Methodenartikel

Ein Polyanilin basierenden Sensor von Nucleic Acids

DOI:

10.3791/54590

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1. November 2016

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1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Nukleinsäuren sind gängige Analyten zur Beurteilung biologischer Systeme; Verzerrungen durch enzymatische Manipulation können jedoch Anlass zur Sorge geben. Hier wird ein Verfahren zur markierungsfreien Detektion von Nukleinsäuren mittels Polyanilin beschrieben. Diese empfindliche, kostengünstige Sensortechnologie kann Einzelnukleotidunterschiede zwischen Molekülen unterscheiden.

Zusammenfassung

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Der Nachweis von Nukleinsäuren steht im Mittelpunkt der diagnostischen Technologien, die in der Forschung und in der Klinik eingesetzt werden. Die in diesen Technologien verwendeten Standardansätze beruhen auf enzymatischer Modifikation, die zu Verzerrungen und Artefakten führen kann. Ein entscheidendes Element der Detektionsplattformen der nächsten Generation wird die direkte molekulare Sensorik sein, wodurch die Notwendigkeit von Amplifikation oder Markierung vermieden wird. Fortschrittliche Nanomaterialien könnten die geeigneten chemischen Modalitäten bieten, um markierungsfreie Sensoren zu realisieren. Konjugierte Polymere eignen sich ideal für die biologische Sensorik, da sie Eigenschaften besitzen, die mit Biomolekülen kompatibel sind, und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber lokalen Umweltveränderungen aufweisen. In diesem Artikel wird ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung des elektrisch leitenden Polymers Polyanilin vorgestellt. Einfache DNA-"Sonden"-Oligonukleotide, die zu den Zielnukleinsäuren komplementär sind, werden elektrostatisch an das Polymer gebunden, wodurch ein Sensorsystem entsteht, das Einzelnukleotidunterschiede in Zielmolekülen unterscheiden kann. Abgesehen von der spezifischen und unvoreingenommenen Natur dieser Technologie ist sie sehr kostengünstig.

Einleitung

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Konjugierte Polymere bieten viele Optionen für molekulare Sensoren. Dazu gehören Fluoreszenz-, elektronische und kolorimetrische Reaktionen1. Es gab viele Bemühungen, konjugierte Polymere in Nukleinsäuresensoren einzubauen. Die meisten Systeme erfordern jedoch eine sekundäre Detektion, was die Erfassungsoptioneneinschränkt 2. Kürzlich haben wir über eine auf konjugierten Polymeren basierende Sensorplattform auf Basis von Polyanilin (PANI) berichtet, die die Eigenschaften dieses Polymers ausnutzt und so ein markierungsfreies System schafft3. PANI ist ein umfassend konjugiertes elektroaktives Polymer mit Eigenschaften wie Fluoreszenz und Beständigkeit, die für die Messung biologischer Systeme geeignet sind4. Die Exzitonen innerhalb der Struktur sind nicht lokalisiert, was zu einer Beweglichkeit der positiven Ladung zwischen monomeren Untereinheiten führt. Dies bietet ein flexibles Gerüst aus positiven Ladungen, die mit dem negativ geladenen Rückgrat der DNAinteragieren können 5,6. Wichtig ist, dass elektrostatisch gebundene DNA so orientiert ist, dass stickstoffhaltige Basen an der Basenpaarung teilnehmen können. Die Assoziation mit DNA verändert die elektronischen Eigenschaften von PANI, ein Effekt, der durch UV-Bestrahlung verstärkt werden kann (Abbildung 1)3. Mit diesem System können Oligonukleotide, die zu den Zielnukleinsäuren komplementär sind, auf PANI immobilisiert werden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass elektrostatisch adsorbierte Oligonukleotide nach der Hybridisierung von PANI oder anderen kationischen Matrizen dissoziieren, und zwar aufgrund von Konformationsänderungen, die durch den Wechsel zu einer doppelsträngigen DNA-Struktur verursacht werden3,5,7.

In einem Sensorsystem, in dem die Sondenbefestigung konjugierte Polymereigenschaften moduliert, können Hybridisierungsereignisse ohne Markierung oder enzymatische Modifikation von Sonden oder Zielnukleinsäuren transduziert werden. Konjugierte Polymere bieten eine große Flexibilität bei den Nachweismethoden, zu denen auch die Fluoreszenz gehört. Durch die Überwachung der PANI-Fluoreszenz können Konzentrationen von Zielnukleinsäuren von nur 10-11 M (10 pM) nachgewiesen werden3. Der Nachweis erfolgt schnell, erfolgt innerhalb von 15 Minuten nach der Hybridisierung und ist spezifisch, wenn eine einzelne Fehlanpassung in einem Zielmolekül unterschieden werden kann3.

Die Herstellung von PANI-Sensoren ist unkompliziert. PANI mit hohem Molekulargewicht kann erzeugt werden, das unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren mit Anilinmonomer, Tensid und kontrollierter Zugabe eines Oxidationsmittels gut in Wasser dispergiert ist. Die Ausbeute kann sehr hoch sein und nicht umgesetztes Oxidationsmittel durch Waschen mit Wasser entfernen, um sicherzustellen, dass kein weiteres PANI-Wachstum stattfindet. Die PANI-Sonden-Assoziation tritt spontan nach dem Mischen auf, und die Komplexbildung wird durch milde UV-Exposition verstärkt. Die Hybridisierung kann sofort durchgeführt werden, und die Veränderungen der PANI-Fluoreszenz können nach einer kurzen Inkubation untersucht werden. Die Einfachheit dieser Technologie macht sie für viele Labore leicht zugänglich.

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Protokoll

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1. verarbeitbaren PANI Synthese

  1. Auflösen Anilin (1 ml, 11 mmol) vollständig in 60 ml Chloroform in einem 250 ml Rundkolben. Rühre bei 600 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten und Abkühlen auf 0-5 ° C mit Eis. Dies dauert in der Regel 15 bis 20 min (2A).
  2. Hinzufügen Natriumdodecylbenzolsulfonat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) zu der Anilin-Lösung in einem Rundkolben während bei 600 rpm gerührt wurde.
  3. Man löst Ammoniumpersulfat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) in 20 ml Wasser und fügen Sie alle tropfenweise über 30 Minuten eine Überhitzung der Reaktion zu vermeiden.
  4. Führen Sie die Reaktion bei 0-5 ° C für 24 Stunden, und lassen Sie es Raumtemperatur für weitere 24 Stunden zu erreichen.
  5. Beachten Sie das Reaktionsgemisch zunächst drehen milchig weiß nach 15 min, dann dunkelbraun nach 2 h und schließlich zu dunkelgrün nach 24 h (2B-F).
  6. Filtern Sie die PANI-NaDBS Lösung mit einem Büchner-Trichter. Mischen Sie mit 80 ml Chloroform und 120 ml Wasser in alseparation Trichter (2G).
  7. Inkubiere die Lösung 24 h bei Raumtemperatur und sammle die dunkelgrüne PANI aus dem Scheidetrichter, so dass nicht-umgesetztes NaDBS und APS in dem wässrige Überstand.

2. PANI-Sonde Mischen und UV-Bestrahlung

  1. Verdünnen Sie PANI Lösung 10x mit Chloroform-Wasser (1: 3 v / v) und mischen Sie 200 ul verdünnt PANI mit 6,4 & mgr; mol Sonden-DNA-Oligonukleotide durch sanftes für 15 min rocking in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Bestrahlen , um die PANI-DNA - Lösung mit 1200 & mgr; J / cm 2 UV in einem Vernetzer für 2 min. Es ist kritisch, dass die UV-Belichtung mit der angegebenen Menge beschränkt ist. Verlängerte Exposition gegenüber UV kompromittiert die Fluoreszenzänderung in PANI, wahrscheinlich durch kovalente Vernetzung von PANI und DNA.
  3. Pellet-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 xg für 6 min und Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Pellet erneut und resuspendieren in PBS.

3. Hybridization von PANI-Sonde

  1. Aus 8 ul 100 uM komplementären DNA-Oligonucleotide oder Zielnukleinsäuren zu 200 ul PANI-Sonde-Komplexe.
  2. Führen Hybridisierung durch Lösungsgemisch 15 min bei 40 rocking ° C.
  3. Pellet die PANI-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 xg für 6 min. Waschen mit PBS und Resuspendieren in Wasser.

4. Emissions Steady-State-Fluoreszenzmessung

  1. In PANI aus verschiedenen Behandlungen in einer 96-Well-Mikroplatte und messen Emissionsfluoreszenz im 270-850 nm-Bereich durch Anregung bei 250 nm. Ein Emissionsspitze für PANI sollte etwa 500 nm zu beobachten.

5. Fluoreszenzmikroskopie Messung der hybridisierten Duplex

  1. Drop-Mantel PANI auf einem Borosilikat-Deckglas und trocken bei 40 ° C für 48 Stunden.
  2. In Sonde (8 ul 100 uM) auf einem getrockneten PANI Film und bestrahlen es mit UV - Licht (1200 & mgr; J / cm 2 ) für 2 min.
  3. Waschen Sie die PANI-Sonde Film mit PBS und trocken bei 40 ° C für 48 Stunden.
  4. Führen Sie die Hybridisierung für 15 min von Ziel-Nukleinsäuren hinzufügen. Dies könnte eine biologische Probe oder eine Kontroll Zieloligonucleotid (8 ul 100 uM) sein. Folgen Sie mit einem PBS waschen.
  5. Besorgen Sie sich die Fluoreszenzbilder bei 40-facher Vergrößerung, mit einem 500 nm Langpassfilter.

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Ergebnisse

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2A erfasst zu Beginn des Polymerisationsverfahrens des Reaktionsaufbau, also vor APS hinaus. Mizellenbildung ist der erste Schritt in dem Reaktionsverfahren-PANI - Synthese an der mizellaren Schnittstelle auftritt. 2B zeigt eine milchige Lösung nach 5 min. 30 min nach dem APS zugegeben wird die Reaktion dann auch in eine leicht braune Farbe. 2C zeigt die Farbänderung mit der Bildung von Oligomeren verbunden. 2D ...

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Diskussion

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A PANI-basierten Sensor von Nukleinsäuren erfordert die Solubilisierung des Polymers in Wasser, um mit DNA und RNA zu interagieren. Die Dispersion von PANI in Wasser Tenside erreicht Verwendung bilden Mizellen wie zuvor 8 berichtet. Neben den hier NaDBS andere anionische Tenside wie dodecylester von 4-Sulfophthalsäure, nicht - ionische Tenside wie Nonylphenolethoxylat oder kationische oberflächenaktive Mittel wie Cetyltrimethylammoniumbromid könnte auch für die Synthese von verarbeitbaren PANI 9,10...

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Offenlegungen

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Die Arbeit wurde vom University of Southern Mississippi College of Science and Technology und dem Mississippi College of Science and Technology sowie dem Mississippi INBRE-Programm (Award Number P204M103476 vom National Institute of General Medical Science) unterstützt.

Danksagungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anilin Fisher Wissenschaftlich Nr. A7401-500 ACS, flüssig, gekühlt
AmmoniumperoxydisulfatFisher Scientific A682-500 ACS, kristallin
NatriumdodecylbenzolsulfonatPfaltz & Bauer D56340 95% fest
ChloroformFisher Scientific MCX 10601 Flüssigkeit
DNA-PrimerMWG-Operonn/einebenutzerdefinierte DNA-Sequenz ~20 
bps Mikrotiterplatte USA Wissenschaftlich 1402-9800 96 gut, Polypropylen, da es nicht auf Chloroform reagiert
Mikrotiterplatten-KlebefolieUSA Wissenschaftlich2920-0000 Reduziert die Kontamination von Bohrloch zu Bohrloch, das Verschütten und Verdunsten von Proben
Mikroskop-DeckglasFisher Scientific 12-544-D PANI-beschichtet auf UV-bestrahltem Deckglas
UV-Vernetzer UVP HL-2000 Energie: X100 μ J/cm2; Zeit: 2 min
HybridisierungsofenVWR01014705 TTemperatur: 400  ° C; mit Schaukeln für 15 min
Glasapparat Fisher ScientificDreihalsiger Rundkolben für die Reaktion; Tropftrichter, Stopfen, Kondensor, Scheidetrichter
MikroskopLeica Microsystems Leica IMC S80Vergrößerung 20X; Pseudofarbe 536 nm; Exposition 86 ms; Gewinn 1,0x; Gamma 1.6
Mikroplatten-ReaderMolekulare Geräte Tel.: 89429-536

Referenzen

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  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

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Schlagwörter

Polyanilin SensorNukleins urenachweismarkierungsfreier BiosensorDNA SondenhybridisierungFluoreszenzmessungUV QuervernetzungPolymersyntheseNukleins urehybridisierungFluoreszenzmikroskopieZentrifugationswaschung

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