Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Zusammenfassung

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Zusammenfassung

Das Kennzeichen der humoralen Immunität ist funktional ASCs zu erzeugen, das zu synthetisieren und ABS spezifisch für ein Antigen (Ag), beispielsweise einem Pathogen sekretieren, und sind für Wirtsabwehr eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung des funktionellen Status der humoralen Immunantwort eines Individuums, sowohl Serum Abs und Zirkulieren ASCs als funktionelle Auslesungen üblicherweise gemessen. Beim Menschen ist peripherem Blut die bequemste und leicht zugänglich Probe, die zur Bestimmung der humoralen Immunantwort durch den Host B-Zellen hervorgerufen werden können. Distinct B-Zell-Untergruppen, einschließlich ASCS, kann über die Auswahl mit linienspezifischen Ab-konjugierte Mikrobeads oder über Zellsortierung mit Durchflusszytometrie direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden. Darüber hinaus kann gereinigtes naiven und Gedächtnis-B-Zellen in Kultur in ASCs aktiviert und differenziert werden. Die funktionellen Aktivitäten von ASCs zu Ab Sekretion beitragen kann durch ELISpot quantifiziert werden, was ein Assay, Enzym konvergiert ist-linked immunoabsorbance-Assay (ELISA) und Western-Blot-Technologien, um die Aufzählung einzelner ASCS auf Einzelzellebene zu ermöglichen. In der Praxis hat sich die ELISPOT-Tests zunehmend verwendet Impfstoffwirksamkeit zu bewerten, wegen der Leichtigkeit der Handhabung einer großen Anzahl von Blutproben. Die Verfahren zur Isolierung von humanen B - Zellen aus dem peripheren Blut, die Differenzierung von B - Zellen in ASCs in vitro und die Verwendung von ELISpot für die Quantifizierung von Gesamt - IgM- und IgG-ASCs wird hier beschrieben.

Einleitung

B-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der humoralen Immunität. Sie entwickeln sich zunächst im Knochenmark und geben Sie den Blutstrom als naive B-Zellen, die in die lymphatischen Geweben, wie der Milz wandern können, Lymphknoten und Mandeln, für die weitere Entwicklung. Bei Ag Begegnung einige naive B-Zellen wandern in Lymphfollikeln, wo Keimzentrum-B-Zellen in den Speicher B-Zellen und Plasmablasten unterscheiden können (PBS) / Plasmazellen (PCs). Während die meisten PBs / PCs in den Blutstrom Egress, liegen einige schließlich im Knochenmark terminale Differenzierung in langlebigen PCs ¹ zu unterziehen. B - Zellen im Umlauf sind heterogen, und in einem stabilen Zustand, PBs / PCs sind selten im peripheren Blut ^2. Als Folge der Verfügbarkeit von Lineage-spezifische Oberflächenmarker hat Durchflusszytometrie eine beliebte Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der B-Zell-Untergruppen in peripherem Blut werden. Eine erweiterte Anwendung von Fluss cytometry ist die Zugabe eines Zellsortierer-Funktion, die die Trennung und Isolation der einzelnen Untergruppen von B-Zellen mit hoher Reinheit ermöglicht. Basierend auf der Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Entwicklungsstadien werden menschliche zirkulierende B - Zellen allgemein in drei Haupt Subpopulationen: naive B - Zellen (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-) und PBs / PCs (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Abbildung 1). Naive B-Zellen von Natur haben Ags nicht auf. Jedoch können sie differenziert IgM ⁺ CD27 ⁺ Gedächtnis - B - Zellen sein. Obwohl naive B - Zellen sind homogene B-Zell - Antigenrezeptor (BCR) -assoziierten Moleküle (zB CD19, CD20 und CD22) sie heterogen in ihrer Immunoglobulin Repertoire in ⁵ ausdrückt. Die Mehrheit der CD27 ⁺ Gedächtnis - B - Zellen können in CD27 unterschieden werden+ / hallo CD38 ⁺ PBs / PCs ^6. Darüber hinaus Gedächtnis - B - Zellen und PBs / PCs sind polyklonalen und zeigen Entwicklungs und funktionelle Heterogenität ^4-7. PBs / PCs im Umlauf sind in der Regel von kurzer Dauer und nicht CD138 Ausdruck bringen, sondern solche aus im Knochenmark zu beruhigen wird terminal differenzieren und werden langlebig. Ausdifferenzierten PCs exprimieren CD138 und CD27 - Moleküle auf ihren Oberflächen ⁸ herunterregulieren. Da sowohl PBs und PCs geeignet sind, sezer Abs, in vielen Fällen sind sie gemeinsam als ASCS bezeichnet. Im Gegensatz dazu weder naive B - Zellen noch Gedächtnis - B - Zellen können erhebliche Mengen an Abs ^9-10 produzieren. Dennoch, als isoliert, sowohl naiven und Gedächtnis - B - Zellen können in 3 in ASCS differenziert - 10 Tage , an denen ⁶ in der richtigen Kulturbedingungen ^{gelegt, 15.11.} In der Tat, abgeleitet ASCS von in vitro Differenzierung teilen ähnliche Oberfläche Ausdrücke von CD27 und CD38 mit denen direkt isoliert from peripheren Blut ^6. Darüber hinaus unterscheiden sich die ASCs in vitro eine geringe Oberflächen CD20, ähnlich dem von zirkulierendem PBs / PCs ⁶ auszudrücken. Obwohl die Kultur stamm ASCs alle kurzlebigen sind, können sie Abs sezernieren, was anzeigt, dass sie funktionell kompetent sind und in der Lage der humoralen Immunität beitragen.

Beide ELISA und ELISpot sind bei weitem die am häufigsten angewandten Methoden, mit denen auf die humorale Immunantwort funktionelle Informationen zu erhalten. ELISA ist ein 96-Well - Platte-basierten Assays, und es ist häufig der Titer des Serums Ag-spezifischen Abs und anderen Analyten (zB Cytokine) zu messen. Es ist bequem und skalierbar. ELISA ist ein Festphasen Enzym - Assay zu verwenden , ¹⁶ das Vorhandensein von Abs oder anderen Substanzen, wie Serum, in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Die Auslesungen aus Serum ELISAs wurden, um die Immunantwort des Körpers darzustellen weit verbreitet. Ein Werkzeug erforderlich für den Erwerb von Readouts von ELISA-Assays ist ein spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesegerät. Der Leser kann die optische Dichte (OD) der Endprodukte typischerweise bestimmen , aus der Reaktion von Meerrettich - Peroxidase (HRP) -konjugierte Detektions Abs und ihre spezifischen Substrate resultierenden ^17. Hinsichtlich der humoralen Immunantwort auf die Berichterstattung, Serum Ab Ebenen durch ELISA bestimmt bezeichnen die kollektive, nicht aber einzelne, Leistung von ASCS im Körper. Außerdem versagt ELISA berücksichtigt die Beteiligung von Gedächtnis-B-Zellen, die sekretieren Abs nicht.

Wie ELISA ist ELISpot ein weit verbreitetes Verfahren zum Nachweis und der Überwachung der Immunantwort in peripheren Blutproben ^17-18. ELISpot ist eine Technik, um einen Sandwich-ELISA bezogen. Darin werden die Zellen in das Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran-backed Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten gegeben für eine Kurzzeitkultur. Der ELISPOT-Assay ist analog zur Durchführung Western-Blotting auf einer Mikrotiterplatte und developing die Flecken auf der PVDF-Membran in jeder Vertiefung. Ein automatisiertes ELISpot Lesesystem oder ein Stereomikroskop für die manuelle Zählung ist nicht erforderlich. Der Hauptvorteil der ELISpot in einer Immunantwort Erfassungs ist seine hervorragende Empfindlichkeit in der Quantifizierung von ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen. Er berichtet ihre funktionellen Aktivitäten in humoralen und zellulären Immunität sind. Bei der Messung der humoralen Immunfunktion, Serum Ab durch ELISA und der Anzahl von ASCs bestimmt Ebenen durch ELISpot aufgezählt werden oft korreliert, aber die Daten Ablesungen aus diesen beiden Assays haben einige Unterschiede in der funktionellen Auswirkungen ^19-20. Der Hauptvorteil der ELISpot ist die Empfindlichkeit der Methode. Die Höhe des Serum-Ab-Titer, wie durch ELISA berichtet wird, semi-quantitativ als OD Ablesungen dargestellt, um die relative Ab Ebene bezeichnet, oder mehr quantitativ, als Konzentration Ablesungen, wenn eine bekannte Menge an den richtigen Isoformen der ABS ist als Referenz enthalten. Im Gegensatz dazu sind die Ergebnisse der ELISpot presented als die absolute Zahl der Anbeterinnen in einem Zellpool von Interesse (zB unfraktioniertem einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) und gereinigte B - Zellen aus PBMCs). ELISpot können einen einzelnen ASC erkennen, aber ELISA erfordert Ab Mengen von ASCS optimierten Assay abhängigen Konzentrationen vor der Messung zu erreichen. Daher ELISpot ist offensichtlich überlegen ELISA in Empfindlichkeit der Quantifizierung. Außerdem ist ELISpot auch für die in vitro differenzierte ASCs von aktivierten Gedächtnis - B - Zellen zu quantifizieren. Gedächtnis-B-Zellen sezernieren Abs nicht aber in ASCS bei Aktivierung unterscheiden kann; Sie haben daher keinen Beitrag zum Serum durch ELISA nachgewiesen Abs. Somit ist ELISpot die Methode der Wahl bei der Messung der Immunantwort des Speichers B-Zellen nach der Aktivierung in Kultur zirkuliert. Es ermöglicht die Überwachung der Aufrechterhaltung der Langzeit humorale Immunität.

Protokoll

Menschliche periphere Blut muss von gesunden Spendern unter informierte Einwilligung eingeholt werden, und die Verwendung von Blutproben müssen den genehmigten Leitlinien, die einzelnen Institutional Review Boards entsprechen. In dieser Studie auf das Protokoll menschlichem Blut an einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISPOT - Tests verwenden (Abbildung 3) wurde durch den Internal Review Board der National Taiwan University Hospital (Protokollnummer 201307019RINB) zugelassen.

1. Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

1. Zeichnen ~ 10 ml Blut aus dem Median Cubitalvene (in der Ellenbeuge anterior zum Ellenbogen) in einen 15-ml - Röhrchen mit K ₂ EDTA (1,5 bis 2,0 mg / ml Blut) und sofort wird das Röhrchen mehrere Male Gerinnsel zu verhindern Bildung.
2. 35 ml autoklavierten (121 ° C, 15 min) von roten Blutzellen (RBC) Lyse - Puffer (150 mM NH ₄ Cl, 10 mM KHCO _3, und 1 mM EDTA; pH 7,4) an dem Rohr die frische Blutprobe (≥ 3: 1 enthält, vol / vol) und Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für nicht mehr als 5 min.
   HINWEIS: Das Aussehen der Lichtdurchlässigkeit durch das Rohr zeigt die Beendigung der RBC-Lyse.
3. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet in der Farbe weiß ist.
4. Das Pellet mit 10 ml autoklavierten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na ₂ HPO ₄ und 1,47 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) und zentrifugiert wie in Schritt 1.3.
5. Überstand verwerfen, das Pellet mit 10 ml RPMI 1640-Medium (ergänzt: 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 0,25 ug / ml Amphotericin B, und 2 mM L-Glutamin), und die dann die Platte Zellen in einer 10 cm Kulturschale (10 ml Blut pro Schale). Die Schale in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ für 30 min.
6. wirbeln Sie leicht die Kulturschale ein paar Mal und legen Sie dieKulturmedium (Suspensionszellen) in 15-ml-Kunststoff konische Röhrchen. Entsorgen Sie die anhaftenden Zellen (meist Makrophagen) auf den Kulturschalen.
7. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen.
8. Das Pellet mit 1 ml RPMI-1640-Medium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der isolierten Leukozyten beträgt normalerweise mehr als 90% durch Trypanblau-Ausschluss.
9. Zentrifuge wie in Schritt 1.7 und Resuspendieren der Zellen in ~ 200 & mgr; l kaltem PBS - Puffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von von 5 bis 10 x 10 ⁶ Zellen / mL.
10. Werden 5 & mgr; l von biotinyliertem anti-humanem AB - Cocktail spezifischen Blutzellen (für die negative Selektion von B - Zellen) pro 10 ⁶ Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min ^21.
    HINWEIS: Die Anti-Human-Ab-Cocktail sollte zumindest Abs spezifisch für CD2 (oder CD3), CD14 und CD16 umfassen.
11. Fügen Sie einen 10-fachen Überschuss Volumensteriler PBS zu den Zellen, Zentrifuge bei 600 × g für 5 min und der Überstand verworfen.
12. In gleichen Mengen an Streptavidin-konjugierten Microbeads (5 & mgr; l pro 10 ⁶ Zellen) zu dem Pellet und gründlich mischen.
13. Inkubieren auf Eis für 30 min in einem 15 ml konischen Kunststoffrohr.
14. 2 mL PBS-Puffer in das Rohr.
15. Das Röhrchen wird in einem Magnetfuß und Inkubation bei RT für 8 min. Die braunen Microbeads allmählich neben dem Magneten ²² an der Rohrwand befestigen.
16. Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer verbleiben, übertragen sorgfältig den Überstand in ein neues steriles 15-ml - Röhrchen ^22.
17. Wiederholen Sie die Schritte 1,14-1,16, und verbinden die beiden Überstände, die die unberührte B-Zellen enthalten. Entsorgen Sie die Mikrokügelchen.
18. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen.
19. Das Pellet in RPMI 1640-Medium für Downstream-Experimenten.
    HINWEIS: In der Regel, 1 - 5 x 10 ⁵ B - Zellen witha Reinheit von mehr als 95% von 10 ml peripherem Blut ²³ isoliert werden.

2. Reinigung und Trennung von Speicher- und Naïve B-Zellen aus B-Zellen isoliert

1. Verwenden gereinigten Zellen aus Schritt 1 und bestimmen die Zellzahl einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler verwendet wird.
2. Resuspendieren der Zellen in 100 & mgr; l kaltem PBS-Puffer nach der Zentrifugation bei 600 xg und RT für 5 min.
3. Hinzufügen von 1 bis 2 & mgr; g biotinyliertem CD27 mAb pro 10 ⁶ Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min.
4. 10 ml PBS-Puffer in das Röhrchen und Zentrifugieren bei 600 xg für 5 min.
5. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 50 & mgr; l PBS-Puffer.
6. Hinzufügen gleiche Mengen von Streptavidin magnetische Microbeads (1 - 2 & mgr; g / 10 ⁶ Zellen) zu den Zellen in einem 15-ml - Kunststoff - konisches Rohr.
7. Vorsichtig mischen gut und Inkubation auf Eis für 30 min.
8. Hinzufügen von 2 bis 3 ml PBS-Puffer in das Röhrchen.
9. Setze dasRohr in einen magnetischen Ständer und für 8 Minuten bei RT inkubieren, die braunen Microbeads zu ermöglichen an der Seite am nächsten zu dem Magneten zu befestigen.
10. Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer übertragen sorgfältig den Überstand-Fraktion in ein neues steriles Röhrchen. Diese Fraktion enthält die angereicherten CD27 ^- naiven B - Zellen.
11. Wird in 5 ml der Röhre die Mikrokügelchen enthält , und resuspendieren sanft die Mikrokügelchen (dh der angereicherten Fraktion von CD27 ⁺ Gedächtnis - B - Zellen) , ^24-25.
12. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Resuspendieren der Pellets mit RPMI 1640-Medium für die Downstream-Experimenten.
    HINWEIS: In der Regel ~ 30 - gereinigt werden können , 60% der B - Zellen als CD27 ⁺ Speicherzellen von den PBMCs eines gesunden Spenders ^{7, 25-26.}

3. Zellsortierung für die Sammlung von Naïve B Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und PBs / PCs

1. Unter Verwendung der aus Schritt gereinigten Zellen 1, bestimmen die Zellzahl eine hemocytome mitter oder eine automatische Zellzähler.
2. Resuspendieren der Zellen in kaltem PBS - Puffer bei einer Konzentration von 10 ⁷ pro ml in einem 5 ml - Polystyrolröhrchen.
3. Merken 1 - 2 ug Human - IgG pro 10 ⁶ Zellen und Inkubation auf Eis für 10 min für den Block Fc.
4. 1 & mgr; g jedes der Anti-CD19-APC (Klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (Klon: O323) und Anti-CD38-PE (Klon: HIT2) pro 10 ⁶ Zellen; gut mischen und Inkubation auf Eis für 30 min ^{4, 27.}
5. In den letzten 5 Minuten in Schritt 3.4, fügen Sie 5 ul der kommerziellen 7-Aminoactinomycin D (7-AAD).
6. 2 mL PBS zu dem Rohr, vortex und Zentrifuge bei 600 × g für 5 min.
7. Resuspendieren der Zellen in Sortierpuffer (steriles PBS mit 2% BSA und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von 1 bis 5 x 10 ⁷ Zellen pro ml in einem Rohr 15 mL.
8. Filtern Sie die Zellen durch eine Nylon-Mesh-Zelle Sieb (40 & mgr; m Porengröße) Zellklumpen zu beseitigen.
9. Trennen der Zellen mit einer durchflusszytometrischen sorter ausgestattet mit drei Laser: violett (405 nm), Blau (488 nm) und Rot (640 nm).
   HINWEIS: Der blaue Laser allein reicht für 3-Farben - ^27-28 Durchflusszytometrie.
10. Sortieren Sie die Zellen in drei 15-ml - Röhrchen für die gleichzeitige Sammlung von naiven B - Zellen (CD19 ⁺ CD27 ^-) (5 ml RPMI - Medium enthält), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 ⁺ CD27 ⁺⁾ und PBs / PCs (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / hallo} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    HINWEIS: Sortieren naiven und Gedächtnis-B-Zellen können kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

4. In vitro Differenzierung von isolierten humanen CD19 ⁺ B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen CD19 ⁺ CD27 ⁺ und CD19 ⁺ CD27 ^- Naïve B - Zellen

1. Unter Verwendung der gereinigten Zellen in den Schritten 1.19, 2.10, 2.11 und 3.10, bestimmen die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder eine automatische Zellzähler.
2. Resuspendieren der Zellen mit RPMI 1640-Medium,bei einer Konzentration von 1 - 10 x 10 ⁵ pro mL und sie in die Vertiefungen einer 12-Well - Platte aliquotiert.
3. Hinzufügen CpG (ODN 2006) bei 5 & mgr; g / 10 ⁶ Zellen / mL ^{18, 29.}
4. Kultur der Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ für 5 Tage.
5. Ernten Sie die Zellen aus jeder Vertiefung, legen Sie sie getrennt in 15-ml-Röhrchen, 5 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren bei 600 xg und RT für 5 min.
6. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler. Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1 - 10 x 10 ⁵ pro ml mit RPMI - 1640 - Medium.

5. ELISPOT-Assay

1. Zugabe von 30 & mgr; l 35% Ethanol in destilliertem Wasser zu jeder Vertiefung der ELISpot-Platten für 30 s.
   HINWEIS: Beim Pipettieren vermeiden jederzeit in den Vertiefungen der Membran zu berühren.
2. Invert ELISPOT Platten um das Ethanol zu entfernen.
3. Setzen Sie 150 ul autoklaviert ddH ₂ O in jede Vertiefung und inkubierensie bei RT für 5 min zu spülen Sie das restliche Ethanol aus; 3 min mit einer Wasch von sterilem PBS bei RT folgen.
   HINWEIS: Die Schritte 5.1 bis 5.3 optional sein können, abhängig von der Herstellung der Platten.
4. Stellen 50 ul von 5 ug / ml polyklonalen F (ab ') ₂ - Fragment von anti-human - Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in jede Vertiefung der ELISpot Platten und Inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder 37 & deg ; C für 2 h ^11.
   HINWEIS: Seal die Ränder der Platten mit Parafilm bis zur Verwendung.
5. Kehren Sie die Platten nicht gebundenen Abs zu entfernen, 200 & mgr; l PBS in jede Vertiefung und inkubieren sie zweimal bei RT für 3 Minuten jedes Mal.
6. Mit 200 ul PBS mit 5% BSA (oder RPMI 1640-Medium) zu jeder Vertiefung für die Blockierung und inkubieren bei RT für 2 h.
7. Kehren Sie die Platten, die die Blockierungspuffer zu entfernen. Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5.
8. Füge 100 & mgr; l RPMI 1640-Medium in jede Vertiefung und Inkubieren sie bei 37 ° C.
9. Wenn Sie bereit sind, die Zellen auf Seed-, invertieren die Platten das RPMI 1640-Medium zu entfernen.
10. Seed 100 ul (5 · 10 & ^sup4 ; ), 50 & mgr; l (2,5 x 10 & ^sup4 ; ) und 25 ul (1,25 x 10 ⁴⁾ der Zellen (von den Schritten 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 und 4,6) in die Vertiefungen einer ELISpot Platte. Mit RPMI 1640-Medium, bringen das Volumen auf 150 & mgr; l / Vertiefung.
    HINWEIS: Ein Minimum von einer oder zwei 2-fache serielle Verdünnungen für die Zellen Plattieren wird empfohlen.
11. Inkubiere die Platten in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ für 8-14 h ^18. Vermeiden Sie die Platten während der Inkubation zu bewegen.
12. Kehren Sie die Platten, die die Zellen und RPMI-1640-Medium zu entfernen.
13. Mit 200 & mgr; l / Vertiefung PBS-T (PBS mit 0,05% Tween 20) und inkubieren sie 5 mal bei RT, jeweils für 3 min. Die Platte umdrehen den Waschpuffer zwischen jedem der 5 Wäschen zu entfernen.
14. Fügen entweder Ziege-anti-human-IgG-alkalische Phosphatase (AP), Fcy-spezifischen Abs (für IgG-Nachweis, 1: 5.000 in PBS-T) Oder Ziege-anti-human IgM-AP, Fcμ fragmentspezifische Abs (für IgM-Erkennung, 1: 5.000 in PBS-T) in die vorgesehenen Vertiefungen und für 2 h im Dunkeln bei RT inkubieren.
15. Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5.
16. In 50 ul / Vertiefung Bromchlorindolylphosphat-Nitro-Blau-Tetrazolium (BCIP / NBT) Substratlösung. Lilafarbener Flecken erscheinen normalerweise in 5 bis 15 min.
17. Füge 100 & mgr; l / Vertiefung von ddH ₂ O , um die übermäßige Entwicklung von Flecken zu verhindern.
18. Spülen Sie die Platten mit fließendem Leitungswasser nach der vollständigen Entwicklung aller Flecken.
19. Entfernen Sie die unterirdische Entwässerungs der Platten und lassen sie in der Dunkelheit an der Luft trocknen.
20. Zählen Sie die Flecken mit einem automatischen Plattenlesegerät mit einer Bildaufnahme / Analyseeinheit (zB ein automatischer Scanner oder manuell über ein Binokular).
    HINWEIS: Die Platten können später bei RT im Dunkeln und analysiert gespeichert werden.

Ergebnisse

PBMCs wurden von roten Blutkörperchen und anhaftenden Zellen verarmt (Schritte 1,2 bis 1,7). Ein Aliquot (2 x 10 ⁶⁾ Zellen wurden zu einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen , um die Populationen von naiven B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen und PBS / PCs in dem peripheren Blut (Abbildung 1) veranschaulichen. In diesem PBMCs des Spenders, etwa 10% der Lymphozyten waren CD19 ⁺ B - Zellen. In der B-Zellenraum ist der Anteil der CD19 ⁺

Diskussion

Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

Normalerweise können RBCs effizient durch Lysepuffer (Schritt 1.2) gebrochen und gelöscht werden. Es ist wichtig, nicht die PBMCs mit dem RBC-Lyse-Puffer länger als 5 min inkubieren, da die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch das Ammoniumchlorid beeinflußt werden. Alternativ kann RBCs und Blutplättchen gleichzeitig durch das folgende Protokoll entfernt werden.

Mischen frisches Vollblut mit Säure-Citrat-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL Röhrchen
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxinfrei
Trypanblau 0,5%ige Lösung	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B Lymphozytenanreicherungsset	BD Biosciences	558007
biotinyliertes CD27 mAb	Biolegend	302804	Klon O323
Streptavidin magnetische Mikrokügelchen	BD Biosciences	9000810
15 mL Falcon Röhrchen	BD Falcon	352196
Blaues Nylon-Mesh-Zellsieb, 40 & mu; m	BD Falcon	352340
Anti-Human-CD19-APC	Biolegend		302212-Klon HIB19
Anti-Human-CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	Klon O323
Anti-Human-CD38-PE-Cy7	Biolegend		303516-Klon HIT2
Anti-Human-CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	Klon HIT2
Anti-Human-CD45-FITC	Biolegend		304006-Klon HI30
Anti-Human-CD45-FITC	BD Biosciences	555482-Klon HI30
Anti-Maus/Ratte/Mensch CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend		124213-Klon LG.3A10
Anti-Human-CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	Klon L128
Anti-Human-CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	Klon LT19
Anti-humaner CD19-FITC	GeneTex		GTX75599-Klon LT19
Anti-humaner CD20-FITC	BD Biosciences	555622	Klon 2H7
biotinyliertes anti-humanes CD27	Biolegend	302804	Klon O323
biotinyliertes anti-humanes CD27	eBioscience	13-0279-80	Klon O323
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	Typ B CpG
Rekombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Rekombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Rekombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Rekombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A von S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed Mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen Filterplatten, 0,45 µ Mio. Porengröße	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, klare 96-Well-Filterplatte mit hydrophober PVDF-Membran
BCIP/NBT-Lösung	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT Einzelreagenz, alkalisches Phosphatase-Substrat	Merck Millipore	ES006
Humanes IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Humanes IgG, Fc-Fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 Fragment von Ziegen-Anti-Human-Ig (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Anti-Human-IgG-Phosphatase gegen Ziegen, Fc&gamma-Fragment-spezifisch	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Ziegen-Anti-Human-IgM-alkalische Phosphatase, Fcµ fragmentspezifisch	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
Ziegen-IgG-Peroxidase, Fc&gamma-Fragment-spezifisch	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Ziegen-Anti-Human-IgM-Peroxidase, Fc&Mikro; fragmentspezifisch	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC-Substrat-Kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot-Analysator	C.T.L.