Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Varianten sind Werkzeuge zur Untersuchung von Proteinlokalisierung und Dynamik von Ereignissen wie Zytoskelett-Umbau und Vesikeltransport in lebenden Zellen weit verbreitet. Quantitative Methoden unter Verwendung von chimären GFP-Fusionen wurden für viele Anwendungen entwickelt; jedoch GFP ist etwas resistent gegen Proteolyse, wodurch seine Fluoreszenz bleibt im Lysosom / Vakuole, die Quantifizierung von Frachthandels in der endocytischen behindern können. Ein alternatives Verfahren zur Quantifizierung Endozytose und post-endocytic Handel Ereignisse nutzt superecliptic pHluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP, die in sauren Umgebungen abgeschreckt wird. Chimäre Fusion von pHluorin zum Zytoplasmaschwanz von Transfracht-Proteine führt zu einer Dämpfung der Fluoreszenz bei der Gründung der Ladung in multivesicular Körper (MVBs) und Auslieferung an die Lysosomen / Vakuole Lumen. Somit Löschung der Vakuole Fluoreszenz erleichtert quantifiKation der Endozytose und der frühen Ereignisse im endocytischen. Dieses Papier beschreibt Methoden pHluorin-markierte Frachten für die Quantifizierung der Endozytose über Fluoreszenzmikroskopie sowie populationsbasierten Assays Durchflusszytometrie verwendet wird.
Einleitung
Vesikeltransport spielt eine wichtige Rolle Organell Identität und Funktion in eukaryontischen Zellen beibehalten wird, und ist ein Schlüsselmechanismus Protein und Membranzusammensetzung der einzelnen zellulären Kompartimenten zur Regulierung. An der Plasmamembran, Fusion von Vesikeln Exozytose liefert neue Proteine und Membranen auf der Oberfläche der Zelle, während die erzeugten Bläschen durch Endozytose Membran und Proteine von der Oberfläche zum Lysosom zur anschließenden Wiederverwertung oder Targeting entfernen. Somit ist Endozytose wichtig für die Nährstoffaufnahme und für Reaktionen auf die extrazelluläre Umgebung. Exozytose und Endozytose werden ausgewo....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Lösungen und Medien
- Bereiten Sie die folgenden Aktien, Medien und Platten:
- Zur Vorbereitung 10x YNB, lösen sich 67 g Hefe-Stickstoffbasis Aminosäuren in 1 l Wasser fehlt. Sterilisieren durch Filtration durch ein 0,22 um-Nitrocellulosefilter.
- Bereiten Sie YNB-Medium mit 1x YNB (von 10fach) mit 2% Dextrose (aus einer sterilen 50% w / v Lager) und 1x Aminosäure / Nährstoffmischung (von 100x Lager, siehe Schritt 1.1.4). Für Plasmid-Selektion, lassen Sie einzelne Aminosäuren oder Nährstoffe nach Bedarf. Zur Induktion der Expression MUP1 zusätzlich Methionin aus der Aminosäure / Nährstoffmischung auszulassen.
- Bereiten Sie YNB-Plat....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Steady-State - Lokalisierung und Quantifizierung des konstitutiv internalisiert endocytic Fracht Protein STE3
Um zu demonstrieren, dass pHluorin-tagged cargos kann zur Quantifizierung von Endozytose in lebenden Zellen, Lokalisierung von chimären GFP und pHluorin Fusionen mit der zytoplasmatischen C-terminalen Schwanz von STE3 verwendet werden, die a-Faktor-Pheromon-Rezeptor in Hefe, wurden ver.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Anwendungen von pHluorin zur Quantifizierung von endocytischen Ereignisse in Hefezellen macht von Transmembran- cargos in der die fluoreszierende Markierung an den zytoplasmatischen Schwanz des Proteins (1A) fusioniert ist. Für die Tests hier beschriebenen Frachten sind hell fluoreszierende, wenn die pHluorin Tag neutralen Umgebungen ausgesetzt ist, aber abgeschreckt werden, wenn die pHluorin Tag sauren Bedingungen trifft. So a pHluorin-markierte endocytic Ladung leicht an der zytoplasmatischen Gesicht .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Danksagungen
Wir danken Gero Miesenböck und Tim Ryan für das Teilen von pHluorin cDNA, die zur Erzeugung von Reagenzien in dieser Studie verwendet wurde, Nathan Wright, Joanna Poprawski und Lydia Nyasae für die hervorragende technische Unterstützung, Mitgliedern des Wendland-Labors für hilfreiche Diskussionen und Michael McCaffery und Erin Pryce vom Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) für Ratschläge und Unterstützung bei der Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (an B.W., GM60979) und der National Science Foundation (an B.W., MCB 1024818) unterstützt. K.W. wurde teilweise durch ein Ausbildungsstipendium der....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adenin | Sigma | A8626-25G | Zur Herstellung von Aminosäuregemischen und Stammlösungen |
| Bacto-Agar | Fisher | BP1423-2 | Zur Herstellung von Plattenmedien |
| BD Difco Hefe Stickstoffbase (ohne Aminosäuren) | BD | 291920 | Zur Herstellung von flüssigen und Plattenmedien |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Zur Beschichtung der Kammer Objektträger |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Verwendung zur Herstellung von flüssigen und plattenförmigen Medien |
| L-Histidin | Fisher | BP382-100 | Verwendung zur Herstellung von Aminosäuremischung und Stammlösung |
| L-Leucin | Acros | 125121000 | Verwendung zur Herstellung von Aminosäuremischung und Stammlösung |
| L-Lysin | Fisher | BP386-100 | Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung |
| verwenden L-Methionin | Fisher | BP388-100 | Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung |
| verwenden L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung |
| verwenden L-Tyrosin | Acros | 140641000 | Zur Herstellung einer Aminosäuremischung |
| verwenden Nunc Lab-Tek Kammeriges Deckglas ( 8-Well) | Thermo Scientific | 155411 | Zur Verwendung für kinetische und Endpunkt-Assays zur Mup1-pHluorin-Internalisierung |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung |
| Axiovert 200 Inverses Mikroskop | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Zeiss | Objektiv sollte 100X betragen, 1,4 NA oder höher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | sollte einen Dynamikbereich von 12 Bit oder höher haben | |
| X-Cite 120PC Q Beleuchtungsquelle | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 Software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referenzen
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endo....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
