diese verschiedenen Aspekte der sensorischen Signal mehrere Techniken studieren wurden von Einzelzellexperimenten entwickelt Bereich (zB Kalzium - Imaging auf Neuronen) auf ganze Tiermodellen (zB Verhaltensreaktionen wie die viszeromotorische Antwort). Die Technik , die in diesem Papier beschrieben ermöglicht es den Forschern , um spezifisch zuführenden Nervenaktivität in vitro aus einem isolierten Segment des Dünndarms oder Dickdarms bei Nagetieren zu bewerten. Kurz gesagt, ein isoliertes Magen-Darm-Segment (in der Regel Jejunum oder Kolon) in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer physiologischen K durchbluteten montiertrebs Lösung. Der Splanchnicus wird freipräpariert und mit einer Elektrode verbunden Registrierung von afferenten neuronalen Aktivität in splanchnic oder Becken afferenten Nerven ermöglicht. Nervenaktivität kann basal oder als Reaktion auf zunehmenden intraluminalen Druck und / oder pharmakologische Verbindungen aufgezeichnet werden , die entweder direkt in die Aufnahmekammer eingesetzt werden kann (serös), oder über die intraluminale Perfusat (mukosal) ihre Wirkung auf afferenten Entladung zu bewerten 1-6 . Zu beachten ist, splanchnici enthalten auch Efferenzen und viscerofugal afferents zusätzlich zu den sensorischen Afferenzen. Einer der wichtigsten Vorteile von ex vivo Splanchnicus Aufnahme ist die Tatsache , dass die Forscher die Nervenaktivität ohne Modulation oder Input aus dem zentralen Nervensystem zu quantifizieren, so dass man die direkte Wirkung von lokal applizierten Verbindungen auf die Nervenaktivität zu untersuchen. Weiterhin Überwachung von Vitalparametern, wie notwendig ist , die in vivo - Ansatz (siehe unten), ist no mehr relevant. In - vitro - splanchnic Aufnahme ist schließlich viel weniger zeitaufwendig als die in - vivo - Pendant.

Zuführenden neuronalen Aktivität in Reaktion auf andere Reize, wie Schleimhaut Streicheln, Sondieren mittels von Frey Haare oder Dehnen des Segments können in einer modifizierten Versuchsaufbau untersucht werden, in denen das Darmgewebe ist festgenagelt und in Längsrichtung geöffnet (die im Gegensatz zu unser Setup ein intaktes Segment) verwenden, wie es in einer früheren Ausgabe 7,8 beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde erst kürzlich eine Technik beschrieben colonic afferenten Nervenaktivierungs in der Kolonwand selbst über Calcium Bildgebung zu studieren, wieder festgenagelt Verwendung longitudinal geöffnet Segment 9.

Eine alternative Version dieser in vivo - Technik besteht aus neuronale Aktivierung in der Nähe der Eintrag des afferenten in das Rückenmark zu messen. Kurz gesagt, wird die sedierten Tier in der Bauchlage, e platziertxposing lumbosakralen Rückenmark ein Paraffin gefüllt und mit der Haut des Einschnitts an dem die afferente von Interesse Projekte durch Laminektomie, den Bau und die dorsale rootlet über eine Platin bipolaren Elektrode 10,11 drapieren. Diese Technik erlaubt zudem Forscher Fasern zu charakterisieren basierend auf ihrer Leitungsgeschwindigkeit und unterscheiden unmyelinated C-Fasern, die aus dünn myelinisierten A & dgr-Fasern. Weiterhin dorsalen Wurzelfasern enthalten ausschließlich sensorischen afferenten Fasern, im Gegensatz zu den gemischten und abführenden splanchnici zuvor erwähnt.

Aufnahme afferenten Nervenentladung in vitro aus isolierten Darmsegmente können auch unter Verwendung von humanen Proben durchgeführt werden, als zwei Forschergruppen unabhängig veröffentlicht first-in-man Manuskripte Kolon afferenten Nervenaktivität in menschlichen Resektionsproben 12,13 Aufnahme. Die Umsetzung dieser Technik in einem mehr führen könnte leicht translatiauf der Maus-Daten an den humanen Zustand und könnte den Forschern ermöglichen, auf einfache Weise Medikamente zu identifizieren, die sensibilisiert sensorischen Nerven Targeting. Die klinische Bedeutung der zuführenden Nervenaktivität zu charakterisieren, sowie die Entdeckung neuer therapeutischer Reagenzien , die exorbitant afferenten Nervenaktivität Ziel, wurde von vielen Experten auf dem Gebiet 14-19 ausführlich diskutiert.

Die zuvor genannte In - vitro - Technik ergänzt die am häufigsten in vivo - Messung von afferenten Nervenaktivität bekannt. Während in vivo kann neuronalen Aktivitätsmessung, Nervenaktivität direkt im sediert Tieres gemessen werden , während der das interessierende Segment identifiziert wird und anschließend intubiert und ein flüssiges Paraffin gefüllt und wird mit Hilfe der Bauchdecke und die Haut 20 des Nagetier konstruiert. Der afferente von Interesse wird dann identifiziert, geschnitten und auf einer bipolaren Platinelektrode gelegt, die neuronale Aktivität ermöglicht Messung!t. Diese Technik erlaubt es dem Forscher afferenten Nervenaktivität zu modulieren, wenn auch sediert Tiere in lebenden; als solche kann man reagieren neuronale Aktivität zu Störungen wie luminalen Distension oder intravenöser Verabreichung einer Verbindung studieren.

Translationale Forschung heutzutage konzentriert sich hauptsächlich auf die Anwendung von Menschen stammenden Überstände (z. B. aus Kolonbiopsien, kultivierten peripheren mononukleären Blutzellen, etc.) auf jejunal und / oder Kolon - Maus Afferenzen 21,22. Die Forscher können direkt Stände gelten entweder in das Organ Bad oder in die intraluminale Lösung, die das Darmsegment perfundiert, so dass die unterschiedlichen Wirkungen von serösen gegen Schleimhaut-Anwendung kann auf afferenten Nervenentladung untersucht werden. Als solches war es, dass Kolon-Schleimhaut-Biopsie supernatans von Patienten mit Reizdarmsyndrom gezeigt, Überempfindlichkeit in Maus Kolon Afferenzen, Meerschweinchen submucöse Neuronen und Maus dorsalen Wurzel verursachenGanglionneuronen 21,23,24.

Schließlich wird die neuronale Aktivität der Aufnahme nicht auf die mesenterialen eingeschränkt und / oder Becken Neuronen Innervation des Magen-Darm-Trakt. Andere haben gezeigt, dass Nerven Aufnahmen können in afferents Versorgung des Kniegelenks 25 durchgeführt werden, während andere Blase afferenten Nervenaktivität gekennzeichnet sind und 26-28, und zeigte , dass Becken Afferenzen aus der Blase als auch den Magen - Darm - Trakt zusammenlaufen, was möglicherweise zu neuronalen Übersprechens 29.

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Protokoll

Alle nachfolgend beschriebenen Tierversuche wurden vom Ausschuss für Medizinische Ethik und die Verwendung von Versuchstieren an der Universität Antwerpen (Dateinummer 2012-42) zugelassen.

1. Gewebepräparation von Jejunal und Kolon Afferenzen

  1. Die Herstellung des jejunal afferente
    1. Führen Sie Nagetier Euthanasie des Jugendlichen oder Erwachsenen Nagetier , das von der lokalen Ethikkommission vor dem Experiment genehmigt wurde (z. B. Terminal Sedierung , gefolgt von Herz-Einstich, Genickbruch, etc.).
      HINWEIS: Wir haben Zervikaldislokation die Tiere resultierende für weitere Anästhesie oder postoperative Versorgung ohne die Notwendigkeit , in den Experimenten so zu opfern , als Gewebe weiter in vitro verarbeitet werden.
      HINWEIS: Alter wurde 30 mechanosensorischen Funktionen mesenterialen afferenten gezeigt zu dämpfen, wir raten Forscher daher auf eine bestimmte Altersgruppe anhaften für die Dauer derein einzelnes Experiment.
    2. Legen Sie das geopfert Labortier in Rückenlage und führen Sie eine Bauchmittelschnitt durch die Haut und Bauchmuskelschicht mit einem Skalpell, die sich von dem Xyphoid Prozess bis zum Schambein.
    3. Bathe die Bauchhöhle mit kaltem Krebs - Lösung , um die intra-abdominalen Gewebe vor dem Austrocknen (Krebs Zusammensetzung zu verhindern: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15,43 mM NaHCO3, 1,21 mM MgSO 4, 11.52 mM D-Glucose und 1,52 mM CaCl 2).
    4. Schnell die gesamte Jejunum durch Exzision ca. 20 cm des Dünndarms mit einer scharfen Schere auszuschneiden unmittelbar distal der duodenojejunalis Biegung beginnen, dabei nicht die umgebenden Strukturen zu beschädigen und den Darm des Gekröse zu halten, die jejunal Blutgefäße und afferenten Nerven enthält, intakt.
      HINWEIS: Für die bloße jejunal Dissektion in der Bauchhöhle, muss man nicht verwenden müssenein Stereomikroskop, wie dies kann leicht mit dem bloßen Auge sichtbar gemacht werden.
    5. Legen Sie die ausgeschnittenen Jejunum in eiskaltem Krebs - Lösung und auf Eis halten, während die Krebs Sauerstoffanreicherungslösung kontinuierlich mit Carbogen (95% O 2, 5% CO 2).
    6. Schneiden Sie das Jejunum mit einer scharfen Schere in ca. 3 cm langen Schleifen. Beachten Sie die mesenterialen Bündel die Gefäße und Splanchnicus irgendwo in der Nähe der Mitte der jeweiligen Schleife enthält.
    7. Spülen jedes Segment mit Krebs - Lösung , die einen stumpfen Katheter luminalen Inhalte zu entfernen und Speisebrei da diese Verdauungsenzyme enthalten, die die Verschlechterung der Gewebeprobe in vitro beschleunigt.
      HINWEIS: Achten Sie darauf , dass das Lumen der Schleife zu beschädigen beim Spülen, wie die Zerstörung der Darmzotten in der Freisetzung von Mediatoren führen wird, die die zuführenden Nervenaktivität verändern kann.
    8. Identifizieren Sie das Segment der afferenten Nervenaktivität zu messen (zB die erste jejunal SEGMnt distal des Treitz-Band oder der duodenojejunalis Biegung) und Ort dieser in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer Siliconelastomerschicht beschichtet.
      HINWEIS: Der Anfang des Jejunums anatomisch als Teil des Dünndarms definiert ist, wo das Ligamentum Treitz den Dünndarm durchquert, auch die duodenojejunalis Biegung bezeichnet.
      HINWEIS: Bedecken Sie den Boden der Aufnahmekammer mit einer dünnen Silikonkautschukschicht im Voraus vor Beginn des Experiments. Die Herstellung dieser Elastomerschicht sollte 1 gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.
    9. Perfuse die Kammer ständig mit warmem, carbogenated Krebs-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / min und halten die Temperatur "Krebs in der Aufzeichnungskammer konstant bei 34 ° C.
    10. Montieren Sie das Jejunalsegment im Organbad so, dass die orale Ende mit dem Spritzentreiber verbunden ist die Bereitstellung luminalen Fluss und das aboral Ende verbindet sich mit dem Abfluss. Etwas stwürgen das Segment aber darauf achten, nicht zu viel Spannung auszuüben. Bringen Sie beide fest mit 4/0 Seide Ligatur Enden zu den Ein- und Austrittsöffnungen.
    11. Bringen Sie die Spritze Treiber zur mündlichen Ende, und perfuse das Jejunalsegment intraluminally mit Krebs-Lösung (nicht mit Sauerstoff angereichert, Umgebungstemperatur) mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / h.
    12. Pin das Gekröse des montierten Darm-Segment flach gegen die Silikonelastomer Bodenschicht, unter Verwendung von Insekten Pins. Dehnen Sie den Gekröse aus, um die Visualisierung des mesenterialen Bündel zu optimieren; nicht belasten das Bündel oder Jejunum ausüben.
    13. Eine Testrampen Distension (vide infra) durch den Ausgangsport Schließen bis der intraluminale Druck des intestinalen Segments erreicht 60 mmHg, um zu verifizieren, daß keine intraluminalen Krebs-Lösung aus dem montierten Segment austritt. Beachten Sie einen glatten Anstieg der intraluminale Druck ohne Unterbrechungen.
    14. Beobachten kleine Kontraktionen des Segments (peristaltische wavn) während der anfänglichen Aufblähung Phase. Falls erforderlich, blockieren durch Peristaltik Zugabe von 1 & mgr; M des L-Typ-Calciumkanalblocker Nifedipin zur Lösung Krebs.
      HINWEIS: Durch Hinzufügen 1 uM Atropin auf die Krebs-Lösung neben Nifedipin, das Darmsegment vollständig lahmlegen. Wir haben jedoch keine persönliche Erfahrung mit der Nutzung und Wirkung von Atropin auf afferenten Nerven Aufnahme.
    15. Unter einem Stereomikroskop, beginnen sanft das Fettgewebe aus dem Gekröse durch leichtes Ziehen sie mit zwei kleinen Pinzette zu schälen, dabei nicht die Gefäße und afferenten Nerven zu beschädigen, die im Fettgewebe begraben liegen.
    16. Beginnen Sie an einem entfernten Abstand von dem Jejunum, und setzen beide Blutgefäße im mesenterialen Bündel.
    17. Beachten Sie die zuführenden jejunal Nerv zwischen den beiden Gefäßen als dünner, weißer Faden im Fettgewebe verkapselt. Nur sezieren proximal in Richtung des Jejunum mehr durch sanft das Fettgewebe Ablösen mit einer Pinzette, wenn dieerste Identifizierung der beiden Mesenterialgefäße und / oder der afferenten Nerven ist schwierig.
    18. Präparieren Sie die jejunal mesenteric Nerv des Segments frei über eine Entfernung von mehreren Millimetern, durch das Fettgewebe Anhänger der Nerv zu entfernen.
    19. TRANSECT den Nerv mit einer scharfen Schere Gewebe. Falls erforderlich, ziehen Sie die restliche Fett und Bindegewebe sowie die epineuronal Hülle durch leichtes Ziehen sie mit den kleinen Pinzette ab.
    20. Verwendung eines Mikromanipulators, senken die Spitze der Saugelektrode, verbunden mit einer Spritze mit dem Kolben in das Organbad; Dann wird durch den Plunger Manipulieren sanft einige Krebs - Lösung aus dem Organbad absaugen , so dass die Spitze der Elektrode in der Krebs - Lösung (Figur 1) eingetaucht ist. Stellen Sie sicher, dass die Krebs-Lösung der Drahtelektrode im Inneren der Saugelektrode abdeckt.
      HINWEIS: Vorbereiten des Saug Borsilikatglas kapillaren daß die Drahtelektrode vor dem Start des Experiments enthält using einer Pipette Puller.
    21. Positionieren Sie die Spitze der Saugelektrode unmittelbar neben dem trennt afferenten Nervenstrang und ziehen den durchtrennten Nervenstrang in die Kapillare über seine gesamte Länge.
    22. Manövrieren Sie die Spitze der Elektrode in Richtung einige Fettgewebe und aspirieren diese in die Glaskapillare während fest mit dem Kolben angesaugt, wodurch mechanisch "Versiegelung" der Nerv in der Kapillare von dem Inhalt des Organbad.
    23. Überprüfen Sie die Aufzeichnung von afferenten Nervenaktivität der Datenerfassungssystem, beispielsweise durch eine Rampe Distension-induzierte Zunahme der afferenten Durchführung Abfeuern (vide infra). Nach der Isolierung des Nerven in die Saugelektrode, stabilisieren die Vorbereitung für 15 Minuten, um einen stabilen Zustand spontan afferenten Nervenaktivität zu erhalten, bevor die eigentlichen Experimente durchführen.
    24. Zur Rampe Aufblähung führen, blähen die intestinale Segment durch den Ausgangs-Port zu schließen, was zu gradzelnen Druckanstieg im Darmsegment (bis 60 mmHg). Führen Sie nur die gewünschte Versuchsprotokoll , wenn drei aufeinanderfolgende Rampe Dehnungen (mit einem 15 Minuten - Intervall) ergeben eine reproduzierbare Multi-Unit - Entladung (Abbildung 2).
  2. Vorbereitung der lumbalen splanchnic zuführenden (Kolon afferente)
    HINWEIS: Die Präparation von Kolon afferenten Nerven erfordert eine detaillierte Analyse. Abweichungen von der früheren "jejunal 'Protokoll sind im Folgenden aufgelistet:
    1. Euthanize das Tier durch eine humane Methode, legen Sie sie in Rückenlage, eine Mittellinie Laparotomie durchführen und übermäßig eiskaltem Krebs-Lösung in der Bauchhöhle zu gießen. HINWEIS: Krebs Zusammensetzung: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1,2 mM MgSO 4, 11 mM D-Glucose und 2,5 mM CaCl 2, 3 uM Indomethacin.
      HINWEIS: Beachten Sie die veränderte Zusammensetzung der Krebs-Lösung; Indomethacin ist mit dem so hinzulution, um durch Prostaglandine Veränderungen der afferenten Nervenaktivität zu verhindern.
    2. Entsorgen Sie das Fettgewebe, Blase und inneren Genitalien und sanft den Dünndarm zu einer Seite in der Bauchhöhle verschieben. Führen Sie eine erweiterte prelevation des distalen Teil des Dickdarms mit intakten Mesenterialnerven aus dem Bauch.
      HINWEIS: Wichtige Sehenswürdigkeiten, die in dieser Sektion enthalten sein können, weitere Vorbereitung des Gewebes zu unterstützen gehören die Bauchaorta und Hohlvene, die linke Niere und die Beckenbodenmuskulatur.
      HINWEIS: Während der Präparation darauf achten, dass die Traktion auf dem Verbindungsgewebe zwischen Kolon und der abdominalen Aorta auszuüben, da diese Region die Lenden- splanchnici enthält.
    3. Übertragen Sie das Gewebesegment in das Silikonelastomer Aufnahmekammer ausgekleidet. Verwenden Sie die linke Nierenarterie, die aus der Bauchaorta stammt, als Ausgangspunkt. Folgen Sie der Bauchaorta in aboraler Richtung, stoßen die überlegenen mesenteric Arterie zusammen mit der Zöliakie und mesenterica superior Ganglion. Schließlich kommen an dem Verbindungsgewebe zwischen dem distalen Teil des Kolons und der Aorta, wobei der Nerv von Interesse befindet.
    4. Identifizieren Sie die A. mesenterica inferior aus der Bauchaorta stammen. Die Lenden splanchnic afferente kann an der Basis der A. mesenterica inferior identifiziert werden; sie verläuft parallel zu der Arterie (Abbildung 3).
    5. Nach der Durchtrennung des Nervs, abblättern sanft die umgebende Bindegewebe und necken den Nerv in mehrere feine Fäden. Achten Sie auf einen sicheren Abstand vom Doppelpunkt zu halten.
    6. Zeichnen Sie eine dieser Einzelfäden in die Saugelektrode, "Siegel" die Kapillare mit umliegenden Fettgewebe, wie zuvor beschrieben, und führen Sie die gewünschte Versuchsprotokoll.
    7. Entsorgen Sie alle überflüssigen Gewebe , das in das Organbad vorhanden ist (zB Nieren, Bauchgefäße, Muskelgewebe), eins diese das afferente Signal stören.
      HINWEIS: Nifedipin (1 uM) kann das afferente Signal durch spontane Darmbewegung auf die Krebs-Lösung für den Fall hinzugefügt werden aufgrund der glatten Muskulatur Zellkontraktionen gestört wird.
      HINWEIS: Medikamente können an drei verschiedenen Stellen verabreicht werden: 1) serös durch die gewünschte Verbindung in das Krebs aufzulösen, die die Aufnahmekammer durchströmt, 2) direkt in das Organbad während vorübergehend die Perfusion gestoppt oder 3) intraluminal durch die Verbindung von Interesse Auflösen in die Krebs-Lösung in der Spritze Laufwerk. Desensibilisierung der afferenten Nerven kann auftreten, wenn kumulative Dosierungen einer Verbindung zu verabreicht werden schnell hintereinander.

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Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Zweck gebauten Aufnahmekammer und Saugelektrode detaillierte Übersicht über die techni. cal Aufbau mit der Saugelektrode und der Aufzeichnungskammer statt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Repräsentative Tracing der In - vitro - Aufnahme von Jejunal afferente Aktivität Typische Aufnahme von jejunal Multi-Unit - afferenten Nervenaktivität (imp.sec -1) (oberes Feld) zu Beginn der Studie und als Reaktion auf 2 Rampe Dehnungen bis 60 mmHg. (unteres Bild) und die anschließende Identifizierung (wavemark Analyse) verschiedener Single-Einheiten im Nervensignal (drittes Feld). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Fig . 3: Neuroanatomie des Colon A) sensorischer Information aus dem Dickdarm wird über die Lenden colonic Nerven (LCN) in Richtung auf das Zentralnervensystem transportiert wird , mit der LCN in unmittelbarer Nähe der Arteria mesenterica inferior läuft (IMA). Ein Teil der Fasern aus dieser Lendenwirbel Kolon Nerv wird natürlich entlang der intermesenteric Nerv (IMN), um die Lenden splanchnici (LSN) zu bilden. Die mesenterica inferior ganglion (IMG) am Ursprung der IMA aus der Bauchaorta angeordnet. Distal von der IMG - Aufnahme ist obligatorisch sollten Forscher viscerofugal afferenten Nervenaktivität. B) eine schematische Übersicht der Versuchsaufbau studieren möchten. Afferenten Aufzeichnung des LCN wird in einem Organ sowohl mittels einer Saugelektrode verbunden mit dem Datenerfassungssystem durchgeführt. Rampe Distension kann beim Schließen der Auslaöffnung durchgeführt werden, während das Einströmen von fortKrebs - Lösung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Datenerfassung

  1. Notieren Sie sich die Nervenaktivität über eine Saugelektrode mit einem heads verbunden. Amplify (Verstärkung 10k) und filtern das Signal (Bandpass 500 - 5.000 Hz) 20.
    HINWEIS: A 50/60 Hz Schalldämpfers sollten im Versuchsaufbau einbezogen werden, um Signale zu entfernen, 50/60 Hz elektrische Störgeräusche. Das Signal wird automatisch digitalisiert und bei 20 kHz für die Analyse entnommen.

3. Analyse 5,20

  1. Berichten über die afferenten Nervenentladung als die Gesamtzahl der Impulse / Sekunde für den gesamten Nerven- oder spezielle Software verwenden, um eine weitere Analyse durchzuführen, als mehrgliedrige Aufnahmen Aktivitätsgesamtnervenaktionspotentiale unterschiedlicher Form, Amplitude und Breite enthalten, entsprechend verschiedenen Nerven Einheitenin jedem afferenten Fasern (Abbildung 2).
  2. Wer passt zu einzelnen wavemarks zu vordefinierten Vorlagen, so dass eine Unterscheidung zwischen einzelnen Einheiten. Vor Zuweisung einer Spitze bis zu einem gewissen Wellenzeichen, ein Signal-Rausch-Verhältnis von> 2: 1 sollte erzwungen werden.
    HINWEIS: Während der wavemark Analyse haben wir eine neue Vorlage zu konstruieren, wenn mindestens 10 ähnliche Spitzen durch die Analysesoftware identifiziert werden. Keine Vorlage für Formen seltener als 1 in 50 Spitzen konstruiert. Eine Spitze wird zu einer Vorlage angepaßten Hauptkomponentenanalyse zu verwenden, wenn mindestens 80% der Punkte auf der Schablone Spike identisch sind. Template Matching ist betreiberabhängig und sollte immer von der gleichen Forscher in verblindet durchgeführt werden.
  3. Berechnen der Aktionspotentialantworten durch die spontane Aktivität an der Basislinie subtrahiert wird (intraluminale Druck von 0 mmHg) aus der Reaktion während der Aufblähung zu festen Zeitpunkten (5 mmHg von Inkrement 0-20 mmHg intraluminalen Druck, Inkrementen von 10mmHg von 20 mmHg an). Messen Sie Entladung Basis zuführenden eine bin Größe von 10 Sekunden verwendet wird.
  4. Verwenden Sie die Single-Unit - Analyse zu Fasern klassifizieren basierend auf ihrer Entladeprofil während Rampe Aufblähung (Abbildung 4). Zusätzlich kann Single-Unit-Analyse, um die chemosensitiven Profil verschiedener Arten von Einheiten, da nicht alle Typen von Einheiten zeigt das gleiche veränderte Brenn Aktivität in Reaktion auf ein Arzneimittel oder eine Verbindung zu studieren verwendet werden.
  5. Klassifizieren Fasern als niedrige Schwellenfasern ( "LT", in der Regel auf den unteren Aufblähung Druck erhöht Entladung ausüben), hohe Schwelle Fasern ( "HT", üben erhöhte Entladung auf den höchsten Aufblähung Druck), einen großen Dynamikbereich Fasern ( "WDR", demonstrieren erhöht Brennen während der gesamten Rampe Aufblähung) oder mechanisch unempfindlich zuführenden ( 'MIA', Nervenfasern , die in der Regel nicht reagieren Dehnungen) 5 Rampe; 20.
  6. Express die Nerven Brennen Reaktion bei 20 mmHg als percentage der maximalen Brennverhalten während Aufblähung (LT%), da sie das Ausmaß des Brennens bei niedrigen Aufblähung Druck widerspiegelt.
    HINWEIS: Daher LT Fasern von einem LT%> 55% gekennzeichnet sind, während HT werden durch einen Wert von <15% definiert. Die Werte für die WDR-Einheiten im Bereich zwischen 15 und 55% (20). Ein MIA zeigt spontane zuführenden Brennen, die durch Dehnungen nicht beeinträchtigt wird.

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Abbildung 4:. Schematische Darstellung der verschiedenen Fasereinheiten Afferent auf der Basis ihrer mechanosensitiven Profileinheiten basieren auf dem Prozentsatz (LT%) eingestuft ihrer Feuerrate bei 20 mmHg Druck Dehnung im Vergleich zu der maximalen Brennverhalten während Aufblähung. Niedrigschwellige Fasern (obere linke Tafel) überwiegend eine erhöhte Nervenaktivität bei niedrigen Aufblähung Druck, was zu einem LT% von über 55% an. Hohe Schwelleneinheiten (oben rechtsPanel) im Gegenteil nur eine Erhöhung der Feuerrate bei schädlichen Druck (% LT <15) anzuzeigen. Großer Dynamikbereich Fasern (untere linke Tafel) während der gesamten Aufblähung (% LT im Bereich zwischen 15 und 55), einen allmählichen Anstieg der Nervenaktivität angezeigt werden, während mechanisch unempfindlich Fasern (unteres rechtes Bild) reagieren nicht Aufblähung Druck zu erhöhen. LT%: (zuführenden bei 20 mmHg / maximal zuführenden Brennen Brennen) Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Ergebnisse

Jejunal afferenten Nervenaktivität wurde zu Beginn der Studie gemessen und als Reaktion OF-1-Mäusen Aufblähung in 9 acht Wochen alte männliche Rampe. Die Tiere wurden in Gruppen in standardisierten Bedingungen (6 Tiere pro Käfig, 20-22 ° C, Luftfeuchtigkeit 40 - 50%, 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus) untergebracht ist mit unbegrenzten Zugang Wasser und regulärem Futter zu erschließen. Jejunumsegmenten der Mäuse zeigten unregelmäßige spontane afferente Entladung zu Beginn der Studie bei ein...

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Diskussion

Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt eine reproduzierbare Labortechnik mesenteric afferenten Nervenaktivität bei Nagetieren zu studieren als 3,4,7,8,12,20,21,31 von unserer Gruppe und andere. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls gehören die schnelle Isolierung des Gewebes, das Streben des Nervenstrang in die Saugelektrode und die angemessene "Versiegelung" der Glaskapillare aus dem Organbad durch umgebende Fettgewebe in die Kapillare abgesaugt. Die Öffnung der Glaskapillare sollte gena...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

SN führte die oben beschriebenen Experimente durch, führte die Datenanalyse durch und verfasste das Manuskript. AD und JDM implementierten die Technik in unseren Forschungseinrichtungen und halfen bei der Datenanalyse. HC half bei der Durchführung der Experimente. WJ, CK und DG halfen bei der Implementierung der afferenten Messtechnik in unserem Labor, der Datenanalyse und der Interpretation der Ergebnisse. SF, JDM und BDW haben die Studie konzipiert. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript kritisch gelesen und genehmigt. SN ist Aspirant des Fonds für wissenschaftliche Forschung (FWO), Flandern (11G7415N). Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der FWO (G028615N und G034113N).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Natriumchlorid (NaCl)VWR Chemicals27.810.295Verbindung Krebs Lösung
Kaliumchlorid (KCl)Acros Organics196770010Verbindung Krebs Lösung
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)VWR Chemicals1.063.461.000Verbindung Krebs Lösung
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Merck1.063.291.000Verbindung Krebs Lösung
Magnesiumsulfat (MgSO4)Merck1.058.861.000Verbindung Krebs Lösung
Calciumchlorid (CaCl2)Merck23.811.000Verbindung Krebs Lösung
D-GlukoseVWR Chemicals1011175PVerbindung Krebs Lösung
DestillierteWasserverbindung Krebslösung
PVC-SchläucheWissenschaftlicher LaborbedarfDas Darmsegment sollte über PVC-Schläuchen montiert werden
SilikonschläucheWissenschaftlicher LaborbedarfDer Rest des Schlauchs, idealerweise auf Silikonbasis - leichteres Entfernen von Schmutz im Schlauch
SeidenfadenPearsall Limited10B15S220Befestigung des Segments über dem PVC-Schlauch
SpritzentreiberHarvard Apparatus55-2222Intraluminale Infusion von Krebs
Binokular - inkl. 10-facher Vergrößerung im OculairZeiss STEMI 2000Optimale Visualisierung für die Dissektion des Nervus afferentus
Hoötherme Decke SteuereinheitHarvard Apparat507214Erwärmung der Organkammer
Maßgeschneidertes Organbad mit Sylgard überzogenem Boden
Spike2 SoftwareAufzeichnung und Analyse der Daten
Insektenstifte, 500 Stück, Edelstahl, Durchmesser 0,2 mmAusterlitz Insektenstifte minutiensPräparierung des Nervus afferentus
Pinzette Dumont #5 Inox 11 cmWorld Precision Instrument500341Dissektion des Nervus
afferentusSchere, Feder, 14 cmWorld Precision Instrument15905Dissektion des afferenten Nervs
DB digitimer NL 108T2/10Druckmessumformer
MikromanipulatorNarishigeM-33333D-Manipulation der Saugelektrode
MikromanipulatorX-4 rotierender Block3D-Manipulation der Saugelektrode
MikromanipulatorGJ-8 magnetischer Ständer3D-Manipulation der Saugelektrode
LightSourceEuromex Mikroskope Holland EK-1Optimale Visualisierung für die Dissektion des Nervus afferent
CED 1401 AufzeichnungsapparatAufzeichnung der Aktivität des Nervus afferent
Humbug 50/60 Hz Noise EliminatorQuest Scientific InstrumentsEliminierung von Hintergrundgeräuschen
InfusionspumpeGibson Minipuls 2Infusion der Organkammer, in der das Segment montiert ist
Mikroelektrodenhalter Halbzellen 1,5 mmWorld Precision InstrumentMEH2SWSaugelektrode zur Isolierung der afferenten Faser
Borosilikatglas Kapillaren, 300 Stück; 1,5/0,84 OD/IDWorld Precision Instrument1B150-4Kapillare zur Isolierung des Nervus afferent

Referenzen

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