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Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

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DOI:

10.3791/54586

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17. September 2016

 , 
1Institute for Molecular Plant Sciences, University of Edinburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Zusammenfassung

Die zirkadiane Uhr der Pflanze ermöglicht die Antizipation täglicher Veränderungen der Umgebung. Diese Antizipation unterstützt die Reaktionen auf zeitlich vorhersehbaren biotischen und abiotischen Stress. Umgekehrt beeinträchtigt eine Störung der zirkadianen Zeitmessung die Pflanzengesundheit stark und verringert die landwirtschaftlichen Ernteerträge. Es ist daher unerlässlich, dass wir die komplizierte Regulation des zirkadianen Rhythmus in Pflanzen verstehen, einschließlich der Faktoren, die die Bewegung des transkriptionellen Uhrwerks selbst beeinflussen.

Das Testen zirkadianer Defekte in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) beinhaltet traditionell das Kreuzen spezifischer mutierter Linien mit einer Linie, die rhythmisch Glühwürmchen-Luziferase von einem zirkadianen Uhr-Genpromotor exprimiert. Dieser Ansatz ist mühsam, zeitaufwändig und könnte erfolglos sein, wenn eine Mutante keinen zirkadianen Phänotyp aufweist. Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht eine schnelle Ersteinschätzung der zirkadianen Phänotypen. Protoplasten, die von mutierten und wildartigen Arabidopsis abgeleitet sind, werden isoliert, mit einem rhythmisch exprimierten lumineszierenden Reporter transfiziert und 5 Tage lang unter konstanten Lichtbedingungen abgebildet. Lumineszierende Spuren zeigen direkt, ob sich die Freilaufzeit von mutierten Pflanzen von der von Wildtyp-Pflanzen unterscheidet. Der Vorteil der Methode besteht darin, dass jede Arabidopsis-Linie effizient gescreent werden kann, ohne dass eine stabil transgene lumineszierende Uhrmarkierungslinie in diesem mutierten Hintergrund erzeugt werden muss.

Einleitung

Die meisten lebenden Organismen besitzen ein endogenes Zeitnehmer effiziente Vermittlung von täglichen Änderungen der Umwelt zu unterstützen. Dieser Zeitnehmer, der zirkadianen Uhr reguliert viele Aspekte des Stoffwechsels und der Physiologie eines Organismus vorhersagbare Änderungen der äußeren Umgebung zu antizipieren. Bei Pflanzen zum Beispiel Vorgriff auf zeitlich vorhersehbar Erreger oder Pflanzenfresser Angriffe stark reduziert Gesamt Anfälligkeit 1 bis 4. Stärkemetabolismus ist eng durch die innere Uhr reguliert zuletzt bis zum frühen Morgen , dass Stärke Reserven , um sicherzustellen , ob 5 bei langen oder kurzen Tag Bedingungen gezüchtet. Tatsächlich Pflanzen, mit Zirkadianrhythmen die 24 - Stunden - Umgebung zeigen eine erhöhte Wachstumsraten passende, Kohlenstofffixierung Raten und Überlebensraten auf Pflanzen verglichen 6 eine Uhr nicht passender Zeit läuft. Den starken Einfluss der zirkadianen Rhythmen in allen diesen Verfahren entsteht zu einem großen Teil von der rhythmischen Regulierung von bis zu einem Drittelder gesamten Transkriptom in Arabidopsis 7. Diese rhythmische Genprodukte werden in einem breiten Spektrum von zellulären Prozessen einschließlich Stoffwechselwege, Hormonsignalisierung und Stressreaktionen beteiligt 7. Hinzu kommt, dass, wird durch zirkadianen Regulation der Phosphorylierung 8 und höchstwahrscheinlich andere post-translationale Modifikationen (PTM) direkt circadian Regulierung der Proteinfunktion etabliert.

In der Mitte des zirkadianen Uhr , die diese tägliche Transkriptions Umprogrammierung treibt liegt ein Netz von Transkriptions / Translations - Feedback - Schleifen (TTFLs), einschließlich der Morgen-exprimierte Gene zirkadianen Uhr ASSOCIATED 1 (CCA1) und LATE ELONGATED Hypokotyls (LHY), die die Expression unterdrücken des abends Gene ZEITPUNKT dER CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) und die Mitglieder des abends Komplex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), frühe Blüte 3 (ELF3) und ELF4 9 bis 11. Zusammen Witzh die PSEUDO RESPONSE REGLER -genes (PRR3, 5, 7 und 9), reprimiert TOC1 CCA1 / LHY - Expression während der EG wirkt als positiver Regulator 12 bis 14. Zusätzlich zur Rückkopplungsmechanismen, post-transkriptionale und post-translationalen Regulation der TTFL Netzkomponenten spielt eine wichtige Rolle bei der Abstimmung zirkadianen Rhythmen. Bis heute ist die am häufigsten vorkommende PTM auf zirkadianen Uhr Proteine ​​identifiziert ist Phosphorylierung 15. Die Phosphorylierung von CCA1 von Casein Kinase 2 (CK2) wirkt sich auf seine Bindung 16 Veranstalter zum Ziel und ist wichtig für die Temperaturkompensation des zirkadianen Uhr 17. Die PRR Proteine ​​werden unterschiedlich über den zirkadianen Zyklus phosphoryliert, und die Phosphorylierung von TOC1 wirkt Wechselwirkung mit seinem negativen Regulator, der Abend-Phasen - Taktkomponente Zeitlupe (ZTL) 18. Diese Beispiele zeigen, wie PTMs und Protein-Protein-Wechselwirkungen tune das TTFL Netzwerk in eine 24-Stunden-Transkriptions Oszillators. Für eine detaillierte Einführung in die Transkriptions Clock - Netzwerk und dessen Regulation sind ausgezeichnet jüngsten Bewertungen verfügbar (zB Referenz 15).

Doch was bleibt weniger klar ist, inwieweit die rhythmisch geregelte Prozesse und andere Aspekte des Zellstoffwechsels selbst zurück in den Zeitmessungsmechanismus zuzuführen. Umfangreichen Screening von Arabidopsis-Mutanten zur Taktfehler könnten gewinnen weiteres Verständnis, welche Mechanismen oder Signalwege könnte in der Erzeugung von 24 Stunden Rhythmen von einem TTFL Netzwerk eingebunden werden. Zu diesem Zweck Kim und Somers veröffentlichte zuvor ein Durchbruch Verfahren für die effiziente und schnelle Analyse von Takt - Funktion in jeder Arabidopsis Linie 19. Basierend auf der Verwendung von transienten Expression in Protoplasten übertrifft diese Methode die Notwendigkeit für einen stabilen transgenen Linien oder kreuzt, um lumineszente Taktmarkierungslinien. Hier visualisieren wir eine ertragreiche Protoplasten isolation Verfahren 20 mit einer optimierten Protokolls kombiniert circadian Defekte zu screenen durch lumineszente Bildgebung von transient exprimierten Taktmarkierungen in einer 96-Well - Plattenlesegerät.

Wir werden gut charakterisierte Uhr Mutanten Wildtyp Col- 0 Arabidopsis vergleichen die Methodik hier erfolgreich erkennt veränderten Tagesrhythmus beschrieben zu bestätigen. Die Protoplasten aus diesen Linien abgeleitet sind mit einem Reporterkonstrukt transfiziert , das Glühwürmchen - Luciferase aus dem zirkadianen CCA1 Promotor exprimiert; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalysiert die mehrstufige Reaktion , in der Luciferin umgewandelt wird elektronisch angeregten Oxyluciferin dass Licht 21 emittiert, die über die Zeit abgebildet wird die Periode, die Amplitude und Phase der Transkriptions Rhythmen in diesen Protoplasten zu beurteilen.

Das Protokoll besteht aus drei Hauptteilen; der Protoplasten zu isolieren, die Protoplasten mit dem Reporter-Plasmid transfizieren und Leucht imAltern. Diese drei Teile sollten immer an einem einzigen Tag durchgeführt werden, unter Verwendung von frisch hergestellten Puffer und Reagenzien. Pflanzenwachstum und Reinigung von ausreichenden Mengen an Reporterplasmid sollten im Voraus durchgeführt werden und sind in diesem Protokoll visualisiert.

Protokoll

HINWEIS: In diesem Protokoll, Reagenzien und Volumina beschrieben werden pro Arabidopsis Linie ausgedrückt, die getestet wird, und in sechs Wiederholungsvertiefungen für diesen Genotyp führt. Multiplizieren die Materialien mit der Anzahl der Zeilen analysiert werden, wenn mehr als eine Zeile zu analysieren. In dem Video wird Wildtyp - Arabidopsis auf die innere Uhr Mutantenlinie ztl verglichen werden (obwohl repräsentative Ergebnisse von weiteren Leitungen werden anschließend zur Verfügung gestellt werden).

Enzymlösung
Zellulase 0,5% (w / v)
Pectinase R10 0,25% (w / v)
D-Mannitol 400 mM
CaCl 2 10 mM
KCl 20 mM
Rinderserumalbumin 0,1% (w / v)
MES, pH 5,7 20 mM
W5 - Lösung
NaCl 150 mM
CaCl 2 125 mM
KCl 5 mM
MES, pH 5,7 2 mM
Glucose 5 mM
MMg Lösung
MES, pH 5,7 4 mM
D-Mannitol 400 mM
MgCl 2 15 mM
PEG - Lösung
PEG4000 40% (w / v)
D-Mannitol 200 mM
CaCl 2 100 mM
Imaging - Lösung
W5-Lösung zum Endvolumen
Fetales Kälberserum 5% (v / v)
Luciferin 1,2 mM
Ampicillin 50 mg / ml

Tabelle 1: Liste der Lösungen.

1. Herstellung von Materialien und Puffer

  1. Pflanzenmaterialien
    1. Halten Sie Arabidopsis Col -0 Samen in Wasser in einem 1,5 - ml - Röhrchen bei 4 ° C im Dunkeln für vier Tage. Pipette, um die Samen auf dem Boden kommen in einen Topf geben und Transfer zum Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht 8 Stunden Dunkelheit) bei 21 ° C für 7 Tage. Lassen Sie einen Deckel auf den Topf für die ersten drei Tage mit hoher Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Transplantations sechs Sämlinge zu einem neuen 8 cm x 13 cm x 5 cm Topf und weiterhin die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen für anoth wächster 21 Tage. Stellen Sie sicher, dass der Boden feucht ist im gesamten Gebäude.
  2. Reporterplasmid
    1. Reinige den CCA1pro: LUC - Reporterplasmid 19 aus Bakterienkultur im Voraus, eine DNA - Extraktions - Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
      HINWEIS: 20 & mgr; g Reporterplasmid erforderlich ist (10 & mgr; l bei 2 ug / ul in dH 2 O) für eine Transfektion.
  3. Lösungen
    HINWEIS: Für dieses Protokoll fünf Lösungen benötigt werden: Enzymlösung, Wasch 5 (W5) Lösung, Mannitol-Magnesium (MMG) Lösung, Polyethylenglykol (PEG) -Lösung und Imaging - Lösung (Tabelle 1). Bereiten Sie diese, bevor auf die Isolierung von Protoplasten Schritt weiter.
    1. Herstellung von 10 ml der Enzymlösung gemäß Tabelle 1, wobei sich die Enzyme letzten, und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um - Spritzenfilter sterilisieren.
    2. Bereiten Sie die verbleibenden Lösungen in folgenden Volumina: 15 ml W5-Lösung, 10 ml MMg solution, 1 ml PEG - Lösung und 1,5 ml Imaging - Lösung gemäß Tabelle 1.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die PEG-Lösung nicht weniger hergestellt wird, als eine Stunde vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass das PEG vollständig aufgelöst hat. Filter sterilisieren die Imaging-Lösung durch einen 0,22 & mgr; m Spritzenfilter.

figure-protocol-1

Abb . 1: Isolierung von Protoplasten Die Blätter von erwachsenen Arabidopsis - Pflanzen (A) auf Autoklav Band fixiert mit der unteren epidermalen Schicht nach oben (B). (C) Magic Tape auf die untere Schicht der Epidermis mit der Spitze eines 15 ml konischen Röhrchen sanft gepresst. (D) Das magische Band wird entfernt , um die Mesophyllzellen (E) zu belichten. (F) Streifen des Autoklaven Band mit Urlaubs gebunden sind, auf die Enzymlösung, die Cellulase und Pektinase, schwebte Protoplasten in die Lösung freizusetzen. (G) Die Blatt Skelette auf Autoklaven Band bleiben , nachdem Enzym die Verdauung und werden verworfen, die Protoplasten in Enzymlösung verlassen (H). (I) Endgültige resultierende Mesophyll - Protoplasten (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Isolierung von Protoplasten

  1. Beschriften Sie eine Petrischale und 10 ml Filter-sterilisierte Enzymlösung.
  2. Fix vier Streifen Autoklav-Band mit der klebrigen Seite auf einer sauberen Laborfläche nach oben, und die Größe der Petrischale Markierung auf dem Streifen.
  3. Schneiden Sie Blätter von 4-Wochen alten Pflanzen (Abbildung 1a), und drücken Sie die obere Epidermis auf den Autoklaven Band (dh der unteren epidermalen Seite nach oben ( Abbildung 1b)).
  4. Drücken Sie vorsichtig Streifen Magic Tape auf die untere epidermalen Oberfläche eine 15 ml konischen Röhrchen mit. Achten Sie darauf , nicht in das Blattgewebe (Abbildung 1c) zu vernichten. Vorsichtig die magische Klebeband abziehen die unteren Epidermis (Abbildung 1d) abzustreifen und Mesophyll - Zellen (1e) aus.
  5. Schneiden Sie den Autoklaven Band der Petrischale, mit Hilfe einer Pinzette zu bewegen , um das Band in die Petrischale und schwimmen auf der Enzymlösung (Abbildung 1f) zu passen, verlässt nach unten zeigt . Drehen, bei 60 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattformschüttler für 60 min, während der die Protoplasten werden in die Lösung freigesetzt werden.
  6. Pinzette benutzen zu entfernen und die Streifen des Autoklaven Band (1g) zu verwerfen und die Lösung pipettiert werden die Protoplasten (Figur 1h) in ein 50 ml konisches Röhrchen enthält. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze (wie ein P5000 Spitze oder ein P1000 Spitze mit dem Ende abgeschnitten).
  7. Zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 100 xg für 3 min bei 4 ° C und der Überstand mit einer Pipette entfernen. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist.
  8. 10 ml W5-Lösung zu den Protoplasten und resuspendieren durch das Rohr sanft wirbeln.
  9. Rest ist die Protoplasten auf Eis für 30-60 min. In diesem Schritt beurteilt Ausbeute von Protoplasten in einem Hämozytometer (1I) zu zählen.
  10. Sammle die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min bei 4 ° C und entfernt den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist.
  11. Resuspendieren der Protoplasten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Protoplasten / ml in MMg Lösung.

3. Protoplasten Transfection

  1. Fügen Sie 10 & mgr; l Reporter-Plasmid (2 ug / ul) zu einem 15 ml konischen Röhrchen.
  2. In 400 ul Protoplasten auf das Rohr.
  3. Fügen Sie ein Volumen (410 ul) PEG-Lösung und mischen durch das Rohr sanft 12-maliges Umdrehen der Protoplasten zu transfizieren.
  4. Nach 8-15 min incubation bei Raumtemperatur, verdünnt das Protoplasten-DNA-PEG-Mischung mit vier Bänden (1640 ul) W5-Lösung und mischen durch vorsichtiges sechsmal umgekehrt wird.
  5. Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wieder einmal vorsichtig, denn das Pellet sehr lose ist.
  6. Resuspendieren der Protoplasten in 1250 ul Imaging-Lösung.
  7. Aliquot 200 ul in sechs replizieren Wells einer 96-Well-Platte, füllen Sie alle leeren Brunnen mit W5-Lösung und versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff klaren Deckel geeignet für Leucht Bildgebung.

4. Imaging

  1. Übertragen Sie die Platte zu jeder Leucht Imaging Einrichtung geeignet für Pflanzen Bildgebung. Ändern Sie die Klebe Deckel auf den Platten 10-15 Minuten nach der Übertragung Kondensation und Druckdifferenzen zwischen den Vertiefungen zu vermeiden, dann Imaging starten. Lesen Sie alle die Platte ~ 45 min (3 sec pro Vertiefung) für fünf Tage bei Raumtemperatur.
    Beachten Sie dasHäufigkeit der Platte liest und die Lesezeit pro Vertiefung könnte auf dem Imaging-Setup abhängig.

5. Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die Lumineszenz Ergebnisse , eine Analyse - Software (zB Biologische Rhythmen Analyse - Software - System (BRASS) 22). Vergleichen Sie die Mutantenlinie zu Wildtyp-Kontrollen circadian Mängel aufzudecken.

Ergebnisse

Die Protoplasten von Wildtyp - Arabidopsis wurden zu den bekannten Takt Mutanten im Vergleich CCA1 / lhy (kurze Zeit Mutante 2), ztl (lange Zeit Mutante 23), und die Überexpression Linie CCA1 -OX (24 arrhythmic). LUC Reporter und bebildert in konstantes Licht auf einem Plattenleser über 5 Tage: Alle wurden mit dem CCA1pro transient.

Hier zeigen wir , dass in der CCA1 / lhy Mutante, die Freilaufzeit von circadian gesteuerte Genexpression verkürzt wird (Abbildung 2a), in Übereinstimmung mit der veröffentlichten analysierten Zeitraum von stabilen transgenen Expression von Leuchttaktmarkierungen 2,9. Die Periode der zirkadianen Schwingungen in Protoplasten der ZTL - Mutante ist länger als in Wildtyp (2b), in Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen aus Sämlingen, Zellsuspension cultures und Protoplasten 19,23,25.

Die Überexpression von CCA1 sperrt die Uhr in Morgen-Phase und der globalen Transkription wird arrhythmic 24. Konsequent beobachteten wir keine Schwingungen in CCA1pro: LUC - Expression in CCA1 -OX Protoplasten (Abbildung 2c).

figure-results-1
Abbildung 2: Protoplasten Circadian Rhythms Protoplasten von Col- 0, CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX transient mit dem CCA1pro umgewandelt wurden: LUC - Konstrukt und zirkadianen Rhythmen in Lumineszenz wurden über 5 Tage abgebildet (A - C). (D) Circadian Zeitraum Schätzungen basieren auf Lumineszenz Spuren in Col -0, CCA1 / lhy und ZTL (A - B). Micheine ± SEM, n = 3-5, t-Test p-Wert , wie angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Genotyp Period (Protoplasten) Periode (transgene) Berichtet von: Referenzen
Col- 0 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC in Col -0 (2)
CCA1 / lhy 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC in Col -0 (2)
~ 18 RNA in L er Hintergrund (9)
ztl 25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC in Ökotyp C24 (22)
CCA1 -OX arrhythmic arrhythmic pCCA1: LUC (LD nur Daten) (2)
arrhythmic RNA und Protein in Col -0 Hintergrund (23)

Tabelle 2: Circadian Rhythms in Protoplasten im Vergleich zu transgenen Keimlinge Die zirkadiane Periode von pCCA1. LUC - Expression in Protoplasten im Vergleich zu den Periodenlängen zunächst für die Mutation berichtet und, falls vorhanden, mit pCCA1: LUC - Expression in Col -0.

Diskussion

Hier stellen wir einen schnellen Test zirkadianen Zeitraum Defekte in Arabidopsis Linien zu ermitteln, einschließlich der Isolierung von Protoplasten, Transfektion und luminecent Bildgebung. Die zirkadiane Periode in Wildtyp - Arabidopsis und die Uhr - Mutanten CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX wurde aus Messungen der Lumineszenz von einem CCA1pro berechnet: LUC Reporter und fand aus ganzen Pflanzen zeit- erzeugt mit den veröffentlichten Daten konsistent zu sein raubend transgene Ansätze (Tabelle 2). Unter Verwendung dieses Assays Arabidopsis-Mutanten zu screenen, vermeidet die anfängliche Anforderung transgener Leuchtlinien zu erzeugen, was zeitaufwendig ist und möglicherweise nur zeigen, dass eine bestimmte mutierte Wildtyp-Rhythmen aufweist. Ein klarer Vorteil dieses Protokolls ist , dass jede Arabidopsis Linie in kurzer Zeit für veränderte zirkadianen Rhythmen Transkriptions gescreent werden können, die die Identifizierung von mehreren Genen in Pflanzen helfen beeinflussen Zeitnehmung.

Isolierung von Protoplasten kann mühsam sein, vor allem, wenn die mutierte Linie einen Schatten gestellt Phänotyp zeigt. Zuvor berichteten Verfahren für Protoplasten Erzeugung umfassen Blätter oder Sämlinge in dünne Streifen und Vakuum Schneiden der Streifen mit Enzymlösung infiltriert die Enzyme zu ermöglichen , um die Zellwände 26,27 erreichen. Die anschließende Verdauung erfordert mindestens 3 h Inkubation im Dunkeln die Protoplasten in die Enzymlösung zu lösen. Bei Vakuuminfiltration nicht angewendet wird, sollte die Inkubationszeit bis zu 18 Stunden wird empfohlen. In dem Protokoll hier vorgestellten ist nicht notwendig, Vakuuminfiltration, weil die Epidermiszellschicht undurchdringlich für die Enzyme durch ein Band entfernt wird. Wenn Protoplasten durch Schneiden Pflanzenmaterial zu erzeugen ist es notwendig, getrennte Protoplasten aus Zellwandtrümmer nach der Verdauung; Dies wird typischerweise durch Filtrieren der Lösung oder Reinigung auf einem Zucker Gradienten 27,26 erfolgen. Hier wird jede unverdauten Gewebe auf dem Autoklaven Band bleiben nachVerdauung, so Filtration und Zucker Gradientenreinigung der Protoplasten verzichtet werden kann. Es gibt eine Chance, dass die Belastung aus längeren Protoplastierung Verfahren die Lebensfähigkeit der Zellen und die innere Uhr beeinflusst. Das bandbasierte Protoplastierung Verfahren 20 visualisiert hier ergibt sich eine hohe Anzahl von Protoplasten; und die Lebensfähigkeit der Zellen über einen zirkadianen Zeitreihe gegeben und die Anpassungsperiodenlängen von Protoplasten und ganzen Sämlingen (Tabelle 2), die hier beschriebene Methode wird über alternative Verfahren bevorzugt Protoplasten zu erzeugen.

Der Transfektionsstufe des Protokolls ist ein wichtiger Schritt, dass die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten. Die PEG-Lösung kann die DNA in die Zelle geliefert werden, und beide Inkubationszeit in dieser Lösung (Schritt 3.4), und den Prozentsatz der PEG sollte empirisch bestimmt werden. Die Standardkonzentration beträgt 20%, mit geringeren Konzentrationen die Transformationseffizienz zu reduzieren und eine höhereKonzentrationen Lebensfähigkeit reduziert 28. Die Inkubationszeit so kurz wie 5 Minuten konnten effiziente Transfektion der Protoplasten 27 ergeben.

Die Protoplasten können auf jeder Leucht Imaging-Plattform abgebildet werden. In diesem Video haben wir einen Lumineszenz-Plattenleser ausgestattet mit Außenbeleuchtung (rot und blauen LEDs, 630 und 470 nm, jeweils bei einer kombinierten Intensität von ~ 20 & mgr; E) verwendet, die für die Hochdurchsatz-Screening und häufige Messungen ermöglicht. Andere Bildgebungsgeräte, die Lumineszenz, wie beispielsweise alternative Plattenleser oder Setups um eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) Kamera basierend erkennt, könnte genauso gut so lange angewendet werden, wie Beleuchtung für die Photosynthese zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung einer CCD-Kamera auf einem steuerbaren Schrank montiert ist, dass Licht und Temperatur programmiert werden können. Ein Nachteil ist die längere Aufnahmezeit, die Einführung längere Zeiträume der Finsternis, die Stress zu den Protoplasten zusätzlich dazu führen können, störening endogene Zeitnehmung. Unabhängig davon, welche experimentelle Plattform gewählt wird, die Anpassung der Einstellungen ist wahrscheinlich notwendig sein, im Vergleich zu Einstellungen für Sämlinge oder reifen Pflanzen. Nach unserer Erfahrung bei der Transfektion und / oder Luciferin in dem Abbildungspuffer die Konzentrationen von Reporterplasmid Erhöhung könnte keine erratischen oder schnell dämpfen Rhythmen beheben, das in ersten Experimenten auftreten könnten.

In zukünftigen Experimenten kann die hier beschriebene Methode angewendet, um die zirkadianen Phänotyp jeder Mutante von Arabidopsis Linie zu studieren. Mit geringfügigen Modifikationen könnte die Wirkung von zB verschiedene Medikamente auf timekeeping in diesem Setup untersucht werden. Darüber hinaus kann die Transfektion modifiziert werden , um Gen künstliche microRNA enthalten 19 zum Schweigen zu bringen, die Vielseitigkeit dieses Protokolls zu erweitern. Protokolle Reisprotoplasten zu erzeugen , sind gut etablierte 29 und das Bildgebungsprotokoll hier vorgestellten könnte gleichermaßen angewendet werden unsere u zu fördernERSTÄNDIGUNG der Uhr in wirtschaftlich wichtigen monokotylen Kulturpflanzen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten Prof. David Somers und Dr. Jeongsik Kim für das Luciferase-Reporter-Plasmid und die anfängliche Methodenentwicklung danken. Prof. Karen Halliday hat freundlicherweise alle zirkadianen Mutantenlinien zur Verfügung gestellt, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Forschung wurde durch Forschungsstipendien der Royal Society RS120372 und RS140275 unterstützt. GvO ist Research Fellow (UF110173) der Royal Society University.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore219466
Pectinase R10Sigma AldrichP2401
D-MannitolSigma AldrichM4125 
CaCl2Sigma AldrichC4901
KClSigma AldrichP3911
RinderserumalbuminSigma AldrichA4503
MESAcros Organics327765000
NaClAcros Organics327300010
GlucoseFischer ScientificG/0500/60
MgCl2Sigma AldrichM2670
Polyethylenglykol (PEG) 4000Acros Organics434630010
fötales Rinderserum Sigma AldrichF4135
D-Luciferin, FireflyBiosynth AGL-8200Luciferin-Pulver in 0,1 M Trisphosphatpuffer pH 8,0 bis zu einer Konzentration von 50 mM
Ampicillinauflösen Sigma AldrichA9618
Comply Dampfindikatorband3M1222
Magic Tape3M819-1460
PetrischalenWissenschaftlicher LaborbedarfSLS2002
Microtiterplatten, 96 Well, flacher Boden, weißGreiner Bio-One655075
TopSeal-A, Klebedeckel für 96-Well-PlattenPerkin Elmer6050195
Spritze, 10 ml, ohne NadelBD Plastipak302188
Spritzenfilter 0,22 µ mMerckMillipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)Kostenloser Download bei amillar.org
QIAfilter Maxiprep KitQiagen12262
Modifizierte Fuch-Rosenthal Zählkammer, DoppelzelleHawksleyAC6000
HellfeldmikroskopOptika MikroskopeB-150POL-B
LB942 TriStar2 Multimode-Reader, mit LumineszenzmodulBerthold Technologies Ltd57947/57948

Referenzen

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968(2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130(2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16(2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30(2011).

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Analyse der circadianen PeriodeProtoplastenisolierunglumineszierender ReporterProtoplastentransfektionScreening des circadianen Ph notypsLumineszenz Imagingfreilaufende Periodekonstante LichtbedingungenAnalyse biologischer Rhythmen
Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter
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