Das Drosophila Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Summary

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Abstract

Drosophila melanogaster hat sich als leistungsfähiges experimentelles System für funktionelle und mechanistische Studien der Tumorentwicklung und -progression im Kontext eines gesamten Organismus erwiesen. Ausgeklügelte Techniken zur Erzeugung genetischer Mosaike erleichtern die Induktion von visuell markierten, genetisch definierten Klonen, die von normalem Gewebe umgeben sind. Die Klone können durch verschiedene molekulare, zelluläre und omics-Ansätze analysiert werden. In dieser Studie wird beschrieben, wie fluoreszenzmarkierte klonale Tumoren unterschiedlicher Malignität in den Augen-/Antennen-Imaginalscheiben (EAD) von Drosophila-Larven unter Verwendung der Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker (MARCM) erzeugt werden können. Es werden Verfahren beschrieben, wie das Mosaik, die EAD und das Gehirn aus den Larven gewonnen und für die gleichzeitige Bildgebung von fluoreszierenden transgenen Reportern und die Färbung von Antikörpern verarbeitet werden können. Um die molekulare Charakterisierung des Mosaikgewebes zu erleichtern, beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung der Gesamt-RNA aus dem EAD. Das Dissektionsverfahren ist geeignet, um EAD und Gehirne aus jedem Larvenstadium zu gewinnen. Das Fixierungs- und Färbeprotokoll für imaginale Scheiben arbeitet mit einer Reihe von transgenen Reportern und Antikörpern, die Drosophila-Proteine erkennen. Das Protokoll für die RNA-Isolierung kann auf verschiedene Larvenorgane, ganze Larven und erwachsene Fliegen angewendet werden. Die Gesamt-RNA kann für die Profilerstellung von Genexpressionsänderungen unter Verwendung von Kandidaten- oder genomweiten Ansätzen verwendet werden. Abschließend wird eine Methode zur Quantifizierung der Invasivität der klonalen Tumoren vorgestellt. Obwohl diese Methode nur begrenzt einsetzbar ist, ist ihr zugrundeliegendes Konzept auf andere quantitative Studien anwendbar, bei denen kognitive Verzerrungen vermieden werden müssen.

Introduction

Krebs stellt eine der genetisch heterogene Gruppe von Krankheiten, deren Häufigkeit und Sterblichkeit dramatisch zunimmt, insbesondere bei älteren Menschen weltweit. Krebs stammt klonal aus einem Tumor-initiierende Zelle, die inhärente Tumorsuppressor Mechanismen entweicht und teilt außer Kontrolle. Die allmähliche Ansammlung von genetischen Läsionen, die kooperativ Wachstum, die Vermehrung und Beweglichkeit fördern, während der Tod und die Differenzierung Hemmung verwandelt die anfängliche gutartige Wucherung in eine hochmaligne, metastasiertem und tödlichen Tumor. Es hat sich gezeigt, dass zusätzlich zu genetischen Veränderungen, die Tumorprogression Veränderungen im umgebenden Stroma und Übersprechen zwischen den Tumor und mehrere Zelltypen (beispielsweise Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) in seiner Mikroumgebung erfordert. die molekularen Prinzipien zugrunde liegenden malignen Transformation einschließlich Tumor-Stroma-Interaktionen zu verstehen, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung von prevention und frühen Screening-Strategien, sowie neue und wirksame Behandlungen von Krebsmetastasen und Medikamentenresistenz zu bekämpfen.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein attraktives System für die Krebsforschung geworden ^1-4 seiner schnellen Generationszeit wegen bemerkenswerte Erhaltung der Knoten zwischen Fliegen und Menschen, begrenzte genetische Redundanz und Fülle von fortgeschrittenen genetischen Werkzeugen , Signalisierung , die Manipulation von fast jedem Gen erleichtern ein temporär und räumlich beschränkten Weise. Genetisch definierte Tumoren unterschiedlicher Malignität reproduzierbar in Drosophila konstruiert werden durch Verstärkungs- und loss-of-function Mutationen in einer Untergruppe von Vorläufern in einem ansonsten Wildtyp - Gewebe unter Verwendung der MARCM Technik ⁵ einzuführen. Das MARCM Werkzeug kombiniert FLP / FRT (FLP - Rekombinase / FLP Recognition Target) -vermittelten mitotische Rekombination ⁶ mit FLP-out ⁷ und Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) ⁸ ZielgenExpressionssysteme ^9. Mit dieser Methode Expression jedes UAS-basierten Transgen, einschließlich Onkogen oder fluoreszierendes Protein cDNAs oder invertierte DNA-Wiederholungen für dsRNA-induced gene silencing, wird auf einen Klon von Zellen beschränkt werden, die einen bestimmten genetischen Locus und einen Gal4 Repressor aufgrund Rekombination verloren (1A). Geklonte Patches mit grün fluoreszierenden markiert (GFP) oder rot fluoreszierende Proteine (zB RFP, DsRed, mCherry) leicht während der gesamten Entwicklung, isoliert und analysiert verfolgt werden. Wichtig ist, dass ihr Verhalten direkt zum benachbarten Wildtyp-Gewebe verglichen werden. So relevante Fragen an die Zelle autonomen und nicht autonomen Auswirkungen der genetischen Läsionen können bequem untersucht werden. Ähnlich wie bei Säugetieren, nur Klone , bei denen mehrere onkogene Läsionen in Drosophila maligne kombiniert werden und die wichtigsten Merkmale von Säugetierkrebs rekapitulieren. Sie overproliferate, entziehen Apoptose induzieren Entzündung, unsterblich geworden und invasive und tötete schließlich den Host - ^10-17.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung genetisch definierten klonale Tumoren im Auge / antennal und Hirngewebe von Drosophila - Larven der MARCM Technik. Das Verfahren beruht auf einem MARCM Tester Lager, das die Hefe FLP - Rekombinase unter der Kontrolle des eyeless Enhancer (eyFLP) ^18,19 zum Ausdruck bringt. Auf diese Weise GFP-markierten Klone werden erzeugt sowohl in peripodial und Epithel des EAD und dem Neuroepithel des Gehirns gesamten embryonalen und Larvenstadien (1A, B und Referenz ^20). Die Klone können leicht bis zum Erwachsenenalter verfolgt werden, wie der EAD entwickelt sich zum erwachsenen Auge, Antenne und Kopfkapsel während der neuroepithelium Aufstieg zu Neuroblasten gibt, die differenzierte Optik lobe Neuronen erzeugen.

Zur Erleichterung der umfangreiche molekulare, funktionelle und phänotypische Charakterisierung des Mosaiks Gewebe, wir deSchreiber ein Protokoll für die Präparation des EAD und Gehirn von der dritten Larvenstadium und beschreiben, wie sie für drei verschiedene Anwendungen zu verarbeiten: (i) Nachweis von transgenen fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung, (ii) die Quantifizierung der Tumor Invasivität und (iii) Analyse Veränderungen der Genexpression eine quantitative Echtzeit - PCR (qRT-PCR) oder ein Hochdurchsatz - Sequenzierung mRNA (mRNA-seq) (1C) verwendet wird .

Die Immunofärbung Protokoll kann jedes Protein von Interesse mit einem spezifischen Antikörper zu visualisieren verwendet werden. Transgene fluoreszierende Transkriptions Reporter ermöglicht eine bequeme und präzise räumlich-zeitliche Informationen über die Aktivität eines bestimmten Signalwegs. Zell-Abstammungslinie spezifischen Reportern, andererseits widerspiegeln qualitative und quantitative Veränderungen in Zellpopulationen im mosaic Gewebe und unter Tumoren von unterschiedlichen Genotypen. Die Quantifizierung von invasiven Verhalten erleichtert den Vergleich von Tumor Malignität zwischen Genotyps. Schließlich ist das Protokoll beschreibt, Erfassung und Verarbeitung von Mosaik EAD für die RNA-Isolierung eignet sich sowohl für kleine und große Downstream-Anwendungen wie Reverse Transkription, gefolgt von qRT-PCR und genomweite mRNA-seq sind. Die qualitativen und quantitativen Daten aus diesen Tests gewonnenen Ergebnisse liefern neue Einblicke in das soziale Verhalten von klonalen Tumoren. Außerdem produzieren sie eine solide Grundlage für funktionelle Untersuchungen über die Rolle einzelner Gene, genetische Netzwerke und Tumor-Mikroumgebung in verschiedenen Phasen und Aspekte der Tumorentstehung.

Protocol

HINWEIS: Diese Arbeit nutzt die eyFLP1; act> y ^+> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, wannen Gal80 MARCM 82B Grüne Tester Linie ^11. Quer durch die MARCM 82B Grüne Tester Jungfrauen zu Männern von Stämmen wie w; UAS-a; UAS-b ^RNAi, FRT82B c ^mut Genotyp nachgeben Nachkommen , in der mitotischen Rekombination zwischen den rechten Arm der ^3. homologen Chromosomen auftreten. Auf diese Weise homozygoten mutanten Klone zur Gen - c zur FRT82B Stelle distal angeordnet wird innerhalb des EAD und Gehirn Neuroepithel erzeugt werden. Diese Klone werden exprimieren GFP - Transgen ein und dsRNA für die Gen - b (Abbildung 1A). Verschiedene eyFLP-MARCM Tester Linien für die Rekombination auf dem X, 2L, 2R, 3L und 3R wurden eingerichtet und sind in der Fliege-Community zur Verfügung.

1. Fly Handling, Kreuze und Staging

1. Erweitern Sie den entsprechenden MARCM Tester Lager bei Raumtemperatur durch mehrere bo bevölttles zugleich. Drehen Sie die Erwachsenen in frische Flaschen alle 2-3 Tage, so dass genügend Jungfrauen für nachfolgende Kreuze gesammelt werden.
   HINWEIS: Bei der Jungfrauen sammeln, vermeiden eine längere Exposition zu CO ₂ als das weibliche Fruchtbarkeit beeinträchtigt.
2. Je nach Umfang des Experiments eingerichtet fly Kreuze in Fläschchen mit mindestens 10 MARCM Tester Jungfrauen und 4 Rüden (zB für die Abbildung von fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung) oder in Flaschen mit mindestens 30 Jungfrauen und 10 Männer (zB für RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität).
3. Raise Nachkommen bei 25 ° C unter einem langen Tag 16 Stunden / 8 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus. Flip Eltern in neue Fläschchen / Flaschen alle 24 Stunden, um reproduzierbare Durchführung von Larven erleichtern und Übervölkerung zu verhindern.
   HINWEIS: Beim Start am Tag 6 nach der Eiablage (AEL), der späten dritten Larvenstadium Kontrollarven Stop Fütterung, beginnen wandern und Puparium-Bildung ein. Im Gegensatz dazu kann der Beginn des Larven-pupal Übergang dEverlegt oder nicht existent in Larven mit EAD hyperplastische oder maligne klonale Tumoren tragen.

2. Sammeln Dritte Larvenstadium

1. Für die Immunfärbung, sammeln etwa 20 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden einer Pinzette vorsichtig Larven zu holen aus dem Fläschchen oder Flasche und übertragen diese in einen Embryo Glasschale gefüllt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
   1. Für die RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität, sammeln mindestens 80 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden Sie eine Spritzflasche PBS in eine Fliege Flasche mit Larven zu spritzen, bis die Oberfläche bedeckt ist.
   2. Erweichen Sie die oberen Schichten der Nahrung mit einem Spatel und gießen Sie die Lebensmittel Maische Larven in eine Petrischale enthält. Mit einer Pinzette, Pick sanft Larven und übertragen diese in einen Embryo Glasschale mit PBS gefüllt.
2. Waschen Sie Larven mit PBS until alle Speisereste entfernt. Überprüfen Sie die Larven unter dem Fluoreszenzstereomikroskop mit 8 bis 16 - facher Vergrößerung , alle "Leopard - Larven" zu verwerfen, die während des Larvenkörper (2A, 2B und siehe Diskussion Sektion) random GFP-positive Flecken führen.
   HINWEIS: Für die RNA-Isolierung umfassen einen vorletzten Waschschritt in 70% EtOH für 1 min.
3. Die Schale enthält ausgewählte Larven in PBS auf Eis, bis Dissektion. Prozess Larven innerhalb von 30 min negativen Auswirkungen von Kälte und Hunger zu vermeiden.

3. Dissection von Larvae

1. Um den EAD unter einem Stereomikroskop sezieren, ein Paar Zangen verwenden, um sanft den mittleren Teil der Larve gegen die Glasschale unten drücken. Mit der zweiten Zange, greifen die Larven Mundhaken und ziehen Sie sie vom Körper weg (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die Zugkraft ist oft ausreichend, um die Optik Stiele Anschluss des EAD pai zu brechenr den Hirnlappen. Wenn das Gehirn oder seine Teile zu EAD und ihre Anwesenheit verbleiben, ist nicht für weitere Anwendungen gewünscht, schneiden Sie die Optik Stiel mit Hilfe der beiden Paare von Zangen. Für invasive Tumoren (zB ras ^V12 scrib ¹⁾ die Verbindung zwischen EAD und den Hirnlappen zunehmend mit der Zeit durch überwuchert und die Migration klonalen Zellen verdeckt wird.
   1. Um den EAD / Gehirn - Komplex mit einem intakten Bauchmark (VNC) (2D) herzustellen, verwenden Pinzette eine Larve in der Mitte des Körpers zu schneiden. Entsorgen Sie die hintere Hälfte.
   2. Halten Sie die vordere Hälfte des Larvenkörpers zwischen den Spitzen einer Zange, drehen Sie die Larve von innen nach außen, indem sie mit der Spitze der zweiten Zange in den Mund Haken schieben und durch die Kutikula über sie mit dem ersten Zangenpaar rollen.
2. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie alle Fremdgewebe (zB Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm) , während das EAD Paar verlassen oderder EAD / Gehirn-Komplex mit den Mundhaken verbunden. Entwirren die Mundhaken von der darüber liegenden Kutikula. Free the VNC durch die axonalen Projektionen Trennen erstrecken Körpermuskulatur und Epidermis (1B, 2C, 2D).
   HINWEIS: Die Mundhaken zur sicheren Handhabung von Gewebe mit einer Pinzette ermöglichen und effizienter Versenkung und einfache Erkennung von Gewebe während des Waschens zu erleichtern. Dissected EAD Änderung Morphologie relativ schnell, wenn in PBS nicht fixierten gehalten. Begrenzen Sie die Dissektion Zeit auf 20-30 min.
3. Um das Gewebe zu übertragen, Mantel ein P20 Mikropipettenspitze durch die restliche Körper Pipettieren Gerippen mehrmals auf und ab. Um die größeren EAD / Hirn-Komplexe übertragen, schneiden Sie die P20 Mikropipette Spitze mit einer Schere.
   HINWEIS: Das Beschichtungsverfahren ist entscheidend Klebe- und den Verlust von sezierten Gewebe während der Übertragung zu verhindern. Die Verwendung einer P20 Mikropipette minimiert die Übertragung von PBS in Fixierungslösung, unerwünschte Verdünnung zu begrenzen.
   1. Für die Immunfärbung, übertragendie seziert EAD in ein 0,5-ml-Röhrchen mit 400 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PFA für größere EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität.
      ACHTUNG: PFA ist hochgiftig. Schutzhandschuhe tragen und Kleidung. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäute.
   2. Für die RNA-Isolierung übertragen die seziert EAD in eine neue Glasschale mit kaltem PBS gefüllt. Verwenden einer Pinzette zu reinigen EAD aus den Ring und Lymphdrüsen, Probe Verunreinigungen zu minimieren.
   3. Nehmen Sie den EAD aus den Mundhaken durch die Verbindung zwischen den Antennenscheiben Trennen und Mundhaken mit einer Pinzette (Abbildung 2E). Um RNA-Abbau und die Genexpression Artefakte zu vermeiden, begrenzen die Dissektion Zeit auf 30 min. Fahren Sie mit Schritt 7 fort.
      HINWEIS: Ein erfahrener Forscher kann etwa 60 Larven in 30 min ohne Zeit für die Larven Sammlung und Waschen benötigt sezieren. Die Gesamt-RNA-Ausbeuten hängen von der EAD Größe, die unter Genotypen und developmenta variierenl Stufen. Dissection von 80-100 Steuer EAD Paare von späten dritten Larvenstadium sollte 5-8 & mgr; g Gesamt-RNA erhalten.

4. Befestigung, Immunostaining und Montage

1. Fix Proben in PFA Fixativ für 25 min, während bei Raumtemperatur Taumel. Die Fixierungszeit ohne Veränderung Gewebemorphologie und die Antigenität von Proteinen bis zu 60 min verlängert werden.
2. Entfernen Sie die Fixierlösung und Waschproben mit PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) dreimal für 10 min ein Nutator verwenden. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen von PBST für jeden Waschschritt (400 & mgr; l / 0,5 ml Röhrchen).
   HINWEIS: Fest EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität nicht Immunofärbung erfordern. GFP-Signal bleibt gut sichtbar nach der Fixierung. Gehen 4.4 für die endgültige Präparation zu treten.
   1. Für die Immunfärbung, Block Gewebe in 200 ul einer Blockierungslösung (PBST mit 0,3% BSA) für 20 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
      1. Inkubieren mit primary Antikörper bei 4 ° C über Nacht in 100 ul einer Blockierungslösung verdünnt unter leichtem Schütteln. Wenden Sie sich an primären Antikörper Datenblatt oder der veröffentlichten Literatur für empfohlene Antikörperverdünnung.
         HINWEIS: Die primäre Antikörperverdünnung kann optimiert werden müssen.
      2. Nach fünf 10 min Waschen in PBST, Fleckengewebe mit den fluoreszierenden sekundären Antikörpern verdünnte Lösung bei der Blockierung während sanft für 2 Stunden bei Raumtemperatur schütteln oder über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
      3. Wash Proben dreimal 10 min in PBST.
3. Ersetzen PBST mit 500 ul DAPI-Färbelösung. F-Actin beschriften, fügen phalloidin an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert mit DAPI-Färbelösung. Nach 15 min im Dunkeln Nutation, wasche Gewebe einmal für 10 min mit PBST.
   HINWEIS: F-Aktin Kennzeichnung unabhängig durchgeführt von DAPI-Färbung werden kann.
4. Für die endgültige Präparation Schritt übertragen Gewebe zurück in eine PBS-gefüllten Glasschale mit einem 1 ml pi mitPette. Mit den beiden Zangen die Mundhaken abschneiden.
   1. Trennen Sie die Gehirne, die zur Quantifizierung der Invasivität von der EAD verwendet wird, durch die Optik Stiel als bewachsen EAD schneiden könnte die Analyse erschweren.
5. Geben Sie einen Tropfen des Montagemedium (15 & mgr; l für eine 22 mm x 22 mm Deckglas) auf einer objektiven Folie. Mit Hilfe der Zangenspitzen, zu verteilen, das Medium in eine dünne Schicht. Übertragen EAD, Gehirn oder die EAD / Gehirn-Komplexe in die Montagemedium mit einer P20 Mikropipette.
6. Verwenden Sie die Zangenspitzen oder ein Wolframstab Gewebe zu verteilen und die VNC auf der Folie zu begradigen.
7. Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, während, erste Berührung einer Kante einer Deck zur Montagemedium und dann langsam tiefer auf die Montagemedium mit Hilfe einer Pinzette Montage. Verwenden Sie kleine Stücke von Filterpapier oder Gewebe wischen Überschüssiges Montagemedium rund um die Deck Kanten zu absorbieren.
   HINWEIS: DABCO / Poly (Vinylalkohol) 4-88 Eindeckmediums verhärtetbei 4 ° C innerhalb einer Stunde. Folien können für Monate bei 4 ° C gelagert werden.

5. Die konfokale Imaging

1. Erwerben Sie einzelne konfokale Schnitte und Stapeln ein konfokales Mikroskop mit 20X, 40X und 60X Öl Ziele ausgestattet werden.
2. Verhindern Pixelsättigung. Verwenden Sie gleiche Bildaufnahmeparameter einschließlich Bildauflösung, Lasereingangsleistung, Gain, Offset, Bildmittelung, einer Schrittweite in einer z-Serie und halten Sie diese Einstellungen für alle Genotypen für den Vergleich von Pixelintensitäten zwischen verschiedenen Genotypen ^21,22 zu ermöglichen.
   HINWEIS: Für die Visualisierung von EAD / Gehirn-Komplex, maximale Projektionen erzeugen und Stich jeweiligen Nachbar Bilder. Für die endgültige Bildvorbereitung, verwenden Post Bildverarbeitungssoftware für Tafelaufbau und Helligkeit und Kontrast einzustellen.

6. Quantifizierung der Tumorinvasivität

1. Definieren Sie ein Punktesystem, das die verschiedenen Ebenen der Tumor invasivenes charakterisierens das räumliche Muster der Invasion und die Menge an GFP-positiven Zellen unter Berücksichtigung in das Gehirn und VNC verbreiten. Bereiten Bewertungsbögen zur Dokumentation (3A).
2. Berg mindestens 80 intakten Gehirn für jeden Genotyp auf einer Folie unter Verwendung von 40 & mgr; l des Eindeckmediums pro 24 mm x 50 mm Deckglas befestigt.
   1. Damit unvoreingenommene Scoring, fragen Sie eine neutrale Partei, die die Folien zu anonymisieren, so dass die Scoring-Verfahren unvoreingenommen ist. Bewerten anonymisierten Dias durch zwei voneinander unabhängige Labor Mitglieder. Disc Genotypen erst nach dem Zählen fertig ist.
3. Werten Sie den Grad der Bösartigkeit von einem blinden Scoring-berittener Gehirne unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem GFP-Filtersatz ausgestattet. Verwenden Sie eine Markierung Gehirne zu kennzeichnen , die bereits angezeigt wurden Doppelzählungen (3B) zu vermeiden.
4. Berechnen Sie den Prozentsatz der Gehirne in jede der definierten invasive Kategorien pro Genotyp fallen. Bestimmen Sie die statistischen significance mit einem Chi-Quadrat - Test (3C).

7. RNA-Isolierung, DNase Behandlung und Qualitätsprüfung

HINWEIS: Alle Reagenzien (Lösungen Kunststoff, Kunststoff) in den folgenden Schritten verwendet werden, sollten frei von RNase-Aktivität sein. Immer Handschuhe tragen und eine chemische Haube für die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln verwendet werden.

1. Übertragen Sie die saubere EAD mit einer beschichteten P20 Mikropipettenspitze in 1,5-ml-Röhrchen.
2. Lassen Sie Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens vorsichtig entfernen PBS und ersetzen Sie es mit 100 & mgr; l RNA Lysereagenz (ausreichend für bis zu 140 EAD).
3. Lyse Gewebe durch Verwirbelung. An dieser Stelle können die Proben tiefgefroren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C gelagert oder direkt mit einem Standard-RNA-Isolierung Protokoll verarbeitet.
   HINWEIS: Die Proben von ähnlichen Genotypen aus mehreren Dissektion Runden kann einmal in RNA Lysereagenzes gepoolt werden.
4. Füllen Sie das Probenvolumen auf 0,9 ml mit RNA Lysereagenzes. In 0,2 ml Chloroform und mischen Proben vigoronuierlich für 15-20 Sek.
5. Nach 2 bis 3 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugiert werden die Proben bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
6. Übertragen farblos obere wässrige Phase, die RNA in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören. Halten Sie sich von der Inter weg, wie es Proteine ​​und genomische DNA enthält.
   HINWEIS: Die rückgewonnene Volumen sollte zur Homogenisierung verwendet etwa 60% des Volumens der RNA Lysereagenz sein.
7. Auszufällen die RNA durch Zugabe von 0,5 ml Isopropylalkohol. Vortex und Inkubation Proben bei Raumtemperatur für 10 min.
8. Zentrifugiere die Proben bei 10.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
9. Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet einmal mit 600 & mgr; l 75% Ethanol. Nach einer kurzen Wirbel und Zentrifugation (10.000 × g für 7 min bei 4 ° C) alle Ethanol verwerfen und lassen Sie wischen das RNA-Pellet lufttrocken für 5-10 min das offene Rohr mit einem sauberen Tuch platzieren.
   HINWEIS: Das RNA-Pellet könnte als winziger opak / weiß st sichtbar seinam Boden des Röhrchens oder unsichtbar reif. Die restlichen Ethanol Tropfen können vorsichtig mit P10 Mikropipettenspitze entfernt werden.
10. Löse RNA in 50 ul DEPC-behandeltem Wasser durch Vortexen oder vorbei Lösung einige Male durch eine Pipettenspitze.
11. Um eine Kontamination mit genomischer DNA minimieren, Behandlung Gesamt-RNA mit DNase durch Zugabe von 50 ul einer Mischung, enthaltend 1 ul DNase (2 U / ul) und 10 ul 10x-Puffer DNase in DEPC-behandeltem Wasser. Vortex und Spin-down.
12. Inkubieren Proben bei 37 ° C in einem Wasserbad oder einem Heizblock für 30 bis 40 min. Nach der Inkubation wurden 100 ul DEPC-behandeltem Wasser in jeder Probe hinzu.
13. Um die enzymatische Aktivität und saubere RNA von DNase zu inaktivieren, 200 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) -Lösung, vortex für 1 min und zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 7 min bei 4 ° C.
14. Sorgfältig Transfer-RNA in ein frisches Röhrchen die obere wässrige Phase enthält. In gleichen Volumen (200 ul)Chloroform, mischen und den Zentrifugationsschritt von oben wiederholen.
15. Sammeln sorgfältig die obere Phase und auszufällen RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 , hergestellt in DEPC H ₂ O und 2,5 Volumen 100% Ethanol. Gut mischen durch Vortexen.
    HINWEIS: Durch Hinzufügen 0,5 ul Glykogen (20 ug / ul) zu einer Fällung Mischung hilft, die RNA-Pellet zu visualisieren. RNA-Verlust, verwenden silikonisierte, Low-Bindung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu minimieren.
16. Auszufällen RNA bei -20 ° C für mindestens 1 Std.
    HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht durchgeführt werden. Proben können auch bei -80 ° C platziert.
17. Pellet RNA durch Zentrifugation bei 10.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Waschen und Trocknen des Pellets nach der Beschreibung in 7.9.
18. Man löst RNA in 10-15 ul DEPC-behandeltem Wasser. Store RNA bei -80 ° C.
19. Bestimmen Menge und Reinheit der RNA wurde durch OD bei 230 nm gemessen wird, 260 nm und 280 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen RNA concentration durch die Konvention, dass 1 OD bei 260 nm Anwendung 40 ug / ml RNA entspricht.
    HINWEIS: Die A _260/280 Verhältnis von "reinen" RNA ist gleich 2,0 , während ein A _260/230 - Verhältnis im Bereich von 2,0 bis 2,2 liegen. RNA - Proben mit einem A _260/280 - Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 sind geeignet für Downstream - Anwendungen wie cDNA - Synthese. Für die Herstellung von mRNA-seq Bibliotheken die Qualität und Quantität von RNA sollte unter Verwendung eines automatisierten Elektrophorese-System überprüft werden. Das 28S / 18S-Verhältnis sollte über 1,8 sein.

Results

GFP-markierten Flecken von definierten Genotypen in Drosophila EAD, drei Arten von Klonen , um das Potential der eyFLP-MARCM Technik zeigen , wurden zu erzeugen induziert: (1) Kontrolle, die GFP allein, (2) maligne Tumore eine onkogene Form des kleinen exprimierenden G-Protein Ras (Ras ^V12) in einem Hintergrund von homozygoten Verlust eines Gens scribble Tumorsuppressor (Scrib ¹⁾ und (3) Bewachsen aber nicht-invasive Scrib ¹...

Discussion

Die Techniken der genetischen Mosaiken in Drosophila zu erzeugen , gehören zu den anspruchsvollsten Werkzeuge für die Analyse und die Genfunktion ³³ zu manipulieren. Das eyFLP-MARCM System leistungsfähig und robust erwiesen , da sie die Induktion von visuell markiert, genetisch definierte Klone in einer räumlich beschränkten Weise ermöglicht, also in Geweben , in denen die augenlose Enhancer aktiv ^9,18 ist. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere genetische Läsionen in d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Gewü RZMÜ hle Brecht, Eggenstein, Deutschland	00262-0500	Fliegenfutter Rezept: 20 L Fliegenfutter mit 160 g Agar, 360 g Hefe, 200 g Sojamehl, 1,6 kg gelbem Maismehl, 1,2 l Malzextrakt, 300 ml hellem Maissirup, 130 ml Propionsäure und 200 ml 15 % Nipagin zubereiten. Fliegenfutter sollte 1 Stunde lang bei 85  °C.
Maissirup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Deutschland	01939
Propionsäure	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	6026.1
Maismehl	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Deutschland	4010155063948
Malzextrakt	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Deutschland	728985
Sojamehl	Stockmeier Food GmbH, Herford, Deutschland	1000246441010
Hefe	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Deutschland	210099K
Methyl-4-benzoat/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	H5501	Bereiten Sie eine 15%ige Stammlösung mit 70% EtOH
Drosophila Fliegenfutterfläschchen	vor Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland	789008
Fläschchenstopfen	K-TK e.K., Retzstadt, Deutschland	1002
Drosophila Fliegenfutterflaschen	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland	960177
Flaschenstopfen	K-TK e.K., Retzstadt, Deutschland	1002 S
Poly(vinylalkohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	81381	Rezeptur für Eindeckmedium: 6 g Poly(vinylalkohol) 4-88 in 39  ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) und 12,5 ml Glycerin. Über Nacht bei 50  umrühren ° C und Zentrifuge 20  min bei 5.000 U/min. Geben Sie DABCO zum Überstand, um eine Endkonzentration von 2,5 % zu erhalten. Lagern Sie Aliquots bei -20  °C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	9002-93-1
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O
PBST			0,1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyd/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	158127	4% PFA-Fixiermittel Rezept: 4  g PFA in 80 ml Millipore H2O auf einer magnetischen Rührplatte, die auf 55 μg erhitzt wird °C. 1 M NaOH tropfenweise zugeben, bis alle PFA-Partikel aufgelöst sind. Fügen Sie 10 ml 10x PBS hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Mischen Sie 100 & Mikro ein. l Triton X-100 und mit Millipore H2O auf 100 ml auffüllen. Aliquots bei -20 °C lagern. Wiederholtes Auftauen vermeiden. (ACHTUNG: PFA ist hochgiftig. Bereiten Sie das PFA-Fixiermittel in einem Abzug vor. Tragen Sie ein umluftunabhängiges Atemschutzgerät, Handschuhe und Kleidung. Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäuten vermeiden.)
Rinderserumalbumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	A3059	Rezept für Blockierungslösung: 0,3 % BSA in PBST auflösen
Fluoreszenzmarkiertes Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, Molekulare Sonden	A12379, A22283, A22284	Phalloidin-Stammlösung: Pulver (300 U) in 1,5 ml Methanol auflösen. Bei -20 °C lagern. Zum Färben in Verdünnung 1:250 (A12379, A22283) und 1:100 (A22284) in PBST verwenden.
4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	6335	DAPI Färbelösung: Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mg/ml in Millipore H2O vor und lagern Sie die Aliquote bei 4 μC. Wird in einer Verdünnung von 1:1.000 in PBST verwendet.
Maus-Anti-H2-Antikörper	Kurucz et al., 2003		Verwendet in Verdünnung 1:500 in Blockierungslösung
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Verwendet in Verdünnung 1:500 in Blockierungslösung
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland	11295-10
Embryoschale aus Glas (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	E90
Wolframnadeln	Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland	10130-20
Vernickelter Stifthalter	Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland	26018-17
Objektträger	VWR, Darmstadt, Deutschland	631-1553
Deckgläser 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, Darmstadt, Deutschland	631-1336
Deckgläser 24 x 50 mm (0,13-0,16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	06-677-70
Präparier-Stereomikroskop	Olympus, Hamburg, Deutschland	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluoreszierendes Stereomikroskop	Olympus, Hamburg, Deutschland	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) mit DP72 CCD-Kamera	Ausgestattet mit dem schmalen blauen Bandpassfilter-Set zur Anregung von GFP anderer blau erregbarer Fluorochrome (Anregungsfilter BP460-480 nm, Barrierefilter BA495-540 nm) und schmalem grünen Anregungs- und Langpassbarrierenfilter für RFP und andere grün erregbare Fluorochrome (Anregungsfilter BP530-550, Barrierefilter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Konfokales Mikroskop	Olympus, Hamburg, Deutschland	FV1000	Ausgestattet mit inversem IX81 Mikroskop. Ziele: 20 mal; UPlan S-Apo (NA 0,85), 40fach UPlanFL (NA 1.30) und 60-fach; UPlanApo (NA 1.35). Laser: UV-Laser Diode LD405 (50  mW), Argon-Laser, mehrzeilig 457/(476)/ 488/515 (40  mW), Gelb/Grün Laserdiode LD560 (15  mW) und Red Laser diode 635 (20  mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila Kühlbrutschrank	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Deutschland	Sanyo MIR553
Spritzflasche	VWR, Darmstadt, Deutschland	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Deutschland	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Deutschland	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysereagenz	VWR, Darmstadt, Deutschland	2302700	Das Protokoll ist kompatibel mit anderen TRIzol-basierten Reagenzien, z.B. , TRIreagent von Sigma (Kat. Nr.T9424), TRIzol Reagenz von Thermofisher (Kat. Nr. 15596).
Diethylpyrocarbonat/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	D5758	DEPC 1:1.000 in Millipore H2O verdünnen, über Nacht umrühren und autoklavieren.
Ultrareines Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Deutschland	102445
TURBO DNase (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	AM2238
Invitrogen UltraPure	Glycogen ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland	10-814-010
Natriumacetat-Trihydrat	VWR, Darmstadt, Deutschland	27652.232	Bereiten Sie eine 3 M Natriumacetatlösung mit DEPC-H2O vor und stellen Sie den pH-Wert auf 5,2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethanol	Merck, Darmstadt, Deutschland	100983	Bereiten Sie eine 75%ige EtOH-Verdünnung mit DEPC-H2O vor.
UV/Vis-Spektrophotometer NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	ND-8000
Eppendorf Mikrozentrifuge (gekühlt)	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	7007103
Experion Automatisierte Elektrophoresestation	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	7007010
SuperScript III Reverse Transkriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien		Prepare 100 µ M Lagerlösungen in DEPC-H2O und Lagerung bei -20 > C
dNTP Mischung	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Frankreich	4030	Lager Aliquots von 25 &; Mikro; l bei -20°; C
CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	170-8882
Hartschalen-PCR-Platten 96-Well, dünnwandig	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Deutschland	MSB1001
rp49 Forward	Primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Reverse Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'