Methodenartikel

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/54599

⸱

18. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Handschrift beschreibt ein detailliertes Protokoll für phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren durch Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können auch für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellsortierung, Genexpressionsanalyse oder funktionelle Untersuchungen, wodurch die in dem experimentellen Modell erhaltenen Informationen zu erhöhen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Entzündungen und in der Folge Makrophagen bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von Nierenerkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Makrophagen sind heterogene Zellen, die mit Nierenschäden in Verbindung gebracht werden. Makrophagen können in zwei verschiedene Phänotypen eingeteilt werden: klassisch aktivierte Makrophagen (M1-Makrophagen), die entzündungsfördernde Zytokine freisetzen und die Fibrose fördern; und alternativ aktivierte Makrophagen (M2-Makrophagen), die mit immunregulatorischen und geweberemodellierenden Funktionen assoziiert sind. Diese Makrophagen-Phänotypen müssen unterschieden und analysiert werden, um ihren Beitrag zur Nierenschädigung zu bestimmen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die über konsistente phänotypische und funktionelle Informationen über Makrophagen-Subtypen in Modellen für entzündliche Nierenerkrankungen, insbesondere bei Ratten, berichten. Diese Tatsache könnte mit den begrenzten Makrophagenmarkern zusammenhängen, die bei Ratten im Gegensatz zu Mäusen verwendet werden. Daher sind neue Strategien notwendig, um den Nierengehalt dieser infiltrierenden Zellen zuverlässig zu quantifizieren und zu charakterisieren. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Nierenverdauung und weitere phänotypische und quantitative Analysen von Makrophagen aus Rattennieren mittels Durchflusszytometrie. Kurz gesagt, die Nieren wurden mit Kollagenase inkubiert und die Gesamtmakrophagen wurden anhand des dualen Vorhandenseins von CD45 (gemeinsames Leukozytenantigen) und CD68 (PAN-Makrophagenmarker) in lebenden Zellen identifiziert. Es folgte die Oberflächenfärbung von CD86 (M1-Marker) und CD163 (M2-Marker). Peritoneale Makrophagen der Ratte wurden als Positivkontrolle für den Makrophagen-Markernachweis mittels Durchflusszytometrie verwendet. Unser Protokoll führte zu einer niedrigen zellulären Mortalität und ermöglichte die Charakterisierung verschiedener intrazellulärer und Oberflächenproteinmarker, wodurch der Verlust der zellulären Integrität, der in anderen Protokollen beobachtet wurde, begrenzt wurde. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Verwendung von Makrophagen für weitere Techniken, darunter Zellsortierung und mRNA- oder Proteinexpressionsstudien.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierenerkrankungen sind ein globales Gesundheitsproblem mit erhöhter Prävalenz und erhöhter Morbidität und Mortalität1. Einer der wichtigsten Mechanismen, die an der Progression und Entwicklung der Nierenschädigung beteiligt sind, ist die Entzündung, die hauptsächlich durch Makrophagen ausgelöst wird. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei vielen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen2. So wurde in Biopsien von Patienten mit akutem Nierenversagen (AKI) oder chronischer Nierenerkrankung (CKD) über ein erhöhtes Vorhandensein von infiltrierenden Makrophagen berichtet3,4. Neuere Studien deuten darauf hin, dass das Langzeitergebnis der Nierenerkrankung durch Makrophagen kontrolliert werden könnte5,6. Als Reaktion auf die lokale Mikroumgebung können sich Makrophagen in verschiedene Phänotypen differenzieren, die unterschiedliche biologische Funktionen erfüllen7. Es wurden zwei gut differenzierte Makrophagen-Phänotypen etabliert: klassisch aktivierte Makrophagen (M1-Makrophagen) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2)8. M1-Makrophagen fördern Entzündungen, während M2-Makrophagen eine entzündungshemmende Rolle spielen und an der Gewebereparatur beteiligt sind9. Daher ist eine bessere Kenntnis der Heterogenität von Makrophagen notwendig, um ihre Regulation und ihren Beitrag zur Nierenpathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu entwickeln.

Sowohl Maus- als auch Rattenmodelle wurden häufig verwendet, um den molekularen und zellulären Mechanismus zu verstehen, der an Nierenschäden beteiligt ist10. Es gibt jedoch erhebliche Unterschiede in den verschiedenen Markern, die zur Identifizierung von Makrophagen-Phänotypen zwischen diesen Nagetieren verwendet werden. Daher werden einige murine Marker wie F4/80 oder Ly6C bei Ratten nicht verwendet, was die Extrapolation der Befunde zwischen diesen Spezies einschränkt. Darüber hinaus gibt es eine begrenzte Anzahl von Markern, die Makrophagen-Phänotypen bei Ratten beschreiben, was die seltenen Studien erklärt, die die Makrophagen-Heterogenität bei diesen Tieren im Vergleich zu Mäusen analysieren. Daher sind neue Strategien zur Charakterisierung von Makrophagen-Untergruppen notwendig, um die Rolle von Makrophagen in Modellen für Nierenerkrankungen bei Ratten zu verstehen.

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren mittels Durchflusszytometrie. Dieser Technik können mehrere Assays folgen, einschließlich Zellsortierung und mRNA- oder Proteinexpressionsstudien, um eine detaillierte Charakterisierung der Rolle von Makrophagen bei Nierenerkrankungen zu ermöglichen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde von den lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse nach der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments und der nationalen Richtlinie 53/2013 genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen

  1. Bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen unter sterilen Bedingungen und Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Halten Lösungen bei 4 ° C.
  2. Bereiten Färbepuffer (2% fötalem Rinderserum (FBS) in 1x Dulbecco-PBS).
  3. Bereiten Kollagenase-Lösung durch Zugabe von 0,5 mg Kollagenase zu jedem ml Kochsalzlösung.
  4. Bereiten Anästhesie Lösung von Ketamin / Xylazin (2: 1 v / v).

2. Nierenperfusion und Extraktion

  1. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (75 mg / 12 mg / kg Gewicht). kneifen Sie vorsichtig eine kleine Hautfalte, um zu überprüfen, dass das Tier ausreichend betäubt. Dann decken die Augen mit vet Salbe Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Hinweis: 4-month-alten Wistar-Ratten werden in diesem Test verwendet.
  2. Sobald die Ratte völlig betäubt ist, legen Sie es auf einem OP-Tisch in Rückenlage.
  3. Bewerben 70% Ethanol auf den Bauch.
  4. Machen Sie einen zentralen Schnitt durch die Bauchhaut und Bauchfell, vom Schambein bis zum Brustkorb, die Pleura und Bauchhöhle zu belichten.
  5. Injizieren Kochsalzlösung (0,9%) in die Bauchaorta zu perfundieren Nieren ein Perfusionssystem verwendet, bis das gesamte Blut aus Nieren entfernt wird. Schneiden Sie die Aorta auf der Bauchebene zu helfen, das Blut freigeben.
  6. Entfernen Sie beide Nieren von Ratten durch vom Nierenhilus Schneiden (renale Vene, Arterie und Harnleiter). Um die Niere decapsulate, drücken Sie die Kante der Niere Fingern vorsichtig die Kapsel zu trennen 11.
  7. Legen Sie die Niere in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung.

3. Nieren Verdauung und Zellsuspension

  1. Schneiden Sie die Hälfte einer Niere mit einer Schere in kleine Stücke schneiden und dieStücke in ein 1,5 ml Röhrchen.
    Hinweis: Alle folgenden Konzentrationen für 1 Probe berechnet (1/2 Rattenniere).
  2. 1 ml der Kollagenase-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Mischen durch Umdrehen alle 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Kollagenase-Lösung das gesamte Gewebe zugreift.
  3. Sammeln Sie die Lösung und gibt sie durch ein Sieb (40 um) mit Hilfe eines Kolbens und Resuspension in 10 ml Färbepuffer.
  4. Zentrifuge bei 400 × g für 15 min.
  5. Re-suspend das Pellet in 1 ml ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysepuffer. Nach 1 min 30 sec bei Raumtemperatur, gibt 10 ml Färbepuffer die Reaktion zu stoppen.
  6. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min.
  7. Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Färbepuffer (1 ml) und Filtern der Zellsuspension mit einem Sieb (30 um).
  8. Zählen Sie die Anzahl der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer und mit 2 Millionen Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen für staining.

4. Zellfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Zentrifugen Zellen bei 100 xg für 5 min.
  2. Resuspendieren des Pellets in 100 & mgr; l Rattenserum (verdünnt 1: 100) für 10 min bei 4 ° C Fc-Rezeptoren zu blockieren.
  3. Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge 100 xg für 5 min.
  4. Mischen Sie die Antikörper für Zelloberflächenfärbung in 100 ul Färbepuffers für jede Bedingung: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) und die Lösung zu lebenden Zellen erkennen (3: 1000).
  5. Resuspendieren des Zellpellets in der Antikörpermischung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  6. Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  7. Hinzufügen 600 ul Fixation / Permeabilisierung Lösung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  8. Waschen 2-mal mit 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 170 xg für 5 min.
  9. Fügen Sie den CD68 FITC-Antikörper (35: 1000) für die intracelzelluläre Färbung zu 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer für jede Bedingung.
  10. Resuspendieren des Pellets in der CD68-Antikörperlösung und inkubiere 50 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  11. Waschen mit 1 ml Permeabilisierungs / Waschpuffer und Zentrifuge bei 170 xg für 5 min.
  12. Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer, fügen CD86PE Antikörper (35: 1000) und für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert.
  13. Waschen durch Zugabe von 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 100 xg für 5 min.
  14. Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer und übergeben es an einer Durchflusszytometrie Röhre.
  15. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie CD45-Färbung in Live-gated-Zellen in der Seitenstreulicht / Vorwärtsstreulicht (SSC / FSC) Fenster. In einem zweiten Schritt analysieren CD86 und CD163 Expression in CD68 + Zellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir analysierten Makrophagen Heterogenität in einer entzündlichen experimentellen Modell der Nierenschädigung mit einer erhöhten Präsenz von Makrophagen in der Niere zu infiltrieren. In diesem Modell wurde Nierenschäden durch die Gabe von Aldosteron (1 mg -1 kg -1 Tag) und Salz (NaCl 1%) im Trinkwasser für 3 Wochen bei Wistar - Ratten induziert, wie zuvor 12 berichtet.

Der Zeitplan unserer Vers...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrophagen sind heterogene Zellen, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen spielen. Es ist bei der Charakterisierung von Makrophagen Subsets in renal disease zunehmendes Interesse , da jeder Subpopulation von Makrophagen zur Entwicklung von Nierenschädigung in einer anderen Weise trägt, wie 14-16 in Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie und Nierenkrebs berichtet. In den frühen Stadien der akuten Nierenschädigung, eine Dominanz von M1 Mak...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 und PI14/00883), der Spanischen Gesellschaft für Atherosklerose, der Spanischen Gesellschaft für Nephrologie und der Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) an Juan Antonio Moreno unterstützt. FIS/FEDER Fonds PI14/00386 und Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica an Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago an Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) an Alfonso Rubio Navarro.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Laminar-Flow-HaubeSchneller Odergleichwertige
Ausrüstung ZentrifugeHettichOder gleichwertige Ausrüstung
Durchflusszytometer (FACSAria)BD Biosciences
Fötales RinderserumBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
KollagenaseSigma-Aldrich01.12.9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
Durchflusszytometrie-SiebeBD Biosciences340626
Falcon ZellsiebeThermo Fisher Scientific352340
Durchflusszytometrie-RöhrchenFalcon3520525 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden
Corning centristar430791
WasserbadMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Fixierungs-/Permeabilisierungslösung oder Permeabilisierungs-/WaschpufferBD Biosciences554714
Rompum (Xylazin)Bayeroder gleichwertig
Ketalar (Ketamin)Pfizeroder gleichwertig
Hanks' ausgewogene SalzlösungSigma-AldrichH8264-500ML
KochsalzlösungBraun
Anti-CD45 (Klon: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Verdünnt 1:100
Anti-CD68 (Klon: ED1) FITCBio-RADMCA341FVerdünnt 35:1.000
Anti-CD86 (Klon: 24F) PEBiolegend200307Verdünnt 35:1.000
Anti-CD163 (Klon: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RVerdünnt 4:100
Lebend-/Totfärbung Molekulare SondenL34955Verdünnt 3:1.000
622415

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Makrophagen Ph notypisierungNierendigestionCD45 CD68 F rbungCD86 CD163 MarkerRatten NierenmakrophagenM1 M2 KlassifizierungZelloberfl chenf rbungPeritonealmakrophagen KontrolleAnalyse renaler Entz ndungen

Verwandte Artikel