Methodenartikel

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

DOI:

10.3791/54587

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23. Oktober 2016

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.

Zusammenfassung

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Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Varianten sind Werkzeuge zur Untersuchung von Proteinlokalisierung und Dynamik von Ereignissen wie Zytoskelett-Umbau und Vesikeltransport in lebenden Zellen weit verbreitet. Quantitative Methoden unter Verwendung von chimären GFP-Fusionen wurden für viele Anwendungen entwickelt; jedoch GFP ist etwas resistent gegen Proteolyse, wodurch seine Fluoreszenz bleibt im Lysosom / Vakuole, die Quantifizierung von Frachthandels in der endocytischen behindern können. Ein alternatives Verfahren zur Quantifizierung Endozytose und post-endocytic Handel Ereignisse nutzt superecliptic pHluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP, die in sauren Umgebungen abgeschreckt wird. Chimäre Fusion von pHluorin zum Zytoplasmaschwanz von Transfracht-Proteine ​​führt zu einer Dämpfung der Fluoreszenz bei der Gründung der Ladung in multivesicular Körper (MVBs) und Auslieferung an die Lysosomen / Vakuole Lumen. Somit Löschung der Vakuole Fluoreszenz erleichtert quantifiKation der Endozytose und der frühen Ereignisse im endocytischen. Dieses Papier beschreibt Methoden pHluorin-markierte Frachten für die Quantifizierung der Endozytose über Fluoreszenzmikroskopie sowie populationsbasierten Assays Durchflusszytometrie verwendet wird.

Einleitung

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Vesikeltransport spielt eine wichtige Rolle Organell Identität und Funktion in eukaryontischen Zellen beibehalten wird, und ist ein Schlüsselmechanismus Protein und Membranzusammensetzung der einzelnen zellulären Kompartimenten zur Regulierung. An der Plasmamembran, Fusion von Vesikeln Exozytose liefert neue Proteine ​​und Membranen auf der Oberfläche der Zelle, während die erzeugten Bläschen durch Endozytose Membran und Proteine ​​von der Oberfläche zum Lysosom zur anschließenden Wiederverwertung oder Targeting entfernen. Somit ist Endozytose wichtig für die Nährstoffaufnahme und für Reaktionen auf die extrazelluläre Umgebung. Exozytose und Endozytose werden ausgewogen Plasmamembranoberfläche zu regulieren, und der Umsatz von beschädigten Proteinen zu ermöglichen.

Studien in Hefe und Säugerzellen haben eine große Anzahl von Proteinen in der Endozytose, sowie mehrere endocytic Wegen beteiligt identifiziert, die zu einer Vielzahl von en Internalisierung spezifischer Frachten oder diese Handlung als Reaktion fördernbungsbedingungen. Die am besten untersuchten Weg ist Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), in der Clathrin und zytosolischen akzessorischen Proteine ​​in einer Schichtstruktur zusammenstellen, die im Entstehen begriffenen endocytic Vesikel zu stabilisieren. Experimente in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae haben wichtige Einblicke in die Dynamik und die Reihenfolge der Rekrutierung ergab für viele endocytic Proteine 1-3. Bemerkenswerterweise wird die CME Maschinen stark durch die Evolution konserviert, so dass die Mehrheit der CME-verwandten Proteinen in Hefe menschliche Orthologe haben; Somit Hefe Knospung hat ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen der Endozytose gegeben, die in höheren Eukaryonten konserviert sind. Zum Beispiel Studien Bäckerhefe mit bestimmt, dass die Bildung und Reifung von CME-Strukturen (als kortikalen Aktin-Patches in Hefe bezeichnet) umfasst die schrittweise Einstellung vieler Proteine, beginnend mit Clathrin und Fracht-bindenden Adapterproteine, gefolgt von Einstellung zusätzlicher endocytic Zubehör Proteine,Aktivierung von Arp2 / 3-vermittelte Aktin - Polymerisation und die Rekrutierung von Proteinen in Vesikel scission 1,2 beteiligt. Die Rekrutierung von CME Maschinen Proteine ​​Aktin-Patches zu kortikalen ist eine hoch geordnete und stereotypisch Prozess, und die genaue Reihenfolge der Rekrutierung für viele Proteine ​​in Bezug auf andere Komponenten der CME Maschinen etabliert. Wichtig ist , dass die jüngsten Studien haben eine ähnliche Reihenfolge der Rekrutierung für CME Proteine bei Clathrin beschichteten Gruben in Säugetierzellen 4 bestätigt.

Neben CME besitzen viele Zelltypen eine oder mehrere Clathrin-unabhängige endocytic (CIE) Wege , die auf alternative Mechanismen beruhen Vesikelbildung und Internalisierung von der Plasmamembran 5-7 zu fördern. In Hefe identifizierten wir vor kurzem eine CIE - Weg, der die kleine GTPase Rho1 und seine Aktivierung Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF), Rom1 8,9 verwendet. Rho1 aktiviert die formin Bni1 Actinpolymerisation 1 zu fördern0,11, die für diese Form der Clathrin-unabhängige Endozytose in Hefe 12 erforderlich ist. Außerdem rekrutieren die α-Arrestin Familie von Proteinen , die Ubiquitin - Ligase Rsp5 zur Ladung Ubiquitinierung und anschließende Internalisierung durch CME 13-17, und auch fördern Ladung Internalisierung über den CIE - Weg, möglicherweise durch direkte Interaktion mit Proteinen beteiligt in CIE 18 fördern. Eine Vielzahl von CIE Wege existieren auch in Säugerzellen, einschließlich Clathrin-unabhängige und phagozytischen Bahnen , die auf der Rho1 Ortholog verlassen, RhoA 9,19. Die Rolle von RhoA in Säuger CIE ist wenig bekannt; also Studien in Bäckerhefe kann zusätzliche mechanistische Erkenntnisse liefern, die auf Säugetier CIE anwendbar sind.

Eine genaue Quantifizierung von endocytic Ereignisse können, Endozytose bei der Regulierung der wichtige Informationen über die Rollen von spezifischen Proteinen liefern und die Auswirkungen der Mutationen auf die Ladung Verinnerlichung oder progressio offenbarenn durch den endocytischen. Zu diesem Zweck können biochemische Verfahren verwendet werden, Liganden-Aufnahme zu überwachen oder Abbauraten von endocytischen Frachtproteinen zu messen. In lebenden Zellen Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Frachten von Interesse ermöglicht die direkte Visualisierung von Frachtverkehr. Allerdings GFP-markierten Frachten sind von begrenztem Nutzen für die Quantifizierung der Endozytose, weil GFP zu einem Abbau in den Lysosomen (oder Vakuole in Hefe) resistent ist. Außerdem ist GFP - Fluoreszenz nur teilweise empfindlich gegenüber Änderungen in pH und bleibt innerhalb der Vakuole Lumen 20,21 nachweisbar. Folglich Fluoreszenz des GFP-Tag besteht in der Vakuole, lange nachdem der Rest der Ladung abgebaut worden ist, und ganze zellbasierten Quantifizierung von Ladungsintensität kann durch langfristige GFP-Fluoreszenz in die Vakuole ungenau sein.

Um die Nachteile von vakuolären GFP-Fluoreszenz zu überwinden, wir zuvor Verwendung superecliptic pH gemachtluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP , die hell bei neutralem pH fluoresziert, verliert aber Fluoreszenz in sauren Umgebungen , wie beispielsweise das Lumen der Vakuole / Lysosomen 20,22,23. Eine pHluorin Tag auf der zytoplasmatischen Schwanz von endocytischen cargos Platzierung erlaubt die Visualisierung der Frachten an der Plasmamembran und am frühen Endosomen, in denen die pHluorin Tag in das Zytoplasma (1A) ausgesetzt bleibt. Bereits Endosomen reifen, die Endosomen Sortierkomplexe , die für Transport (ESCRT) Maschinen - Pakete oberflächen lokalisierte Frachten in Vesikeln, die in das Lumen des Endosomen Knospe, Erzeugung multivesicular Körper (MVBs) 24. Für Frachten, die in interne MVB Vesikel aufgenommen wurden, steht die pHluorin Tag in Richtung der Vesikel Lumen. Interne MVB Vesikel werden angesäuert; so verlieren pHluorin-markierte Frachten Fluoreszenz auf frühe Endosomen , wie sie reifen in MVBs 20. Die anschließende Verschmelzung der MVB mit der Vakuole liefert die MVB luminalen Inhaltefür den Abbau und pHluorin Tags bleiben in der sauren Umgebung der Vakuole Lumen gequencht.

Dieses Dokument enthält detaillierte Beschreibungen der quantitativen endocytic Assays Cargos mit zytoplasmatischen pHluorin Tags in Hefe verwendet. Die Stämme pHluorin-markierte Frachten exprimieren, können in kinetische und / oder Endpunkt-Assays verwendet werden, abhängig von den Eigenschaften und den Handel Verhalten der spezifischen Ladung. Darüber hinaus sind einige pHluorin-tagged cargos zugänglich Hochdurchsatz-Analyseverfahren, einschließlich Durchflusszytometrie. Wichtig ist, dass die pHluorin Tag ein vielseitiges Werkzeug für die in lebenden Zellen endocytic Ereignisse zu studieren, so dass eine Quantifizierung der Endozytose und den Vergleich von endocytic Funktion in Wildtyp und Mutantenstämmen.

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Protokoll

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1. Lösungen und Medien

  1. Bereiten Sie die folgenden Aktien, Medien und Platten:
    1. Zur Vorbereitung 10x YNB, lösen sich 67 g Hefe-Stickstoffbasis Aminosäuren in 1 l Wasser fehlt. Sterilisieren durch Filtration durch ein 0,22 um-Nitrocellulosefilter.
    2. Bereiten Sie YNB-Medium mit 1x YNB (von 10fach) mit 2% Dextrose (aus einer sterilen 50% w / v Lager) und 1x Aminosäure / Nährstoffmischung (von 100x Lager, siehe Schritt 1.1.4). Für Plasmid-Selektion, lassen Sie einzelne Aminosäuren oder Nährstoffe nach Bedarf. Zur Induktion der Expression MUP1 zusätzlich Methionin aus der Aminosäure / Nährstoffmischung auszulassen.
    3. Bereiten Sie YNB-Platten mit 1x YNB (von 10fach), 2% Dextrose (aus einer sterilen 50% w / v Lager), 0,7 g / l Aminosäure / Nährstoffmischung (siehe Schritt 1.1.5) und 2,5% Agar. Bereiten Plattenmedium durch 25 g Agar Autoklavierung und 0,7 g Aminosäure / Nährstoffmischung pro 860 ml Wasser. Lassen Sie die Mischung auf 55 ° C abkühlen, fügen dann 100 ml 10x YNB und 40 ml of 50% Glucose. Platten gießen (etwa 30 ml Medium pro 10 cm Schale), ermöglichen es dem Medium bei Raumtemperatur, und speichern Platten bei 4 ° C zu verfestigen.
    4. Bereiten 100x Aminosäure / Nährstoff-Stammlösung (für flüssiges Medium), indem die folgende in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst: 0,1 g L-Methionin, 0,3 g jeweils von L-Leucin und L-Lysin und 0,2 g jeweils von L-Histidin , L-Tryptophan, Adenin und Uracil (andere Aminosäuren und Nährstoffe können als für bestimmte Stämme erforderlich enthalten sein). Verwenden Sie sanfte Wärme bei Bedarf zu lösen und sterilisieren durch einen 0,45 um Nitrocellulosefilter. Bei einer Raumtemperatur unter Lichtschutz. Für Plasmid-Selektion, Stammlösungen fehlen spezifische Komponenten herzustellen, wie benötigt wird.
    5. Bereiten Aminosäure / Nährstoffmischung (für Platten) durch Vereinigen der folgenden: 0,5 g Adenin, 4 g L-Leucin und 2 g jeweils L-Histidin, L-Lysin, L-Methionin, L-Tryptophan, L- Tyrosin und Uracil. Grind mit einem Mörser und Stößel, und speichern Sie mit ProSchutz vor Licht. Für Plasmid-Selektion, bereiten Mischungen bestimmte Komponenten nach Bedarf fehlt, und verwenden Sie 0,7 g Mischung Aminosäure pro Liter Plattenmedium (siehe Schritt 1.1.3).
  2. Bereiten 8-Well-Kammerobjektträger für die Mikroskopie durch Beschichten der Oberfläche des Schiebers mit Concanavalin A (ConA). Zu jeder Vertiefung der Kammer Rutsche, werden 25 & mgr; l von 2 mg / ml ConA in Wasser gelöst. Mit Hilfe einer Pipettenspitze, verbreiten sie das ConA über die Bodenfläche des Bohrlochs, erlauben dann die Folie an der Luft trocknen bei Raumtemperatur für mindestens 4-8 Stunden. Idealerweise verwenden Kammer gleitet innerhalb von 24 Stunden von ConA-Beschichtung.
  3. Generieren Sie Hefestämme mit in-frame - Fusionen von GFP oder pHluorin zum endocytic Ladung von Interesse unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierenden Integrationsverfahren in Longtine et al. und Goldstein und McCusker 25,26.
    HINWEIS: Plasmide , die pHluorin Kassetten mit Resistenzgenen für Kanamycin - Tagging (KANMX6) und Nourseothricin ( NATMX4) wurden zuvor 20 beschrieben.
    1. Amplifizieren GFP oder pHluorin Kassetten enthält selektierbare Marker mit Primern , die zusätzliche Sequenzen spezifisch zu der Stelle der genomischen Integration 20,25.
    2. Transformieren des resultierenden PCR - Produkts in die gewünschte Hefestamm mit dem Lithiumacetat - Verfahren 27.
    3. Auswählen, für die Integration der Kassette von Zellen auf YPD-Platten, die die geeignete Arzneimittel wächst. Zur Herstellung von Platten, Autoklaven 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 0,1 g Tryptophan und 25 g Agar-Agar in 960 ml Wasser. Bevor Platten gießt, erlauben die Mischung auf 55 ° C abkühlen, dann werden 40 ml 50% Glucose und entweder G418 in einer Endkonzentration von 200 ug / ml für KANMX6 Selektion oder Nourseothricin bis zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml für NATMX4 Auswahl.
    4. Bestätigen Integration des GFP oder pHluorin Tag in einzelnen Kolonien durch PCR und / oder Western-Blotting unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper,sowie durch die Detektion des markierten Proteins durch Fluoreszenzmikroskopie 20.
      HINWEIS: Specific Hefestämme und Plasmide in dieser Studie verwendet werden in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.

2. Endpunkttest für Steady-State-Fluoreszenz von konstitutiv internalisierten endocytische Fracht

  1. Impfen Zellen (~ 3 kleine Kolonien) in 5 ml YNB Medium ohne Aminosäuren oder Nährstoffe wie für Plasmid Wartung erforderlich (falls zutreffend). Wachsen Zellen für 16-24 Stunden in einem Orbital Schüttelinkubator bei 30 ° C, mit 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Alternativ Streifen a ~ 1-2 mm Kolonie von Zellen auf einer YNB Platte Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion fehlt und die Zellen wachsen über Nacht bei 30 ° C.
  2. Messung der Dichte (OD 600) jeder Übernachtkultur unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bereiten Sie eine 5 ml Verdünnung bei 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB Medium ohne Aminosäuren oder Nährstoffe für plaSmid Wartung und unter Schütteln bei 30 ° C für etwa 3 h wachsen. Bei der Verwendung von Zellen auf einer Platte ausgestrichen, überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 2.4 (siehe unten).
  3. Messung der Dichte (OD 600) von Zellen, die nun zwischen 0,6-1,0 OD 600 / ml liegen. Übertragung von 1,5 ml der Kultur zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen bei 8000 rpm (6800 × g) für 2 min. Entfernen 1475 ul Überstand.
  4. Bringen Zellen einem Fluoreszenzmikroskop. Vor jeder Probe Bildgebung, bereiten eine Folie, indem die Zellen im verbleibenden Medium resuspendieren und montieren 3 ul Zellsuspension unter einem Deckglas. Alternativ bereiten 8-Well-Kammerobjektträger wie in Protokoll 3, mit YNB-Medium als geeignet für das Plasmid weiter unten beschrieben. Idealerweise Bildzellen mit einem 100X, 1.4 oder höhere numerische Apertur (NA) -Ölimmersionsobjektiv Objektiv, ein 12- oder 16-Bit-Kamera und Anregung / Emissionsfilter für GFP-Fluoreszenz optimiert.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von Zellen durch Ausstreichen o gewachsenna Platte, bereiten Sie die Folie, indem 3 ml frisches YNB-Medium auf einem Deckglas. Mit Hilfe einer Pipettenspitze, sammeln eine kleine Kolonie von Zellen von der Platte, verteilen die Zellen in das YNB-Medium, und montieren Sie die resultierende Suspension auf einen Glasobjektträger unmittelbar vor der Belichtung.
  5. Bild 4-6 Zufallsfelder von Zellen für jede Bedingung, die gleichen Erfassungsparameter verwendet (dh Filtersätzen und Belichtungszeit) für alle Bilder in einem Experiment.
    HINWEIS: für jedes Feld ein Hell- oder DIC Bild Sammeln kann für Zellen nützlich sein, wo das pHluorin Signal in MVB und vacuolar Fächer gelöscht wird.
  6. Quantifizieren Fluoreszenzintensität von mindestens 30 bis 50 Zellen für jede Bedingung (siehe Protokoll 5).

3. Kinetic Assay zur Quantifizierung der Endozytose von Cargos, die Regulated Endozytose unterziehen

  1. Impfen 2-3 Kolonien von Hefezellen (etwa 2 mm Durchmesser pro Kolonie) in 5 ml YNB-Medium Methionin fehlt und fügenitional Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion erhalten bleibt. Wachsen Kulturen für 16-24 h bei 30 ° C unter Schütteln.
    HINWEIS: In diesem Papier, Protokolle für regulierte endocytic Cargoproteine ​​zu studieren wird Verwendung des Methionin-Permease, MUP1 machen. Andere Ladungen, die regulierte Endozytose unterziehen, sind ebenfalls geeignet für mit pHluorin Tagging (beispielsweise das Uracil-Permease Fur4, die an der Plasmamembran in Abwesenheit von Uracil ansammelt, und internalisiert in Reaktion auf extern angelegte uracil); für diese Frachten, sollten Medienbedingungen die spezifischen Ausdruck, Induktion und Internalisierung Bedingungen für die Fracht zu reflektieren modifiziert werden.
  2. Messung der Dichte (OD 600) jeder Übernachtkultur etwa 3 Stunden vor der Bildgebung. Bereiten Sie eine 5 ml Verdünnung bei 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmiderhalt und wachsen bei 30 ° C unter Schütteln.
  3. Pre-äquilibrieren die MikrosCopes Klimakammer oder erwärmt Stufe (falls vorhanden) auf 30 ° C während der 3-stündigen Inkubation von Schritt 3.2.
  4. 1 ml der Zellkultur zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen bei 8000 rpm (6800 × g) für 2 min. Entfernen 975 & mgr; l Überstand.
  5. Bereiten Sie eine ConA-behandelt, 8-Well Glasbodenkammer Rutsche für die Bildgebung (Protokoll 1.2).
  6. In 200 ul YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion zu jeder Vertiefung. Resuspendieren des Zellpellets aus Schritt 3.4 in dem verbleibenden Überstand, und fallen auch 2,5 ul der Zellsuspension in der Mitte von jedem. Disperse Zellen über die Oberfläche des Bohrlochs durch Pipettieren von oben und unten, und lassen Sie Zellen für 5-10 Minuten absetzen.
  7. Legen Sie die Kammer gleiten auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ins Gleichgewicht gebracht zu 30 ° C (siehe Schritt 3.3). Suchen Sie ein Feld von Zellen unter Verwendung von Hellfeldbeleuchtung.
  8. Je 50 ul YNB-Medium, enthaltend 100 ug / ml Methionin(Vorgewärmt auf 30 ° C) zu den 200 ul Medium in das Bohrloch eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml zu erhalten. Vermeiden Sie das Medium in das Bohrloch, um Aufbrechen der Zellen ein Aufschwimmen von unten zu verhindern.
  9. Lassen Sie die Zellen für 2 min äquilibrieren vor der Bilderzeugung begonnen wird. Unmittelbar vor dem ersten Bild aufzeichnen, das Mikroskop auf die gewünschte Fokusebene einzustellen (typischerweise ein äquatoriales Fokalebene funktioniert am besten).
  10. Erwerben GFP und Hellfeld- (oder DIC) Bilder in 5 min Abständen für 45-60 min, für alle Bilder in einer Zeitreihe identische Akquisitionsparameter (zum Beispiel 100 × 1,4 NA Öl-Immersionsobjektiv und 500 msec Akquisitionszeit unter Verwendung von GFP-Filter, 100 ms Erfassungszeit unter Verwendung von DIC-Filter).
    Hinweis: Wenn die Bühne und Imaging-Software des Mikroskops nicht zur automatischen Korrektur der Fokusebene Drift ermöglichen, kann es notwendig sein, manuell vor jeder Bildgebungs Zeitpunkt den Fokus neu einzustellen. Darüber hinaus wird Akquisitionszeitenvariieren zwischen Mikroskopen aufgrund der Unterschiede in der Beleuchtung und Filter und optimalen Bedingungen sollten manuell vor dem Beginn des Experiments bestimmt werden. Wenn ein endocytic Ladung andere als MUP1 verwendet wird, kann es notwendig sein, die Erfassungszeit und Imaging-Intervalle zu ändern, sowie die Dauer des Experiments, die Internalisierung Kinetik der Güter zu reflektieren.
  11. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von einzelnen Zellen zu jedem Zeitpunkt (siehe Protokoll 5) und Express-Werte als Prozentsatz der anfänglichen Intensität des ersten Bildes.

4. Endpunkttest zur Quantifizierung von endocytische Cargos, die Regulated Endozytose unterziehen

  1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung wie in Protokoll 3 beschrieben (Schritte 3.1 bis 3.6).
  2. Bild 4-5 Zufallsfelder von Zellen für jede Bedingung unmittelbar vor Methionin Zugabe Hellfeld- und GFP-Filter-Sets.
  3. In 50 ul YNB-Medium, das 100 ug / ml Methionin (Vorkriegsmed bis 30 ° C) zu den 200 ul Medium in das Bohrloch eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml zu erhalten. Vermeiden Sie das Medium in das Bohrloch, um Aufbrechen der Zellen ein Aufschwimmen von unten zu verhindern.
  4. Bild 4-5 Zufallsfelder der Zellen 30 min nach Zugabe von Methionin, unter Verwendung der gleichen Erfassungsparameter wie für die 0 Minuten-Zeitpunkt (Schritt 4.2).
  5. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von mindestens 30-50 Zellen für jeden Zeitpunkt (siehe Protokoll 5). Express-Werte als Prozentsatz der MUP1-pHluorin nach 30 min internalisiert unter Verwendung der Formel: [mittlere Intensität bei 0 min - mittlere Intensität bei 30 min] / [mittlere Intensität bei 0 min] x 100%.
    . HINWEIS: Es ist möglich, gleichzeitig durch eine Staffelung der Startzeit von jedem Test bis zu acht Endgeräte - Tests durchführen Tabelle 3 zeigt ein Beispiel - Workflow für acht gleichzeitige Assays.

5. Post-Akquisition-Analyse

  1. Export Bilder von Erfassungssoftware als 16-Bit-tagged-Bilddateiformat (.tif oder .tiff-Format).
    HINWEIS: Andere Dateiformate können ebenfalls geeignet sein, und idealerweise lossless Komprimierungsalgorithmen verwenden. 8-Bit-Bilder sind in der Regel nicht geeignet für die Quantifizierung.
  2. Öffnen Sie Dateien ImageJ Software (frei verfügbar auf 'Open' Option im Menü "Datei" verwenden. Verwenden Sie das Fluoreszenzbild für die Quantifizierung und die Hell- / DIC Bild als Referenz die Position von Zellen zu identifizieren und tote Zellen auszuschließen (falls vorhanden ), die dunkler als lebende Zellen erscheinen, wenn sie von DIC gesehen und sind autofluoreszenten, wenn sie mit GFP Anregungs- / Emissionsfiltern betrachtet.
  3. Führen Sie eine Untergrundsubtraktion auf dem Fluoreszenzbild. Für Bilder mit einem unebenen Hintergrundsignal, verwenden Sie den 'Untergrundsubtraktion' Algorithmus im "Process Menü 'gefunden. Verwenden Sie die Standardeinstellung (Rollkugelradius von 50 Pixel), die für die Quantifizierung der Regel ausreichend ist.
    HINWEIS: Eine alternative background Subtraktionsverfahren für Bilder mit einheitlichen Hintergrund wird in Schritt 5.3.1.-5.3.2 beschrieben; funktioniert jedoch das obige Verfahren auch für einheitlichen Hintergrund.
    1. Für Bilder mit einheitlichen Hintergrund ( das heißt, Hintergrundintensität an allen Kanten annähernd konstant und in der Mitte des Bildes), führen Sie eine manuelle Untergrundsubtraktion. Klicken Sie auf die Schaltfläche im Haupt ImageJ Fenster gefunden "freihändig Auswahl" und wählen 3-5 zufälligen Regionen innerhalb des Bildes, die Zellen nicht enthalten.
    2. Öffnen Sie die 'Set-Messungen "Funktion befindet sich in der" Analysieren "Wählen Sie im Menü" mittleren Grauwert' Parameter, und messen Intensitätswerte mit Hilfe der "Maßnahme" Funktion (auch im "Analysieren" Menü). Berechnen Sie den Mittelwert aus den 3-5 gemessen Regionen und aus allen nachfolgenden Messungen in diesem Bild zu subtrahieren.
  4. Zur Quantifizierung der kinetischen Assays (Protokoll 3), erzeugen eine einzelne, gestapelte Bild für die timE-Serie. Öffnen Sie die Fluoreszenzbilder von jedem Zeitpunkt in chronologischer Reihenfolge und erzeugen einen Stapel, die "Bilder zu Stack 'mit der Funktion (im Menü' Bild 'gefunden, unter dem Stapel Untermenü).
  5. Skizzieren Sie eine Zelle, die die freihändige Auswahlwerkzeug verwenden, um sicherzustellen, die gesamte Zelle zu schließen, aber so wenig Fläche außerhalb der Zelle wie möglich.
  6. Messen Sie die folgenden Parameter: 'Area, Integrierte Dichte "und" mittleren Grauwert'. Wählen Sie die Parameter, die 'Set-Messungen "Funktion, die sich im" Analysieren "Menü.
    HINWEIS: Integrierte Dichte entspricht der Summe aller Pixelintensitäten innerhalb der gewählten Region und mittleren Grauwert entspricht [Integrierte Dichte / Area], die Intensitätswerte für die Zellgröße korrigiert.
  7. Öffnen Sie die "ROI-Manager" befindet sich in der "Analysieren" im Menü unter dem "Extras" Untermenü. Im ROI-Manager-Fenster klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" den markierten regio eingebenn als neue Region von Interesse (ROI).
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.4 bis 5.6 für die verbleibenden Zellen in dem Bild. Schließen Sie alle toten Zellen wie beurteilt durch Hell- / DIC und Fluoreszenz (tote Zellen dunkler erscheinen in DIC Bilder und haben autofluoreszenten Cytoplasma - Signal , wenn sie mit GFP Anregung / Emission gesehen; siehe Abbildung 2F), und alle Zellen, die den Rand des Bildes berühren. Speichern Sie die ausgewählten ROIs als ZIP-Datei, indem Sie auf den Button 'Mehr' in der 'ROI-Manager "Fenster, und exportieren Sie alle Messungen in eine Tabelle oder statistische Analyse-Software.
  9. Zur Quantifizierung der kinetischen Assays (Protokoll 3) umreißen und eine Zelle von dem Anfangszeitpunkt gemessen werden, wie in den Schritten 5.4 und 5.5 beschrieben. Verwenden Sie den gleichen ROI für die Messung aller späteren Zeitpunkten in das Experiment.
  10. Für Endpunkt-Assays (Protokolle 2 und 4), für jede Bedingung ein Minimum von 30 bis 50 Zellen messen. Führen Sie die Quantifizierung für mindestens 2-3 Bilder und beinhalten alle Zellen in jedemBild, das die Kriterien umrissen in Schritt 5.8 in der Analyse erfüllen.
  11. Beurteilen Sie die statistische Signifikanz zwischen den Proben unter Verwendung von Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukey-Mehrfachvergleichstest für die Post - hoc - Analyse.

6. Populationsanalyse von MUP1-pHluorin Endozytose von Flow Cytometry

  1. Beimpfen 2-3 Kolonien von Hefezellen (ungefähr 2 mm Durchmesser pro Kolonie) in 0,5 ml YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmidselektion beibehalten wird. Wachsen Zellen in 5-ml-Rundbodenröhrchen für 16-24 h bei 30 ° C auf einer Rolltrommel.
  2. 1,5 ml YNB-Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmiderhaltung und wachsen bei 30 ° C für weitere 3 h auf einer Walzentrommel.
  3. 1 ml der Zellen in die jeweils zwei 5-ml-Rundbodenröhrchen. Zugabe von 0,25 ml YNB -Met Mediums mit dem ersten Rohr (-Met condition) und 0,25 ml YNB-Medium, enthaltend 100 ug/ Ml Methionin mit dem zweiten Rohr eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml (+ Met Zustand) zu ergeben. Inkubiere Zellen bei 30 ° C für 45 min auf einer Walzentrommel.
  4. Analysieren Zellen mittels Durchflusszytometrie, Auswählen Vorwärtsstreuung (FS) als Maß für die Zellgröße und MUP1-pHluorin Fluoreszenzintensität von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Filter als Maß für die Ladung Internalisierung.
  5. Verwenden Sie den Schiebetasten, um die Spannung der FS und FITC Kanäle einstellen zu optimieren Erkennung für den Größenbereich und die Fluoreszenzintensität der Hefezellen verwendet werden (für diesen Experimenten verwendeten Einstellungen waren 50 V für FS und 400 V für FITC).
    HINWEIS: Spannung für beide Kanäle in Abhängigkeit von der Strömungs variieren Zytometer verwendet wird. Dieser Schritt sollte mit Methionin (Schritt 6.3) vor oder während der 45 min-Behandlung durchgeführt werden.
  6. Messen Sie FS und die Fluoreszenzintensität für 10.000 Zellen aus jedem Zustand, die hohe Strömungsgeschwindigkeit Einstellung. Generieren Sie ein Streudiagramm von FS gegen Fluozenz-Intensität: klicken Sie auf "hinzufügen Graph ', wählen Sie FITC (x-Achse) und FS (y-Achse) und der Graph 1000 Punkte (die Software Werte für 1000 Zellen angezeigt werden, obwohl wurden 10.000 Zellen gemessen).
    HINWEIS: Für eine maximale Konsistenz, zu analysieren Zellen 45-50 min nach der Zugabe von Methionin; für Experimente große Anzahl von Proben beteiligt, taumeln Zugabe von Methionin, die Zeit für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich aufzunehmen.
  7. Fügen Sie -Met und + Met Bedingungen für Wildtyp (WT) Zellen als Kontrolle. Mit Hilfe der Gate-Funktion, weisen eine vertikale Gate des WT + Met Zustand verwenden, so dass etwa 5% der hellsten Zellen rechts des Tores fallen. Verwenden Sie diese Gating für alle anderen Bedingungen im Experiment.

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Ergebnisse

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Steady-State - Lokalisierung und Quantifizierung des konstitutiv internalisiert endocytic Fracht Protein STE3

Um zu demonstrieren, dass pHluorin-tagged cargos kann zur Quantifizierung von Endozytose in lebenden Zellen, Lokalisierung von chimären GFP und pHluorin Fusionen mit der zytoplasmatischen C-terminalen Schwanz von STE3 verwendet werden, die a-Faktor-Pheromon-Rezeptor in Hefe, wurden ver...

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Diskussion

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Anwendungen von pHluorin zur Quantifizierung von endocytischen Ereignisse in Hefezellen macht von Transmembran- cargos in der die fluoreszierende Markierung an den zytoplasmatischen Schwanz des Proteins (1A) fusioniert ist. Für die Tests hier beschriebenen Frachten sind hell fluoreszierende, wenn die pHluorin Tag neutralen Umgebungen ausgesetzt ist, aber abgeschreckt werden, wenn die pHluorin Tag sauren Bedingungen trifft. So a pHluorin-markierte endocytic Ladung leicht an der zytoplasmatischen Gesicht ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

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Wir danken Gero Miesenböck und Tim Ryan für das Teilen von pHluorin cDNA, die zur Erzeugung von Reagenzien in dieser Studie verwendet wurde, Nathan Wright, Joanna Poprawski und Lydia Nyasae für die hervorragende technische Unterstützung, Mitgliedern des Wendland-Labors für hilfreiche Diskussionen und Michael McCaffery und Erin Pryce vom Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) für Ratschläge und Unterstützung bei der Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (an B.W., GM60979) und der National Science Foundation (an B.W., MCB 1024818) unterstützt. K.W. wurde teilweise durch ein Ausbildungsstipendium der National Institutes of Health (T32-GM007231) unterstützt. A.F.O. wurde durch Entwicklungsmittel des Department of Biological Sciences der Duquesne University und des CAREER-Stipendiums der National Science Foundation 553143 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdeninSigmaA8626-25GZur Herstellung von Aminosäuregemischen und Stammlösungen
Bacto-AgarFisherBP1423-2Zur Herstellung von Plattenmedien
BD Difco Hefe Stickstoffbase (ohne Aminosäuren)BD291920Zur Herstellung von flüssigen und Plattenmedien
Concanavalin ASigmaC5275-5MGZur Beschichtung der Kammer Objektträger
DextroseFisherBP350-1Verwendung zur Herstellung von flüssigen und plattenförmigen Medien
L-HistidinFisherBP382-100Verwendung zur Herstellung von Aminosäuremischung und Stammlösung
L-LeucinAcros125121000Verwendung zur Herstellung von Aminosäuremischung und Stammlösung
L-LysinFisherBP386-100Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung
verwenden L-MethioninFisherBP388-100Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung
verwenden L-TryptophanFisherBP395-100Zur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung
verwenden L-TyrosinAcros140641000Zur Herstellung einer Aminosäuremischung
verwenden Nunc Lab-Tek Kammeriges Deckglas ( 8-Well)Thermo Scientific155411Zur Verwendung für kinetische und Endpunkt-Assays zur Mup1-pHluorin-Internalisierung
UracilSigmaU0750-100GZur Herstellung einer Aminosäuremischung und einer Stammlösung
Axiovert 200 Inverses MikroskopCarl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective LensZeissObjektiv sollte 100X betragen, 1,4 NA oder höher
SensicamCooke Corporationsollte einen Dynamikbereich von 12 Bit oder höher haben
X-Cite 120PC Q BeleuchtungsquelleExcelitas Technologies
Slidebook 5 SoftwareIntelligent Imaging Innovations
ImageJ SoftwareNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Carl Die Kamera der

Referenzen

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pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

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