Diese Handschrift beschreibt ein detailliertes Protokoll für phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren durch Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können auch für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellsortierung, Genexpressionsanalyse oder funktionelle Untersuchungen, wodurch die in dem experimentellen Modell erhaltenen Informationen zu erhöhen.
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Methodenartikel
Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Entzündungen und in der Folge Makrophagen bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von Nierenerkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Makrophagen sind heterogene Zellen, die mit Nierenschäden in Verbindung gebracht werden. Makrophagen können in zwei verschiedene Phänotypen eingeteilt werden: klassisch aktivierte Makrophagen (M1-Makrophagen), die entzündungsfördernde Zytokine freisetzen und die Fibrose fördern; und alternativ aktivierte Makrophagen (M2-Makrophagen), die mit immunregulatorischen und geweberemodellierenden Funktionen assoziiert sind. Diese Makrophagen-Phänotypen müssen unterschieden und analysiert werden, um ihren Beitrag zur Nierenschädigung zu bestimmen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die über konsistente phänotypische und funktionelle Informationen über Makrophagen-Subtypen in Modellen für entzündliche Nierenerkrankungen, insbesondere bei Ratten, berichten. Diese Tatsache könnte mit den begrenzten Makrophagenmarkern zusammenhängen, die bei Ratten im Gegensatz zu Mäusen verwendet werden. Daher sind neue Strategien notwendig, um den Nierengehalt dieser infiltrierenden Zellen zuverlässig zu quantifizieren und zu charakterisieren. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Nierenverdauung und weitere phänotypische und quantitative Analysen von Makrophagen aus Rattennieren mittels Durchflusszytometrie. Kurz gesagt, die Nieren wurden mit Kollagenase inkubiert und die Gesamtmakrophagen wurden anhand des dualen Vorhandenseins von CD45 (gemeinsames Leukozytenantigen) und CD68 (PAN-Makrophagenmarker) in lebenden Zellen identifiziert. Es folgte die Oberflächenfärbung von CD86 (M1-Marker) und CD163 (M2-Marker). Peritoneale Makrophagen der Ratte wurden als Positivkontrolle für den Makrophagen-Markernachweis mittels Durchflusszytometrie verwendet. Unser Protokoll führte zu einer niedrigen zellulären Mortalität und ermöglichte die Charakterisierung verschiedener intrazellulärer und Oberflächenproteinmarker, wodurch der Verlust der zellulären Integrität, der in anderen Protokollen beobachtet wurde, begrenzt wurde. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Verwendung von Makrophagen für weitere Techniken, darunter Zellsortierung und mRNA- oder Proteinexpressionsstudien.
Einleitung
Nierenerkrankungen sind ein globales Gesundheitsproblem mit erhöhter Prävalenz und erhöhter Morbidität und Mortalität1. Einer der wichtigsten Mechanismen, die an der Progression und Entwicklung der Nierenschädigung beteiligt sind, ist die Entzündung, die hauptsächlich durch Makrophagen ausgelöst wird. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei vielen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen2. So wurde in Biopsien von Patienten mit akutem Nierenversagen (AKI) oder chronischer Nierenerkrankung (CKD) über ein erhöhtes Vorhandensein von infiltrierenden Makrophagen berichtet3,4. Neuere Studien deuten darauf hin, dass d....
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Protokoll
Dieses Protokoll wurde von den lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse nach der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments und der nationalen Richtlinie 53/2013 genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen unter sterilen Bedingungen und Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Halten Lösungen bei 4 ° C.
- Bereiten Färbepuffer (2% fötalem Rinderserum (FBS) in 1x Dulbecco-PBS).
- Bereiten Kollagenase-Lösung durch Zugabe von 0,5 mg Kollagenase zu jedem ml Kochsalzlösung.
- Bereiten Anästhesie Lösung von Ketamin / Xylazin (2: 1 v / v).
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Ergebnisse
Wir analysierten Makrophagen Heterogenität in einer entzündlichen experimentellen Modell der Nierenschädigung mit einer erhöhten Präsenz von Makrophagen in der Niere zu infiltrieren. In diesem Modell wurde Nierenschäden durch die Gabe von Aldosteron (1 mg -1 kg -1 Tag) und Salz (NaCl 1%) im Trinkwasser für 3 Wochen bei Wistar - Ratten induziert, wie zuvor 12 berichtet.
Der Zeitplan unserer Vers.......
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Diskussion
Makrophagen sind heterogene Zellen, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen spielen. Es ist bei der Charakterisierung von Makrophagen Subsets in renal disease zunehmendes Interesse , da jeder Subpopulation von Makrophagen zur Entwicklung von Nierenschädigung in einer anderen Weise trägt, wie 14-16 in Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie und Nierenkrebs berichtet. In den frühen Stadien der akuten Nierenschädigung, eine Dominanz von M1 Mak.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 und PI14/00883), der Spanischen Gesellschaft für Atherosklerose, der Spanischen Gesellschaft für Nephrologie und der Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) an Juan Antonio Moreno unterstützt. FIS/FEDER Fonds PI14/00386 und Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica an Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago an Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) an Alfonso Rubio Navarro.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Laminar-Flow-Haube | Schneller Oder | gleichwertige | |
| Ausrüstung Zentrifuge | Hettich | Oder gleichwertige Ausrüstung | |
| Durchflusszytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fötales Rinderserum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Kollagenase | Sigma-Aldrich | 01.12.9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Durchflusszytometrie-Siebe | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon Zellsiebe | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Durchflusszytometrie-Röhrchen | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden |
| Corning centristar | 430791 | ||
| Wasserbad | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 ° C |
| Fixierungs-/Permeabilisierungslösung oder Permeabilisierungs-/Waschpuffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazin) | Bayer | oder gleichwertig | |
| Ketalar (Ketamin) | Pfizer | oder gleichwertig | |
| Hanks' ausgewogene Salzlösung | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Kochsalzlösung | Braun | ||
| Anti-CD45 (Klon: OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Verdünnt 1:100 |
| Anti-CD68 (Klon: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Verdünnt 35:1.000 |
| Anti-CD86 (Klon: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Verdünnt 35:1.000 |
| Anti-CD163 (Klon: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Verdünnt 4:100 |
| Lebend-/Totfärbung | Molekulare Sonden | L34955 | Verdünnt 3:1.000 |
Referenzen
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
