Introduction
Esporulação na levedura de brotamento foi estudado para fornecer insights sobre muitos aspectos da biologia, incluindo o controle da segregação cromossômica durante a meiose 1, os mecanismos de recombinação genética 2, o controle do desenvolvimento de sinalização celular 3, controle nutricional do desenvolvimento 4, a transcrição regulação do desenvolvimento 5, eo exame de formação de esporos 6. A formação de esporos inclui um evento de divisão celular romance que envolve a formação de novos compartimentos membranares dentro da célula mãe, seguido pela deposição de uma parede de esporos 6 protectora. Estes estudos que examinam as células esporuladas muitas vezes tirar proveito da estirpe de levedura rapidamente esporulantes SK1, que pode sofrer o processo de esporulação em cerca de 24 horas de um modo relativamente eficiente 7,8. Embora a optimização das condições de esporulação de brotamento de levedura foram descritas 9-13, estes experimentos examinados esporulação em meios sólidos ou em culturas líquidas de maior escala, onde a esporulação é efectuada utilizando tubos de cultura ou frascos.
Descrevemos aqui um método para a esporulação de levedura num formato de placa de poços múltiplos 96. Nós achamos que para este método, aeração é crítica para a esporulação síncrona e eficiente, e desenvolveram técnicas para garantir a esporulação suficiente um formato com vários poços de pequeno volume. Esporulantes num formato de 96 placa de poços múltiplos permite a células a ser rastreada utilizando técnicas de alto rendimento e reagentes optimizados para um formato de placa de poços múltiplos, tais rastreio de supressores elevado de cópias usando uma biblioteca de azulejos 14-16.
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Protocol
1. Preparação para a esporulação
Nota:. Os meios de comunicação descritos neste protocolo são feitas usando receitas e métodos padrão 13,17 Tabela 1 dá a formulação para 1 L de vários meios de comunicação utilizados neste protocolo.
| Bacto Peptona | Extracto de levedura | Bacto Agar | Dextrose | acetato de potássio | glicerina | ddH2O | |
| placas YPG | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| placas de YPD | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| líquido YPD | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| líquido YPA | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1.000 ml |
| meios de esporulação | - | - | - | - | 10 g | - | 1.000 ml |
Tabela 1:. Formulações de mídia Valores são dadas por 1 L de mídia. Detalhes sobre a mídiaingredientes pode ser encontrada na Tabela Materiais.
- Se todas as células esporulação será o mesmo genótipo, siga este procedimento:
- Thaw cepa de levedura para ser usado em um (YPGlycerol) placa YPG. Cresça levedura durante 12-16 h a 30 ° C. Importante, as células SK1 também estão prestes a esporular, de modo estirpes SK1 não deve ser deixado muito tempo em placas de YPG, ou eles podem esporular na placa.
Nota: Uma estirpe recentemente descongelado cultivadas em YPG é preferido, como a utilização de glicerol como fonte de carbono requer a fosforilação oxidativa, e assim selecciona para células que têm o DNA mitocondrial funcional. células SK1 têm uma tendência a perder DNA mitocondrial funcional e tornar-se petites. DNA mitocondrial funcional é necessário para a esporulação. - levedura Streak da placa YPG para um (YPDextrose) placa YPD para as colónias individuais. Cresça levedura na placa de YPD 24-28 h a 30 ° C.
- Após cerca de 36-48 horas de crescimento em YPD meios sólidos, começar uma cultura de 25 ml YPD usando uma única colôniaa partir da placa de YPD. Crescer esta cultura até que as células são cerca de OD 600 = 4,0 a 7,0. Executar este passo, a 30 ° C durante a noite num incubador com agitação, agitação a 220 rpm.
- A partir da cultura de YPD, usar uma quantidade apropriada de células para iniciar a 1.000 ml de cultura YPA (YPAcetate) que é OD 600 = 0,1 para cada necessidade placa de 96 poços na Secção 2. levedura crescer num incubador com agitação a 30 ° C (agitação a 220 rpm) até a cultura DO600 é entre 1,3 a 1,5.
Nota: inocular 100 mL de cultura YPA para cada placa de poços múltiplos 96 a ser blindado, no capítulo 2. Por exemplo, se quatro rastreio de 96 placas com múltiplas cavidades, serão necessários 400 ml de cultura YPA. Começando com 10% de volume adicional na cultura YPA é necessário para proteger contra a perda de volume por evaporação. Normalmente, vai demorar entre 12-16 horas para as células a alcançar o OD apropriado 600; a quantidade de tempo pode variar dependendo do genótipo da estirpe de levedura. YPA é a mídia presporulation. Pregrowthem acetato ajuda a induzir a expressão de genes (tais como IME1) necessário para a esporulação eficiente e síncrona 6. - Centrifugação a 1800 x g numa centrífuga de topo de mesa durante 5 min para sedimentar as células cultivadas em YPA. Lavar as células 1x com 0,5 volumes de água desionizada autoclavada estéril. Girar novamente, e descartar lavar. Ressuspender as células em meios volume de esporulação 1x. Continue a Seção 2.
- Thaw cepa de levedura para ser usado em um (YPGlycerol) placa YPG. Cresça levedura durante 12-16 h a 30 ° C. Importante, as células SK1 também estão prestes a esporular, de modo estirpes SK1 não deve ser deixado muito tempo em placas de YPG, ou eles podem esporular na placa.
- Se usando células para a esporulação que são de diferentes genótipos, (isto é, transformadas com diferentes plasmídeos contendo mutações ou diferentes, tipicamente obtidas e armazenadas como reservas congeladas), as células da matriz dos diferentes genótipos em um formato de poços múltiplos 96. Então, siga este procedimento:
- Use um estéril frogger 96 pinos para transferir células de stocks congelados descongelados em 96 placa com múltiplas cavidades (s) em YPG meios sólidos. Levedura crescer durante a noite a 30 ° C.
- Usando um estéril frogger 96 pinos, transferir células de YPG meios sólidos em YPD meios sólidos ou seletivameios sólidos (isto é, meio mínimo sintético sem aminoácidos, se as células contêm plasmídeos que requeiram seleção). Cresça levedura a 30 ° C até as colónias são formados para cada estirpe, tipicamente de 1 dia e 2 dias de YPD se meio selectivo é necessário.
- Aliquota de 1,2 ml de YPD meios líquidos ou meios líquidos selectivos em cada poço de uma placa com múltiplas cavidades profundas 96 2 ml. Transferência de células a partir de suportes sólidos em meios líquidos, usando um frogger, cobrir com uma tampa de plástico mantidas no lugar pela fita, e crescer durante a noite em 30 ° C agitador, agitação a 220 rpm.
Nota: Para minimizar a contaminação, placas de cobertura usando as tampas de plástico a partir de uma placa de petri rectangular. Segurar tampas no local usando um pedaço de fita adesiva, de modo a que a circulação de ar é minimamente restrito. - placas Centrifugar a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Deitar fora media de células; Adicionar 500 ul a cada poço YPA e ressuspender as células sedimentadas no YPA. Cobrircom tampa de plástico mantido no lugar por fita.
- Crescer as células durante 15 h a 30 ° C num incubador com agitação, agitação a 220 rpm. Continue a Seção 2.
2. Células esporulantes num formato de 96 Multiwell
- Adicionar tanto ona 3 mm de contas de vidro sólido estéril ou uma estéreis 5 mm x 2 mm de barra de agitação magnética a cada poço de uma placa de 96 poços com 1,3 ml de poços. (Veja resultados representativos abaixo para uma discussão sobre a possibilidade de usar um cordão ou uma barra de agitação.)
- Se todas as células a serem rastreados estão do mesmo genótipo, ir a 2.2.1. Se as células a serem selecionados são de diferentes genótipos, vá para o 2.2.2.
- Aqui as células a partir do passo 1.1.5 e alíquota de 500 ul de células mais meios de comunicação em cada poço da placa de poços múltiplos 96. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3.
- células de rotação que são em YPA de 1.2.4 a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Derrame demeios a partir de células f. Adicionar 500 ul de meio de esporulação a cada poço e ressuspender as células sedimentadas no meios de esporulação. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3.
- Se estiver usando uma conta de vidro, amostras de lugar em uma incubadora com agitação a 30 ° C e agitar a 220 rpm para a esporulação. Se estiver usando uma barra de agitação magnética, amostras lugar numa placa de agitação dentro de um C incubadora de 30 ° para a esporulação.
Nota: A velocidade de agitação exata para as barras de agitação magnéticas não é muito importante, desde que todos os bares estão se movendo energicamente ea cultura é arejada. - Para monitorar a progressão através de esporulação, retirar-se amostras da cultura esporulados para visualização, Adicionar 6 ul de células a partir das culturas esporuladas a 24 uL de meio de esporulação em uma placa de 96 poços lamela (diluição 1: 5). Deixar as células de se contentar com 5 min antes de examinar as células utilizando um microscópio invertido.
Nota: Em células SK1 tipo selvagem, esporos maduros compactos formará por 36 horas após a transferência para a mídia esporulação. Progressão através da esporulação pode ser monitorizada por microscopia utilizando marcadores fluorescentes, tais como um marcador nuclear (isto é, HTB2-mCherry 18) para examinar a divisão meiótica ou um marcador de membrana prospore (ou seja, G-20 19) para examinar esporos morfogénese. Em alternativa, a formação de esporos refractários podem ser vistos usando microscopia de Nomarski DIC começando cerca de 12 horas após a transferência para meios de esporulação.
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Representative Results
Para avaliar este protocolo, as eficiências de esporulação obtidos a partir de células esporuladas em placas com múltiplas cavidades (como descrito acima) foram comparados às células esporulados usando maiores volumes em frascos (Tabela 2). O uso de placas de múltiplos poços não atingiu a alta eficiência visto quando esporulação em frascos, onde a eficiência ~ 80% podem ser rotineiramente visto. Esporulantes em placas com múltiplas cavidades com arejamento adequado (fornecida por pérolas de vidro ou barras de agitação) pode atingir eficiência de esporulação suficientes maior do que 50%, com os melhores resultados de eficiência (66%) obtida utilizando uma barra de agitação 5 milímetros x 2 mm. A esporulação representante de duas linhagens diferentes (tipo selvagem e smk1Δ) é mostrado aqui (Figura 1). Estas células são examinadas após 36 horas em meios de esporulação e visualizados usando uma placa de 96 poços de fundo de vidro.
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Figura 1:. Células esporulação de uma esporulação representante tipo selvagem e smk1Δ células 20 esporulados em um placas de 96 poços múltiplos. As células foram visualizadas utilizando uma objectiva 63X de um microscópio invertido. Tétradas refractáveis (pontas de seta) pode ser visto na cultura do tipo selvagem, mas não na cultura contendo células smk1Δ. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A esporulação foi testada usando um 5 mm ou 7 mm de barra de agitação, cada um dos quais se encaixa dentro do poço de uma 96 placa com múltiplas cavidades 1,3 ml (Tabela 2). Usando uma barra de agitação 7 milímetros resultou em baixa eficiência esporulação (28%) em comparação com a maior eficiência (66%) conseguido usando a barra de mistura 5 mm. A barra de agitação 7 mm de um poço tendem a interagir com uma barra de agitação em umN bem adjacente (Figura 1), impedindo que as barras sejam capazes de agitar adequadamente e proporcionar arejamento suficiente da cultura.
| células esporuladas (%) | EPM (%) | |
| balão no agitador | 82 | 1.8 |
| sem talão no shaker | 17 | 2.4 |
| talão no shaker | 56 | 3 |
| nenhuma barra de agitação na placa de agitação | 10 | 2.2 |
| 5 mm agitar bar na placa de agitação | 66 | 3.9 |
| 7 mm agitar bar na placa de agitação | 28 | 6,7 |
| EPM = erro padrão da média |
Mesa 2:Eficiências de esporulação usando condições diferentes. A esporulação foi realizado em placas de 96 poços com múltiplas cavidades, como descrito acima, ou, se indicado, em frascos de 500 ml contendo 50 ml de meio de esporulação. Oito diferentes poços foram a média para cada condição realizada numa placa de poços múltiplos. Três garrafas diferentes foram esporulados. Todas as culturas são repetições técnicos, iniciado a partir da mesma colônia de HTB2 mCherry-marcado, mas de outra forma tipo selvagem SK1 diplóide cepa de levedura (LH902 18). Estas células foram cultivadas num frasco de YPD e um único balão de YPA, e, em seguida, dividido para inocular placas de 96 poços contendo meio de esporulação, como descrito acima. eficiência esporulação foi determinada pela contagem esporos refr�teis 36 horas após a transferência para meios de esporulação usando microscopia de campo claro Nomarski DIC.
Figura 2: Stirbares em 96 1,3 ml placas com múltiplas cavidades. cultura Esporulação contendo quer (A) 5 mm x 2 milímetros barras de agitação (vermelho) ou (B) bares 7 mm x 2 milímetros agitar (azul) em uma placa com múltiplas cavidades 96 1,3 ml em uma agitação magnética prato. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo para esporulação levedura SK1 em um formato com vários poços 96. O arejamento é a chave para a esporulação eficiente, que requer a utilização de qualquer uma barra de agitação ou um cordão de vidro em cada poço. Quando as células são esporulados em uma placa com múltiplas cavidades 96 numa incubadora com agitação sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação, as células não esporular eficientemente. Apenas um pequeno aumento na eficiência de esporulação é visto quando as células são esporulados, sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação num incubador com agitação, comparado a estar a 30 ° C sem agitação (Tabela 1; 17% em agitador vs 10% colocada sobre uma mexa placa). Da mesma forma, o uso de uma barra de agitação 7 mm resultou em baixa eficiência esporulação (28%), provavelmente porque os 7 mm agitar bares não arejar a cultura adequadamente devido às interações com barras de agitação em poços adjacentes. Este protocolo descreve as condições de esporulação usando a forma síncrona e eficiente esporulação SK1 estirpe de levedura 7,8 comumente usados para estudar sporulation; eficiências esporulação que podem ser obtidos com outras cepas de leveduras que utilizam este protocolo deve ser examinado antes de empreender uma grande tela usando essas técnicas.
Embora a 5 mm x 2 mm resultados barra de agitação em um pouco melhor esporulação em comparação com o uso de uma conta de vidro (66% de 5 mm de barra de agitação x 2 milímetros vs 56% com um talão de vidro), o custo necessário para a compra agitar o suficiente barras para cada poço pode ser proibitivo. As eficiências de esporulação obtidos utilizando um cordão de vidro proporciona uma solução de baixo custo que cria arejamento suficiente para rastreio de alto rendimento em formato de poços múltiplos 16, 96. Infelizmente, a adição de uma barra de agitação ou uma pérola de vidro não atingir os rendimentos de esporulação muito elevadas (tipicamente ~ 80% ou mais) visto quando esporulação em balões, e fenótipos de esporulação assim subtis pode ser difícil de detectar quando o rastreio de uma 96 bem formato.
Ao contrário dos métodos previamente descritos esporulação 9-13
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Joseph P. Healey, da Universidade de Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 do NIH (LSH). SMP é suportado em parte por uma Sanofi-Genzyme Fellowship da Universidade de Massachusetts Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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