Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Zusammenfassung

Subzelluläre Patch-Clamp-Aufzeichnungen bieten die Möglichkeit, die funktionellen Eigenschaften von Dendriten zu untersuchen. Diese feinen Strukturen sind jedoch aufgrund ihres geringen Durchmessers nicht leicht zugänglich. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Sammlung stabiler und zuverlässiger Aufzeichnungen von den Dendriten von Dopamin-Neuronen in Schnitten in vitro zu erleichtern.

Zusammenfassung

Dendriten von dopaminergen Neuronen empfangen und vermitteln synaptischen Eingang, Unterstützung Aktionspotential Rückausbreitung und die Freisetzung von Neurotransmittern. Schuppen Licht in diesen Neuronen auf der Informationsübertragung wird diese grundlegenden Funktionen zu verstehen. Dendritische patch-clamp-Aufnahmen bieten die Möglichkeit, direkt auf die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und das darunter liegende spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen. Jedoch sind diese feinen Strukturen nicht leicht zugänglich Patch-Pipetten wegen ihres kleinen Durchmessers. Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren stabile und zuverlässige Aufzeichnungen von den Dendriten von dopaminergen Neuronen in akuten Scheiben zu sammeln. Elektrophysiologische Messungen werden mit Post - hoc - Erholung der Zellmorphologie kombiniert. Erfolgreiche Experimente stützen sich auf eine verbesserte Herstellung von Scheiben, Lösungen und Pipetten, adäquate Einstellung der Optik und Stabilität der Pipette in Kontakt mit der aufgezeichneten Struktur. Standard-Prinzipien somatic Patch-Clamp-Aufzeichnung werden an Dendriten angewendet, sondern mit einem sanfteren Ansatz der Pipette. Diese vielseitigen Techniken können verschiedene Fragen zu den erregbaren Eigenschaften von Dendriten zu adressieren umgesetzt werden.

Einleitung

Neurone erhalten synaptischen Informationen überwiegend auf ihre Dendriten. Erregenden und hemmenden synaptischen Signale von ihrer Website von Generation zur Integrationsstelle verbreiten, in dem Aktionspotentiale (APs) als Ausgangssignal hervorgerufen werden. Auf ihrem Weg werden synaptische Potentiale beeinflusst sowohl die Struktur der Dendriten und die Wechselwirkung zwischen passiven und aktiven Membraneigenschaften. Die Kombination dieser sehr variablen Parameter erweitert die Rechenleistung von Neuronen ^1,2. Jedoch verhindert der geringe Durchmesser von Dendriten jedoch die Untersuchung ihrer elektrischen Eigenschaften. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Patch-Clamp - Technik ³ ist die Optik ⁴ und Verbesserung von Verfahren zur Schicht Vorbereitung ⁵ in den letzten Jahrzehnten haben es ermöglicht , Aufnahmen aus sehr dünn (0,7-3 & mgr; m Ø) Dendriten ^6,7. Diese Verfahren wurden und werden immer noch verwendet weitgehend die Erregbarkeit von Dendriten in einer Vielzahl zu untersuchen of Neuronen ^8. Direkt dendritischen Aufnahmen sind wesentlich die Verteilung ^9-19 und Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften ^20-22 von Ionenkanälen in verschiedenen neuronalen Abteilen zu bestimmen. Diese Daten sind die notwendige Ergänzung der Ionenkanalverteilungen mit Immunhistochemie nachgewiesen kombiniert , um Licht- und Elektronenmikroskopie ^23,24. Dual - somatodendritische Aufnahmen wurden implementiert , um die Ausbreitung von Aktionspotentialen ^{9,13-15,21,22,25-27} und Verbreitung der synaptischen Potentiale ^13,16,18 entlang der somatodendritische Domäne von Neuronen zu erforschen, erhalten detaillierte passive Kabelmodelle ^{28- 30} und die zeitliche Auflösung der neuronalen Integration ³¹ untersuchen.

Die Substantia nigra (SN) ist eine Region, in der Mittelhirns in mehreren Funktionen beteiligt sich beispielsweise die Steuerung der Bewegung, die Codierung von Belohnung und gewohnheitsmäßige Verhalten. Die Abnahme von Dopamin aufgrund der spezifischenVerlust dopaminerger (DA) Neuronen in der SN mit den motorischen Störungen in Patienten , die an Parkinson-Krankheit leiden , beobachtet ³² verbunden. Die nigral Schaltung besteht aus zwei Hauptzelltypen: dopaminergen und GABA-erge Neuronen. Interessanterweise haben diese Neuronen mehrere spezifische Eigenschaften, die sie von anderen Neuronen unterscheiden. Das Axon eines großen Anteils von DA - Neuronen und einigen GABA - Neuronen stammt aus einer dendritischen Ort anzeigt , dass die dendritischen Dorn heterogen ist (Axon-Lager und Axon-fehlt Dendriten) ^25,26,33. Die Morphologie dieser Neuronen im Gegensatz daher mit der typischen Organisation von Neuronen in dem die Informationsübertragung das Gesetz der dynamische Polarisation emittiert von Cajal folgt: ausgehend von Dendriten zu soma und schließlich ³⁴ bis Axon. DA - Neuronen sind auch Aktivität zu lösen Dopamin aus ihren Dendriten ^35, erzeugen Platzen bekannt ³⁶ und NMDA-Rezeptor Plastizität ^37. Die dissection dieser Phänomene ist schwer zu fassen, ohne direkte Aufnahmen von der Stelle, wo sie initiiert werden. Um Einblicke in die Beziehung zwischen den genauen Ort und funktionellen Eigenschaften von Ionenkanälen und ihre Rolle bei der dendritischen Erregbarkeit und Informationstransfer in nigral Neuronen, direkte dendritischen Aufnahmen sind die Methode der Wahl.

Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Verfahren , die verwendet werden können Single- und Dual - Patch-Clamp - Aufnahmen von Dendriten nigraler Neuronen und dem entsprechenden Post - hoc - biocytin Kennzeichnung zu erhalten. Die Grundprinzipien für das Patchen der somatischen und die dendritischen Membran sind sehr ähnlich. Praktisch jedoch Aufnahmen von dendritischen Sites erfordern eine gezielte Optimierung im Vergleich zu somatischen Aufnahmen. Erfolgreiche dendritischen Aufnahmen verlassen sich auf die Qualität der Scheiben, eine optimale Anpassung der Optik, sanfte Annäherung der Patch-Pipette und die Stabilität der Aufnahmen.

Protokoll

Alle Versuchs hier beschriebenen Verfahren folgen institutionellen und nationalen Richtlinien, EU-Richtlinien zum Schutz der Tiere und den Richtlinien der Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Herstellung der Lösungen

1. Standard künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; Tabelle 1)
   1. Verwenden Sie hochreine Salze ³⁸ und saubere Glasbecher vorher mit doppelt destilliertem Wasser gespült , um eine frische Lösung herzustellen. Verwenden Sie qualitativ hochwertige doppelt destilliertem Wasser für die Herstellung aller extra- und intrazellulären Lösungen.
   2. Nehmen Sie einen 2 - Liter - Becher NaHCO ₃ in 500 ml Wasser und anderen zu lösen , die andere Salze zu lösen , um die Ausfällung von zweiwertigen Ionen ³⁹ gemäß Tabelle 1 zu verhindern. Reinigen Sie den Spachtel systematisch mit doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie es vor ein Salz nehmen . Verwenden Sie einen Magnetrührer homogenisieren AUFLÖSUNGn. Fügen Sie die Lösungen von beiden Becher auf einen geeigneten Messkolben und bringen Sie zu dem entsprechenden Volumen.
   3. Stellen Sie sicher, dass die endgültige extrazelluläre Lösung vollständig transparent und ohne jede Spur von Niederschlag.
   4. Anwenden Mischung ein Gas , bestehend aus 95% O ₂ und 5% CO ₂ (Carbogen Gas) mit einer Glasmikro candle (Ø 13 mm) 20 - 30 min , bevor die Scheiben ^38,40 Perfundieren. kontrollieren sorgfältig die Osmolarität (2 - 3 aufeinanderfolgenden Messungen) des ACSF mit einem Osmometer (optimaler Bereich: 314-325 mOsmol / l). Bewahren Sie die verbleibende Lösung nach der Zubereitung bei 4 ° C und verwenden Sie es innerhalb von 3 Tagen.
2. Cutting - Lösung (Saccharose-ACSF; Tabelle 2) ^5,13
   1. Bereiten Sie 3 l frische Lösung. Verwenden Sie 1 L Gehirnscheiben vorzubereiten von einem Tier. Bewahren Sie die verbleibende Lösung bei 4 ° C und verwenden Sie es innerhalb von 3 Tagen.
      HINWEIS: Hohe Mg ²⁺ und niedrige Ca ²⁺ Konzentrationen bis d verwendetecrease synaptische Transmission und die Substitution einiger NaCl mit Saccharose , das Gewebe ^5,40 zu erhalten.
3. intrazellulärer Lösungen
   1. Vorbereitung im voraus 100 ml Lösung für Dual whole-cell - Aufnahmen (Tabelle 3).
   2. Fügen Sie Methylsulfat- ^13,15,21 gute Erholung der Zellmorphologie zu erhalten. Hinzufügen Biocytin (0,1-0,4%) anschließend die Morphologie des Neurons zu untersuchen. Fügen Sie einen fluoreszierenden Farbstoff (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 ⁴¹⁾ die Verlängerung von Dendriten während der Aufnahme (optional) zu folgen.
   3. Bereiten Sie im Voraus 100 ml Elektrodenlösung für Cell-Attached - Aufnahmen (Tabelle 4). In diesem Fall ist die interne Lösung eine hoch K ⁺ Lösung entwickelt , um die makroskopischen hyperpolarisations-aktivierten Kationen - Strom (I _h) und enthält Blocker für die anderen spannungsabhängigen Ionenkanälen zu isolieren.
   4. Shop intra~~POS=TRUNCZell Lösungen in 2-ml-Aliquots bei -20 ° C. Verwenden Sie ein neues Aliquot für jede neue Aufnahme-Session. Überprüfen Sie die Osmolarität jeder getaut aliquoten sorgfältig mit einem Osmometer. Nehmen Sie eine neue Teilmenge, wenn die Osmolarität auf den Ausgangswert nicht entspricht.
   5. Die Lösung wird aus der aliquoten in eine 3 ml-Spritze auf die Oberseite der ein 0,22 & mgr; m sterilen Spritzenfilter angeordnet ist. Halten Sie die Spritze auf Eis während der Aufzeichnungssitzung Abbau seiner Verbindungen (ATP, GTP oder Phosphokreatin) zu begrenzen.

2. Herstellung und Abfüllung von Patch-Pipette

1. Ziehen
   1. Verwenden Sie eine horizontale Elektrode Abzieher und dickwandige Borosilicatglas Schläuche. Für Ganz-Zell- und Zell-Attached-Aufnahmen, mit einem 2 mm Außendurchmesser / 1 mm Innendurchmesser. Stellen Sie sicher , dass das Glasrohr absolut sauber ³⁸ ist.
   2. Ist dies nicht der Fall ist, Glaskapillaren in einem organischen Lösungsmittel eintauchen (zB Ethanol) Und dann in Wasser bidest. Kurz erhitzen Kapillare Endungen mit einem Bunsenbrenner. Alternativ Schlauch um Glas gewaschen und direkt vom Hersteller (siehe Materialliste) erhitzt.
   3. Für Doppel somatodendritischen Aufnahmen zu gewährleisten, dass die somatischen Pipettenwiderstand zwischen 6 und 10 M & OHgr; ^6,11 und zwischen 8 und 19 M & OHgr; für dendritische Pipetten ist , wenn sie mit der intrazellulären Lösung (Tabelle 3) gefüllt. Standardisieren Pipettenwiderstand für Cell-Attached - Aufnahmen auf einen Widerstand von 10 M & OHgr; vergleichbare Ergebnisse entlang der somatodendritischen Domäne des Neurons ^16,18,42,43 zu erreichen.
   4. Bereiten Sie frische Pipetten vor jeder Aufnahmesession (jeden Tag) oder unmittelbar vor dem Patchen und nutzen sie 5 bis 8 Stunden nach ihrer Herstellung ^39. Shop Pipetten in einem abgedeckten Glasbehälter um sie vor Staub und Verstopfung der Spitze zu schützen.
2. Polieren
   1. Überprüfen und heat-Politur jeder Pipettenspitze mit einem Mikroschmiede bessere Dichtungen mit der Membran zu erhalten. Vor der Mikroschmiede verwenden, schmelzen ein kleines Stück Glas auf dem Platin Heizwendel. Ersetzen Sie diese Glasbeschichtung auf der Platinfaden täglich für Konstanz (Peter Jonas, persönliche Mitteilung).
      HINWEIS: Pipetten für Cell-Attached-Aufnahmen verwendet wird, kann vor der Wärmepolierschritt beschichtet werden, Hintergrundrauschen zu reduzieren. Beschichtung kann mit einem Isolationsmittel, wie geschmolzenes Dentalwachs ^22,44 oder einem Silikonelastomer ³⁹ erreicht werden.

3. Herstellung von Hirnschnitten

1. Verwenden Sie gesunden Wistar-Ratten im Alter zwischen 16 bis 19 Tage alt. Verwenden Sie keine ungesunde Tiere oder Tiere an Unterkühlung oder Austrocknung leiden. Bevor die Herstellung von Scheiben beginnen halten das Tier in einer sicheren und ruhigen Platz. Vermeiden Sie jedes andere Tier im Raum, während ein Tier vor. Manipulieren sanft Tiere.
2. Gießen Saccharose-ACSF in zwei 400ml Polypropylen (PP) Becher und legen Sie sie in der -80 ° C Gefrierschrank für 45 min. Mischen Sie die Lösung eine homogene eiskalten Flüssigkeit / gefrorene Lösung zu erhalten und legen Sie die Becher auf dem Eis. Versorgen Sie die Saccharose-ACSF Lösung mit Carbogen Gas eine Mikro Kerze (Ø 13 mm) in jedem PP-Becher mit.
3. Bereiten Sie die Schneidemaschine und die Reservekammer
   1. Verwenden Sie eine qualitativ hochwertige Gewebeschneider mit extrem niedrigen vertikalen Vibrationen ^5,38 Schäden an den oberflächlichen Schichten von Scheiben so weit wie möglich zu minimieren. Fix ein frisches und ganze Rasierklinge auf der Schneidemaschine.
   2. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge für jede Schneid Sitzung. Vermeiden der Rasierklingen Biegen. Nicht die Fettfilm an der Oberfläche der Rasierklinge (Josef Bischof, persönliche Mitteilung) zu entfernen.
   3. Falls vorhanden, überprüfen Sie die vertikale Schwingung mit einer vibroprobe vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Alternativ können Sie eine maßgeschneiderte vibroprobe ^5. Reduzieren Sie die vertikalen Schwingungen des Blattes so als sein so nahe wie möglich auf 0 & mgr; m.
   4. Bereiten Sie eine 150 ml Reservekammer ^45,46 für Scheiben , wie auf Seite dargestellt. 201 in Ref. ^39. Gießen Standard ACSF in die Reservekammer und legen Sie sie in einem Wasserbad. Versorgen Sie die Reservekammer Lösung mit Carbogen eine Mikro Kerze (Ø 6 mm). Stellen Sie sicher, dass die Carbogen Blasen möglichst klein sind.
      HINWEIS: Erstellen Sie eine neue Reservekammer alle 2 - 3 Monate, um die Scheibenqualität konstant zu halten.
4. Cut Scheiben
   1. In einem stillen Raum, in dem der Experimentator nicht gestört oder gestresst, enthaupten, das Tier mit einer Operation Schere (Länge 150 mm) auf der Höhe des Halsmarks.
   2. Schneiden Sie die Haut an der Spitze der den Kopf des Tieres in der Nasen zu kaudal mit einem Skalpell und entfernen Sie ihn seitlich. Schneiden Sie die Spitze des Schädels vom kaudal der Nasen Teil des Kopfes mit einer feinen Schere und entfernen seitlich beide Teile des Schädels. Entfernen Sie die bregen mit einem dünnen Spachtel und vorsichtig in eine PP - Becher fallen enthält eiskaltem (0-4 ° C) Saccharose-ACSF ³⁸ mit Carbogen äquilibriert.
      ANMERKUNG: Diese Abfolge von Schritten muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, sondern auch sorgfältig (<< 1 min, etwa 40 s).
   3. Halten Sie das Gehirn in der Lösung des PP-Becher für ~ 2 bis 5 min. Stellen Sie die Carbogen Druck auf die Bewegungen des Gehirns zu vermeiden. Ersetzen Sie die Mikro Kerze, wenn die Carbogen Blasen zu groß mit einem frischen eins sind.
   4. Legen Sie das Gehirn auf einer 9 cm Petrischale , in der der Innenboden mit a ~ 0,5 cm dicke Sylgard Schicht ³⁸ bedeckt ist. Bereiten Sie diese Petrischale im Voraus.
   5. Umgeben das Gehirn mit eiskaltem Saccharose-ACSF. Stellen Sie sicher, dass einige flüssige Phase von ACSF-Saccharose-Lösung das Gehirn eintaucht. Für koronalen Scheiben, schneiden Sie den frontalen Teil des Gehirns in der koronalen Ebene mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge ab. Entfernen Sie das Cerebellum mit einem koronalen Schnitt.
   6. bewerben CyanoAcrylat - Kleber auf der Probenschale (Fläche ca. 1 cm ^2). Fügen Sie den Gehirn blockieren, so dass der vordere Teil der Slicing-Bühne steht. Sorgfältig abtropfen Saccharose-ACSF oben auf dem eingefügten Gehirn die große Öffnung einer Glaspasteurpipette und anschließend langsam die Schneidkammer des Slicer versenken. Manövrieren Sie die Probenschale , so dass die Schnittfläche (dh das erste Gewebe treffen die Klinge) ⁴⁰ der ventralen Oberfläche des Gehirns ist.
   7. Bewerben Carbogen mit gebogenem Glas Mikro Kerze (Ø 6 mm) an der Schneidkammer (optional).
   8. Stellen Sie die Rasierklinge in einem Winkel von ca. 15 ° mit Bezug auf die horizontale Ebene ^5. Schneiden Sie koronalen Hirnschnitten von ~ 500 & mgr; m in der kaudal nasalen Richtung vor der Substantia nigra zu erreichen. Verringern Sie die Dicke 300 zu schneiden - 350 & mgr; m dicke Scheiben, die Region von Interesse enthält.
   9. Separate Scheiben aus dem Gewebeblock mit einer sehr dünnen Nadel Perfusion aneine Spritze, die parallel zur Kante der Rasierklinge. Biegung der Nadel, um einen Winkel von 90 ° zwischen der Nadel und der Spritze zu haben. Sicherzustellen, dass kein Druck auf die Rasierklinge aufgebracht wird, während die Scheibe aus dem Gewebeblock zu entfernen.
5. Shop Scheiben
   1. Übertragen Sie die Scheiben die größte Öffnung einer Glaspasteurpipette (an einer Glühbirne) in die Vorratskammer mit. Sobald alle Scheiben in die Reservekammer übertragen werden (Christoph Schmidt-Hieber, persönliche Mitteilung) bringen die Temperatur des Wasserbades auf 34 ° C für 0,5 bis 1 h.
   2. Nach Ablauf dieser Zeit schaltet das Wasserbad und halten Sie die Scheiben bei Raumtemperatur ab. Stellen Sie die Carbogen Druck, um Bewegungen der Scheiben in der Reservekammer zu vermeiden. Halten Sie die Scheiben für weitere 10 bis 20 Minuten vor der Aufnahmen zu starten.
   3. Reinigen Sie das Gerät und die Mikro Kerzen sorgfältig noch gründlich mit doppelt destilliertem Wasser am Ende des slicing Verfahren.

4. Doppel Somatische und Somatodendric Recordings in nigral Neurons und Biocytin Einreichung

1. Folgen Sie Beschreibungen für die Montage eines Patch-Clamp - Setup für Scheiben im Axon - Führer gegeben und in Refs. ^39,40,47. Informationen mehr grundlegende Aspekte der Patching betreffen , sind in Ref. ^48.
2. Bereiten Sie die Aufnahme Kammer
   1. Platz 1 - 2 ml doppelt destilliertem Wasser in der Aufzeichnungskammer. Stellen Sie sicher, dass es nicht undicht ist. Legen Sie die Aufnahmekammer auf der Verschiebung xy-Tisch.
   2. Feed-Standard ACSF durch eine sauerstoffundurchlässige Perfusions-Schlauchsystem (Polytetrafluorethylen) auf die Aufzeichnungskammer. Stabilisierung der Perfusion Strömung in der Kammer mit einer Rate von 4 bis 5 ml min ^-1. Halten Sie die Länge des Schlauchs verbindet den Becher ACSF und die Aufnahmekammer so kurz wie möglich (1 m) enthält.
   3. Wählen Sie eine Hirnschnitt aus der Reservekammer und übertragen sie indie Aufnahmekammer die größte Öffnung einer Glaspasteurpipette. Decken Sie die Scheibe mit einem Platinring es an der Unterseite der Aufnahme Kammer zu verankern, wie auf Seite dargestellt. 201 in Ref. ^39. Verwenden Sie einen flachen Platinring (Ø 1,5 cm) und kleben parallel Nylonfäden (Abstand> 2 mm) auf sie.
3. Anpassung und Optimierung der Optik
   1. Visualisieren Sie die Scheiben mit Infrarot (IR) Videomikroskopie ^4,47,49,50. Stellen Sie die Köhler - Beleuchtung ⁵¹ und optimieren Differentialinterferenzkontrast (DIC) ⁵¹ Optik oder die schräge Beleuchtung (Dodt Gradient Kontrast - DGC) ^52,53. Weitere Einzelheiten zu diesem Verfahren sind in Refs gegeben. ^40,49.
   2. Prüfen Sie die Qualität der Scheibe. Nur halten Scheiben mit glatten und ebenen Oberflächen, die nicht zu stark gegenübergestellt werden und haben nur kleinen, verstreuten Kratern.
   3. Füllen Sie 2 frisch und unverbraucht Patch-Pipetten mit intrazellulären Lösung ( Tabelle 3). Verwenden Sie ein 0,5 ml-Röhrchen die Pipette Lösung, die die Spitze der Pipette durch Kapillarwirkung Aktion zu füllen. Um die Spitze Füllung der Pipetten ohne Filament beschleunigen, gelten Unterdruck auf das Ende der Pipettenschlauch an einer Spritze befestigt werden.
4. Positionieren Sie die Pipetten über der Oberfläche der Scheibe
   1. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Chloridbeschichtung auf den Silberdrähte (Bad Referenzelektrode und Patch - Elektrode; für Details siehe die Axon - Führer und Refs ^39,54.).
   2. Legen Sie die Pipetten der Reihe nach in den Pipettenhalter und gelten Überdruck (~ 70 mbar) ein Schlauchkreislauf mit dem Pipettenhalter verbindet, einen Dreiwegehahn und ein Manometer ^40. Senken Sie die Pipette in das Bad der Aufnahmekammer.
   3. Überprüfen Sie, ob der Druckwert am Manometer für ~ 1 konstant ist - 2 min. Wenn der Druck abnimmt, überprüfen Sie den Schlauch oder die O-Dichtringe in der Pipettenhalter.
   4. Setzen Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Videomonitor und sicherzustellen, dass sie nicht behindert wird. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze nicht bewegt, wenn die Anwendung oder die Freigabe Druck auf die Pipette.
   5. Prüfen Sie, ob Drift und Vibrationen der Pipettenspitze durch ein kleines Kreuz in der Mitte des Monitors genau an der Position der Pipettenspitze zeichnen und beobachten 5 min möglichen Bewegungen der Spitze.
   6. Tragen Sie eine Spannungsstufe (5 mV) die Pipette Widerstand auf einem Oszilloskop zu überwachen. Stellen Sie das Haltepotential des Patch-Clamp-Verstärker auf 0 mV. Abbrechen Pipette Potenzial so versetzt, dass die DC - Pipettenstrom Null am Verstärker Meter ^39,51 liest.
   7. Verschieben Sie die Pipetten bis auf die Scheibe und halten sie über die Oberfläche.
5. Wählen und ein Neuron mit langen Dendriten Patch
   1. Innerhalb der Substantia nigra eines gesunden Neuronen mit langen Dendriten auszuwählen, die in etwa der gleichen pl über eine lange Strecke folgen kannane (1A und 1B) unter Verwendung von IR-Dodt Gradientenkontrast (IR-DGC). Wählen Sie eine glatte und homogene Zellkörper. Zu vermeiden , die beiden stark kontras Zellen an der Oberfläche der Scheibe (1C und 1D), da es schwierig ist , zu brechen und stabile Aufzeichnungsbedingungen über die Zeit (stable Reihenwiderstand) zu bewahren. Wählen Neuronen, die ihre soma 10 haben - 30 & mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche.
   2. Bewegen Sie die somatischen Elektrode nahe der soma (40 - 50 & mgr; m entfernt) und die dendritischen Elektrode nahe der Dendriten in der gleichen Entfernung. Verwenden Sie ein 2-facher Vergrößerung (vierfach-Wechsler) zu wählen und einen Teil eines Dendriten patchen. Erhalten Sie auf dem Monitor eine absolute Vergrößerung von 2,100X ohne Vergrößerung (1X) und von 5,500X mit 2-facher Vergrößerung.
   3. Leicht den Druck des somatischen Pipette von 10 mbar. Bei Bedarf regulieren Druck dendritische und somatische Pipette Verschiebung des c zu vermeidenell Struktur (soma und Dendriten) innerhalb der Scheibe.
   4. Positionieren Sie die dendritischen Pipette nahe an der Membran, um einen kleinen Grübchen zu sehen. Lassen Sie den Druck auf die Pipettenspitze und flicken die Dendriten, während die Pipette Widerstand zu steuern. Unter idealen Bedingungen nur eine sehr geringe Saugwirkung ist ausreichend, um eine gute Abdichtung zu erhalten.
   5. Halten Sie die dendritischen Pipette in der Cell-Attached-Modus. Bewegen Sie den somatischen Pipette nahe der somatischen Membran und die somatische Membran patchen. Stellen Sie sicher , dass eine hohe Dichtungswiderstand vor Zerreißen der Zellmembran erhalten wird (> 1 GOhm) ^39. Leicht beide Pipetten zurückzuziehen von der Membran durch ein paar & mgr; m entfernt Verformung des Zellkörpers und Dendriten zu verhindern.
   6. Für beide Pipetten, reduzieren , so viel wie möglich , die Amplitude der Pipettenkapazitäts Transienten auf dem aktuellen Schritt einen Spannungsimpuls mit hoher Verstärkung und wenig Filterung ⁵¹ und dem Oszilloskop. Geben Sie in die Ganzzell-Modus with die dendritischen Pipette und anschließend mit der somatischen Pipette.
   7. Beseitigen Sie die Ganzzellkapazität Transienten und kompensieren für Serienwiderstand. Überwachen und zu dokumentieren den Zugangswiderstand zu Beginn und regelmäßig während das Experiment. Wenn Serienwiderstand zu hoch ist (> 50 M & Omega;), mit einer anderen Pipette wiederholen.
   8. Sammeln Sie IR-DGC Bilder (1A und 1B) mit einer Videografikdrucker ^25, einen Framegrabber oder eine Digitalkamera bei hohen und niedrigen Vergrößerungen.
      HINWEIS: Anschwellen von Neuronen während der Aufnahme (Abbildung 1E und 1F) wird sporadisch beobachtet, aber nur selten , wenn die Osmolarität und pH - Wert von Lösungen korrekt ³⁹ eingestellt.
   9. Erhalten Doppel somatischen whole-cell - Aufnahmen (soma - Soma) mit dem gleichen Verfahren (Abbildung 2A).
6. Tragen Sie lange (mehrere hundert ms) zunehmende depolarisierende sequentiell aktuellen Schrittemit der somatischen und dendritischen Pipette zu evozieren APs (2B, 3C und 3D). Nehmen Sie das resultierende Potential an der dendritischen und somatische Pipette gleichzeitig.
7. Untersuchen Sie die Ausbreitung von künstlichen exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (aEPSPs) in dopaminergen Neuronen
   1. Erstellen Sie ein exzitatorischen postsynaptischen Strom (EPSC) Wellenform als Strombefehl während Dual - Current-Clamp - Aufnahmen (4A und 4B) zu injizieren. Dazu bauen eine doppelte Exponentialfunktion mit Amplitude und Zeitverlauf Werte entsprechend realen Werten gemessen für EPSCs in das Neuron von Interesse ^55. kontrollieren sorgfältig die Abtastraten des konstruierten EPSC und der injizierten EPSC Wellenform des ursprünglichen Zeitverlauf zu erhalten.
      Hinweis: Bevor Sie die Wellenform in einem realen Neuron Anwendung, testen Sie es eine Modellzelle.
   2. Sequenziell injizieren, um die Wellenform über den dendritischen undsomatische Pipette und Aufzeichnung resultierenden Potentiale für beide somatischen und dendritischen Pipetten gleichzeitig. Überprüfen Sie regelmäßig auf mögliche Drift von Pipetten.
8. Beenden der Aufzeichnung von einem Neuron
   1. Nehmen Sie einen IR-DGC Bild bei geringer Vergrößerung (Ziel: 5 oder 10) die Position des Neurons innerhalb der Schicht und den Elektroden zu dokumentieren.
   2. Langsam und vorsichtig den dendritischen und die somatischen Pipetten aus der neuronalen Membran sequentiell zurückziehen, um Outside-out-Patches mit beiden Pipetten zu bilden. Nehmen Sie die Pipette eine Folge von Seiten-Aufwärtsbewegungen ³⁸ verwenden. Diese sollten zunächst kurz sein und dann nach und nach in der Länge zu erhöhen. Diese Aufnahme Konfiguration begünstigt die richtige Schließen der Zellmembran.
   3. Überwachung der Abnahme der kapazitiven Ströme (Erhöhung der Zugangswiderstand) in Reaktion auf eine 5 mV Spannungsimpuls in Voltage-Clamp, während die Pipette zurückzieht.
   4. Sobald die Membran Meerder Pipettenspitze herumgeführt, nehmen Sie es vollständig aus dem Aufnahmeraum. Entfernen Sie das Ziel aus dem Bad. Halten Sie die Scheibe im Aufnahmeraum für 15 bis 20 min in Standard ACSF Äquilibrierung von biocytin zu ermöglichen (von der intrazellulären Lösung) in dem aufgezeichneten Neuron.
   5. Sanft übertragen die Scheibe die große Öffnung einer Pasteur-Pipette in ein 25 ml breiten Mund Bernstein (braun) Glasflasche mit Standard-ACSF verwenden. Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe. Siehe Abschnitt 6 für den Fixierungsschritt.

5. Cell-Attached-Recordings

1. Wählen Sie ein Neuron mit einem Dendriten in der gleichen Ebene über eine lange Strecke erstreckt. Sicherzustellen, dass die Dendriten von Interesse kann auf eine gut definierte soma folgen.
2. Füllen Sie den Patch - Pipette mit Elektrodenlösung (Tabelle 4). Entwerfen Sie die Lösung, die die aktuelle Interesse an der Cell-Attached-Konfiguration, indem spezifische pharmakologische Mittel zur Aufzeichnung eines anderen Ions cha zu blockierennnels.
3. Patchen die Dendriten in der Cell-Attached - Modus
   1. Visualisieren Sie einen Teil des Dendriten und nähern sich der Umkodierung Pipette den Manipulator mit. Passen Sie den Druck an der Pipettenspitze durch das Manometer Überprüfung (70-80 mbar) Verschiebung des Dendriten zu vermeiden. Patchen die Dendriten, wie in 4.5.4 beschrieben.
   2. Aufzeichnung einige IR-DGC Bilder (5A). Versuchen Sie, eine Dichtungswiderstand so groß wie möglich (> 1 GOhm ³⁹⁾ zu erhalten, bestenfalls zwischen 3 bis 10 G & Omega; für Cell-Attached - Aufnahmen ¹⁸ (5B). Einzufahren die Pipette von der Membran durch ein paar & mgr; m Verformung des Dendriten zu verhindern.
   3. Beachten Sie Aktionsströme in der Zelle-Attached-Modus reflektiert spontanen Aktionspotentiale von nigral Neuronen. Ergänzen Sie die ACSF mit Ca ²⁺ und Na ⁺ Kanalblocker (CdCl ₂ und TTX, jeweils) Aktionsströme zu unterdrücken.
   4. Tragen Sie eine 2 svoltage Schritt von -90 mV von einem Haltepotential von 0 mV zu dem Patch I _h (5C) hervorzurufen. Beachten Sie, dass die Pipette Potential und das Ruhemembranpotential in Serie sind in der Zelle-Attached - Konfiguration ^56. Weitere Informationen finden Sie im Axon Führung und Ref. ^39.
   5. Überprüfen Sie regelmäßig auf mögliche Drift der Pipette.
   6. Am Ende der Aufzeichnung, Ruptur des Patches in der whole-cell-Modus zu gehen und sofort eine Auslesung des Membranpotentials aufzunehmen. Ziehen Sie die Pipette wie in den Abschnitten 4.8.2 und 4.8.3 beschrieben ein Outside-out-Patch zu erhalten.
4. Nehmen Sie aus dem entsprechenden soma in der whole-cell - Modus
   1. Schauen Sie entlang der Dendriten und suchen die entsprechenden soma. Verwenden Sie eine hochohmige Pipette (von 5 bis 10 M & Omega;) ^6,14,57 gefüllt mit K ⁺ -basierte intrazellulären Lösung (Tabelle 3). Tragen Sie eine kurze Absaugung (Unterdruck) auf diePipettenspitze, die Membran, um Bruch in der whole-cell-Modus aufzurufen.
   2. Überprüfen Sie, ob die Identität des Neurons in Current-Clamp durch lange hyper- Anwendung und Strom Schritte (5D) depolarisierende und erlauben Biocytin entlang Dendriten zu diffundieren. Bewerben kurzen depolarisierenden aktuellen Schritte, um die AP Zeitverlauf sichtbar zu machen.
   3. Nach ≤10 min, ziehen Sie die Pipette ein Outside-out-Patch zu erhalten, wie in den Abschnitten 4.8.2 beschrieben - 4.8.3. Sanft übertragen die Scheibe die große Öffnung einer Pasteur-Pipette in einen 25-ml-Braunglasflasche mit Standard-ACSF verwenden. Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe.
   4. Alternativ kann zuerst eine somatische whole-cell mit einer Pipettenlösung zusätzlich einen fluoreszierenden Farbstoff enthält, erhalten. Ermöglichen , die Diffusion des Farbstoffes und wählen einen Teil eines Dendriten ^26. Mit einem zweiten Pipette, flicken die Dendriten in der Cell-Attached-Modus. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, wenn verfügbar, um die Visualisierung des fluoreszenz Etikett zu verbesserned Dendriten ^14,22.
   5. Führen dendritischen Aufnahmen in der Outside-out - Konfiguration, alternativ oder zusätzlich zu den Cell-Attached - Aufnahmen ^10,22. Siehe ein Beispiel einer spannungsabhängigen Ströme von einer Outside-out - Patch in 5E und 5F aufgezeichnet.

6. Biocytin Labeling nigraler Neurons

1. Fixierung des Gewebes
   1. Wenn möglich, verwenden Sie getrennte Räume für die Scheibe Aufnahme / histochemische Verarbeitung ^38.
   2. Fixieren die Scheiben durch die ACSF mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer-Salzlösung ersetzt (PBS, pH = 7,4) mit einer Pasteur-Pipette. Verwenden Sie immer frisch Fixierungslösung (<< 1 Woche alt) vorbereitet.
      ACHTUNG: Verwenden Sie geeignete Handschuhe und eine Chemikalie in einem histologischen Labor platziert Haube Paraformaldehyd zu manipulieren wegen seiner Toxizität. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt dieser gefährlichen Produkt vor Gebrauch und cHeck der Vorschriften über chemische Sicherheit (Richtlinie über gefährliche Stoffe (67/548 / EWG) von der EU-Kommission), da dieses Pulver wird vermutet, Krebs zu induzieren. Weitere Einzelheiten sind in Ref. ^58.
   3. Legen Sie die Scheiben bei 4 ° C über Nacht. Vermeiden Sie die Kontamination der Patch-Clamp-Setup oder der Ausrüstung für die Elektro von Paraformaldehyd eingesetzt.
   4. Nach der Fixierung, ersetzen Sie die Fixierungslösung mit PBS. Verwenden Sie eine andere Pasteurpipetten für die Fixierungslösung zu entfernen und den PBS Anwendung. Store Scheiben in PBS bei 4 ° C vor der weiteren Verarbeitung (1 - 2 Wochen). In diesem Fall ersetzen PBS zweimal pro Woche. Verwenden Sie immer frisch zubereitet PBS (<< 1 Woche alt).
2. Färbung des Gewebes
   1. Bereiten Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte für die Färbung Schritte. Verwenden Sie saubere Ausrüstung Scheiben zu übertragen. Spülen Sie die Scheiben 3 x 5 min frisches PBS.
   2. Bewerben Fluorescein Avidin- DCS (Avidin- D, Zellsortierer Typ; 1 & mgr; l fluoresCEIN / ml Triton X-100) und 0,3% Triton X-100 in PBS bei 4 ° C über Nacht. Schützen Sie die Scheiben von Licht in der gesamten Färbung. Als Alternative zu Fluoreszenz - Label Neuronen über 3,3'-Diaminobenzidin für licht- oder elektronenmikroskopische Analyse ^21,58.
      ACHTUNG: Triton X-100 ist gefährlich. Lesen Sicherheitsdatenblatt und EU-Richtlinien der Kommission vor der Verwendung dieses Stoffes.
   3. Spülen 3 x 30 min mit PBS und anschließend mit PB (Phosphatpuffer, die Bildung von Kristallen an der Oberfläche der Scheibe zu vermeiden).
3. Montieren Sie die Scheiben auf Standard-Objektträger aus Glas. Decken Sie die Scheiben sorgfältig mit einem Einbettungsmedium. Vermeiden Sie Luftblasen in dem Einbettungsmedium. Legen Sie das Deckglas vorsichtig, um vollständig die Scheibe zu bedecken. Der Luft trocknen die Folien über Nacht, bevor sie mit einem Mikroskop sichtbar zu machen.
4. Speichern Sie die markierten Scheiben bei 4 ° C nach Visualisierung. Nützliche Tricks auf histochemische Verfahren sind in Refs. ^58,59.
5. Reinigen Sie das Gerät für die Histologie und Elektro separat verwendet. Nicht zusammen Histologie und Elektrogeräte mischen.

7. Post - Hoc - Visualisierung von Biocytin gefüllten Neurons

1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Morphologie der verwerteten Neuronen zu visualisieren.
   1. Grob suchen Sie die fluoreszenzmarkierten Neuron in der Scheibe mit Epifluoreszenz. Untersuchen Sie die dendritischen Dorn von Neuronen und suchen Sie das Axon und axonalen Bleb (2 bis 4 & mgr; m Ø) mit einem 10-fach oder 20x-Objektiv verwendet wird. Dokumentieren Sie den Kurs des Axons.
   2. Wechseln Sie zu dem konfokalen Mikroskop und wählen Sie die 488-nm-Laserdiode, die Fluorescein enthalten in dem markierten Neuron zu erregen. Folgen der Verlängerung des Axons und Dendrite in der z-Achse.
   3. Nehmen aufeinanderfolgenden Bildern, um einen Z-Stapel für die gesamte Zelle zu erhalten. Stellen Sie die Auflösung der z-Achse (der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern) zu 0,5 bis 1 & mgr; m. Sammeln Sie konfokale Bilder einer Zelle using niedrig (10X-Objektiv) und hoch (60X Ziel, Öl-Eintauchen) Vergrößerung.
   4. Öffnen Sie die Bilddatei des Neuron mit dem konfokalen Mikroskop mit einer Bildbearbeitungssoftware erhalten (ImageJ) ^60. Vergleichen Sie die z-Projektionsbild mit einem IR-DGC Bild durch das Auge während der elektrophysiologischen Aufzeichnung (1, 2A, 3A, 4A, 5A und 5E) , um die genaue Lage der Patch - Pipetten zu lokalisieren.
   5. Bestimmen Sie morphometries von markierten Neuronen: Messung der Axon - soma Abstand, Abstände zwischen Aufnahme Pipetten entlang der somatodendritische Domäne und zwischen der dendritischen Pipette und Axon mit Hilfe der Funktion "Messen" in ImageJ.
   6. Rekonstruieren einige Neuronen mit NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ oder Neuromantic ^61.

8. Analyse von Daten Elektrophysiologische

1. Verwenden Sie das Softwarepaket mit dem Verstärker verbunden sind, um grob die Daten zu analysieren (zB Clampfit) oder direkt einandere Software für die Datenanalyse wie Stimfit, einem Open - Source - Software ^62,63 , wie in unserer letzten Veröffentlichung ¹³ oder zum Beispiel WinWCP.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll beabsichtigt, die Sammlung von Daten unter Verwendung von dendritischen Patch-Clamp-Aufnahmen zu erleichtern. Diese Technik, kombiniert mit post hoc Histochemie hilft Einblicke in die Mechanismen vieler elektrischer Signale in Dendriten Ursprung oder Ausbreitung zu gewinnen. Direkter Zugriff auf Dendriten mit Patch-Pipetten ist schwierig, aber ein besonderes Augenmerk auf einige methodische Aspekte werden die Erfolgsrate der Aufnahmen zu verbessern. Ein Experimentator ausreichend stabilen somatischen Aufnahme erfahren können damit rechnen, auf die meisten Versuche mit hohem Widerstand (G & Omega;) Dichtungen und vollständige Experimente zu erhalten. Ein bis zwei hochwertige dendritischen Aufnahmen können pro Präparation gesammelt werden.

Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Hirnschnitten mit gesundem somata und Dendriten ist eine Voraussetzung für den Zugriff auf diese feinen Strukturen (Abbildung 1). Die criteriein für diese Neuronen Auswahl sind eine glatte und homogene Oberfläche der ganzen Zelle und einer soma und Dendriten mit geringem Kontrast , wenn sie mit optimal angepasst Optik (1A und 1B) beobachtet. Auswählen von Neuronen zu stark im Allgemeinen führt zu instabilen Aufnahmen (1C und 1C) gegenübergestellt . Daher werden solche Neuronen vermieden werden sollte.

Im Vergleich zu anderen Neuronen zeigen nigral DA Neuronen spezifischen morphologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften. Diese Funktionen , die normalerweise mit einem einzelnen somatischen Pipetten beurteilt kann auch in Doppel somatischen (Abbildung 2) und somatodendritischen Aufnahmen (Abbildung 3) beobachtet werden. Lange hyperpolarisierender Strominjektionen induzieren ein Membranpotential Rektifikation genannt 'sag' (2B und 5D). Das Axon stammt, in den meisten Fällen auf einer dendritischen Website identifiziert alsVerwendung komplementärer Kriterien ^13,25,26, was anzeigt , dass die dendritischen Kompartiment in diesen Neuronen heterogen ist (3A - 3B). Als Folge davon , wo das Fach der AP entspricht beobachtet wird zuerst dem Fach , in dem das Axon (3C - 3D) austritt ^13,25,26. Das Axon wird von einem axonalen Bleb verursacht durch eine Schneid des Axons während des Schneidens ^64, aber diese Struktur nicht systematisch erfasst im Allgemeinen beendet.

Die ausgeprägte sag beobachtet in nigralen DA - Neuronen in Folge der Aktivierung von I _h deutet auf eine hohe Expression von HCN - Untereinheiten. Um den Einfluss von I _h auf die Integration von synaptischen Signale, synaptic artigen Strom (EPSC) Wellenformen bestimmen wurden über die dendritischen Aufzeichnungselektrode während somatodendritische Dual Aufnahmen ⁵⁵ ( Abbildung 4). Die Kinetik dieser simulierten EPSCs wurden auf den Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des realen spontanen EPSCs basiert. Die sich ergebende aEPSP wurde mit dem somatischen Elektrode aufgezeichnet. Badanwendung der I _h blocker ZD 7288 erhöht , um die Dauer der aEPSP, was darauf hinweist , den Beitrag von I _h zu den Zeitverlauf der synaptischen Signale (4B). ZD 7288 beseitigt auch das Membranpotential Rektifikation bestätigt , dass die SAG ergibt sich aus der Aktivierung von I _h (4C). Die Ergebnisse mit simulierten EPSPe erhalten könnte Experimente korreliert werden unter Verwendung von elektrisch evozierten EPSPe ^65. Um die genaue Verteilung des Kanals in der somatodendritische Domäne von DA - Neuronen, Cell-Attached - Aufnahmen Karte implementiert wurden (Abbildung 5). Eine hochohmige Dichtung (>> 1 G & Omega;) ist eine absolute Notwendigkeit für Cell-Attached - Aufnahmen (5B I _h langsam mit langen hyperpolarisierender Spannungsschritten und der Strom im stationären Zustand wird nach Hunderten von ms (5C) erreicht, wie zuvor ⁶⁶ gezeigt. Diese Beobachtung zeigt , dass HCN - Kanäle in Dendriten von DA - Neuronen haben unterschiedliche Untereinheiten im Vergleich zu denen in pyramidalen Neuronen oder andere Zelltypen exprimiert ^10,16,66. Da die Verteilung des Kanals in dem dendritischen Kompartiment inhomogenen sein könnte und als das dendritische Kompartiment selbst heterogen ist, wird die Identität des Dendriten (Axon-Lager oder nonaxon tragenden Dendrit) ergab durch die IR-DGC Bild mit dem konfokalen Bild zu vergleichen nach Biocytin Färbung (3A und B). Wiederherstellung der Zellmorphologie ist daher notwendig, für beide Dual somatodendritische Aufnahmen und für Cell-Attached-Aufnahmen über nachfolgende somatischen Ganzzellableitungen.

Abbildung 1. Soma und proximaler Dendriten nigraler dopaminerge Neurone Mit Infrarot - Videomikroskopie sichtbar machen . (A) IR-DGC Bild eines nigral DA Neuron die soma und proximalen Dendriten und beide somatischen und dendritischen Pipetten zeigt. Ein Dual-somatodendritische Aufzeichnung wurde erfolgreich auf diesem gesunden Neuronen durchgeführt. Beachten Sie die niedrigen Kontrast und die glatte Oberfläche der ganzen somatodendritische Domäne der Zelle. (B) Ein weiteres Beispiel für ein gesundes DA Neuron. (C) DA Neuron mit einer raueren und unebenen Oberfläche und einer stärkeren Kontrast. Während ein Doppelaufzeichnung erhalten wurde, war die Stabilität suboptimal und die Aufzeichnungsdauer war kurz (~ 15 min) durch eine allmähliche Zunahme des Zugangswiderstand an beiden Pipetten. (D) zweites Beispiel eines DA Neuron ein stark kontrastierte zeigt soma und proximalen Dendriten. In diesem Fall wurde eine starke Erhöhung der Zugangswiderstand beobachtet kurz nach der Pause in der whole-cell-Modus. Ein Versuch, den Zugangswiderstand durch Unterdruck zu verringern, war nicht erfolgreich. Neurone in Panel C und D können sich während der Schneideverfahren beschädigt wurden und sollte für Versuche vermieden werden. (E) Simultaneous Doppel somatischen Aufzeichnung in einem gesunden DA Neuron zu Beginn der Aufzeichnung. (F) Das gleiche Neuron , wie in Tafel E mit eine geschwollene Zellkörper nach 17 min ~. Notieren Sie sich die vollständige Abwesenheit von Kontrast, die kugelartige Erscheinung des Somas und die Anwesenheit des großen Kern , die nicht offensichtlich in gesunden Neuronen ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2. Simultane Doppel Somatic Aufnehmen von einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild während der Doppel somatischen Aufnahme von einem DA Neuron. (B) hyperpolarisierender und depolarisierende 1 s lang Strominjektionen (-160 bis 80 pA, erhöhen 80 pA) und entsprechenden Spannungsänderungen gleichzeitig mit beiden Patch-Pipetten aufgezeichnet. Beachten Sie das Vorhandensein des Durchhangs in der Spannungsverlauf mit dem langen hyperpolarisierender aktuellen Schritt und die große After-Hyperpolarisation nach dem AP während des depolarisierenden Stromimpuls. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Doppel - S omatodendritic Aufnahme in einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen dem dendritischen und Somatic Pipette ist 29 & mgr; m. (B) Konfokale Z-Projektionsbild des Neurons in Feld A mit Avidin an Fluoresceinisothiocyanat markiert konjugiert (FITC). Das Neuron wurde während der Aufnahme mit biocytin gefüllt. Das Axon stammt von einem proximalen Dendriten der Nähe des soma , wie durch den Pfeil angezeigt. (C) Simultaneous Dual somatodendritische Ganzzellspannung Aufnahme von dem Neuron in der Abdeckung A. AP im soma (schwarz Spannungsspuren) und Dendriten (rot Spannung aufgezeichnet in Reaktion Spuren) auf eine lange Strominjektions Schritt s 1 über die somatischen (links, schwarz Stromspur) und alternativ dendritischen Pipette (rechts, rot aktuelle Trace) (D) somatische und dendritischen AP in gedehnten Zeitskala angezeigt.. Mit entweder somatischen oder dendritische Strominjektion, die somatische AP (schwarz) voran die dendritische AP (rot). Die Verzögerung zwischen APs in diesem Neuron betrug 120 & mgr; s und 210 & mgr; s mit somatischen und dendritischen Stromeinspeisung sind. Verzögerungenwurden bei AP halb-maximale Amplitude während der Anstiegsphase des AP gemessen. Der AP wird zunächst der Nähe in der Kammer beobachtet , auf die das Axon auftaucht, bestätigt frühere Beobachtungen ^25,26. In diesem Fall wird die dendritische Aufnahme von einer Axon-Dendrit fehlt gemacht. Ein Beispiel für eine Aufnahme von einem Axon-Lager Dendriten ist in Ref. ¹³ (in ihrer Abb. 1). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Die Ausbreitung von Artificial EPSPe Entlang der somatodendritische Achse des DA Neurone. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen der dendritischen und somatische Pipette 45 um. Beide Patch - Pipetten sind in der gesamten Zellenstrom-Clamp - Aufnahmemodus. (B) Strommit der dendritischen Pipette in Current-Clamp aufgezeichnet und verwendet, um die künstliche EPSP (oben) zu erzeugen. (; Τ _Zerfalls = 3 ms, Amplitude = 100 pA τ _Anstieg = 0,6 ms) über die dendritischen Aufzeichnungspipette ⁵⁵ wird der Strom durch die Injektion eines EPSC artigen Wellenform erhalten. Am unteren propagierte aEPSPs im SoMa in Kontrollbedingungen (schwarz) aufgezeichnet und nach dem Bad Anwendung des I _h - Blocker ZD7288 (30 & mgr; M; rote Kurve). Jede Spannungsverlauf ist der Mittelwert von 40 Einzel fegt. Beachten Sie die große Zunahme der EPSP Dauer in Gegenwart von ZD7288 anzeigt , den Beitrag von I _h zu dem zeitlichen Verlauf der EPSPs. (C) Spannungs Spuren von Soma in Kontrollbedingungen aufgezeichnet (schwarz) und nach der Anwendung von 30 uM ZD 7288 ( rot) in Reaktion auf einen langen (30 pA; 1 s) Hyperpolarisieren aktuellen Schritt. Bemerke die Abwesenheit des Membranpotentials Rektifikation (SAG) nach der Blockierung des I _{h. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.}

Abbildung 5. Das Vorhandensein von I _h in Dendriten von DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron und Pipette auf proximalen Dendriten. (B) Kapazitive und Leckströme während einer 5 mV Spannungsbefehl in Cell-Attached - Konfiguration. Der Dichtungswiderstand betrug 5 GOhm in diesem Beispiel (C) hyperpolarisierender Spannungsstufe. (90 mV; oben) aus einem Membranpotential von 0 mV einen langsam aktivierenden I _h induziert. Die aktuelle Spur wurde umgedreht und mit einer einzigen Exponentialfunktion ausgerüstet , der eine Zeitkonstante von τ = 632 ms zu geben. (D) SpannungAntworten der whole-cell aufgezeichnet soma (Panel A) bis 1 s hyper- und depolarisiert Stromimpulse (-160 bis 120 pA, 40 pA Inkrement). Die somatischen Ganzzell Aufnahme wurde nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung durchgeführt. Beachten Sie die Abwesenheit von APs durch die extrazelluläre Applikation von TTX und Cd ²⁺ spontane Zündung während Cell-Attached - Aufzeichnung zu unterdrücken. Diese spannungsgesteuerten Na ⁺ und Ca ²⁺ Strom - Blocker wurden hinzugefügt Aktionsströme zu unterdrücken. Platten A - D von gleichen Neurons (E) IR-DIC Bild eines anderen Neurons DA und einer dendritischen Pipette (F) spannungsabhängig von einem Testimpuls auf 0 mV von einem 50 ms Vorimpuls bei -120 mV aktiviert Ströme.. in einem Outside-out von dem proximalen Dendriten der Neuronen in der Platte E. Haltepotential -80 mV ausgeschnittenen Patch. Notieren Sie sich die zeitabhängige Inaktivierung des Stroms. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Substanz	g / mol	Konzentration	für 1 L
NaCl	58,443	125 mM	7,305 g
NaHCO 3	84,007	25 mM	2,100 g
KCl	74,551	2,5 mM	0,186 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,172 g
Glucose	198,17	25 mM	4,95 g
MgCl 2	1 M (Lösung)	1 mM	1 ml
CaCl 2	1 M (Lösung)	2 mM	2 mL
Osmolarität: ~ 310 mOsmol / L (optimale Reichweite: 314-325 mosmol / L), pH = 7,4

Tabelle 1: Artificial Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF).

Substanz	g / mol	Konzentration	für 1 L
NaCl	58,443	87 mM	5,084 g
NaHCO 3	84,007	25 mM	2,1001 g
KCl	7,551	2,5 mM	0,18637 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,17248 g
MgCl 2	1 M (Lösung)	7 mM	7 ml
Glucose	198,17	10 mM	1,9817 g
Saccharose	342,29	75 mM	25,672 g
CaCl 2	1 M (Lösung)	0,5 mM	0,5 ml
Osmolarität: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tabelle 2: Saccharose-ACSF vorzubereiten Scheiben schneiden.

Substanz	g / mol	Konzentration	für 100 ml
KMeSO 4	150,2	120 mM	1,8024 g
KCl	74,56	20 mM	0,14912 g
MgCl 2	1 M (Lösung)	2 mM	200 ul
Na 2 ATP	551.1	2 mM	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mM	0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine	255,1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0,1 mM	3,803 mg
Hepes	238,31	10 mM	0,23831 g
biocytin	1 mg / mL		0,1 g
Osmolarität: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 mit KOH eingestellt

Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung für Dual - Aufnahmen.

Substanz	g / mol	Konzentration	100ml
KCl	74,56	120 mM	0,8947 g
CaCl 2	1 M (Lösung)	2 mM	200 ul
MgCl 2	1 M (Lösung)	1 mM	100 ul
Hepes	238,31	10 mM	0,23831
TEA-Cl	165,7	20 mM	0,3314 g
4-AP	94,11	5 mM	0,04705 g
BaCl 2	244,26	1 mM	0,02443 g
CdCl 2	183,32	0,02 mM	0,3666 mg
TTX	1 mM	200 nM	20 ul
Osmolarität: ~ 290 mOsmol / l, eingestellt mit D-Glucose (Ref. 16); pH = 7,4

Tabelle 4: Elektroden Lösung für Cell-Attached - Aufnahmen.

Diskussion

Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Dual somatodendritische Ganzzellableitungen und lokale dendritischen Aufnahmen zu implementieren. Es ist nützlich für den Einfluss von Ionenkanälen zu bestimmen (dh I _h) auf dem zeitlichen Verlauf der postsynaptischen Potentiale und Abbilden der Verteilung des Ionenkanals (I _h) entlang der somatodendritischen Domäne von nigralen DA - Neuronen, respectively. Die resultierenden elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um hoc histochemistry Post Zellmorphologie zu erholen. Das Verfahren wurde eingesetzt DA Neuronen zu untersuchen, in der Substantia nigra, kann aber für benachbarte nigral GABA-Neuronen verallgemeinert werden, Bereich ventralen tegmental DA Neuronen oder andere midbrain Neuronen. Alle Schritte können auch gefolgt werden , um andere Ionenkanäle untersuchen in Dendriten von nigral Neuronen ohne wesentliche Änderungen zum Ausdruck gebracht. Post - Hoc - Visualisierung ist besonders relevant für Neuronen mit Axon-LagerDendriten, wie nigral Neuronen ^25,26, Hippokampus - oriens-alveus Inter ²¹ oder einigen CA1 Pyramidenneuronen ^67. Interessanterweise scheinen Neuronen diese Funktion teilen häufiger zu sein als allgemein ⁶⁷ gedacht. Morphologische Analyse zeigt auch die genaue Lage der Elektroden und axon. Die Detektion des letzteren können im Axon Anfangssegment (spannungsabhängige Na ⁺ -Kanäle oder Ankyrin G) mittels Immunhistochemie ^68,69 ausgedrückt durch die Markierung von Proteinen optimiert werden.

Die Zuverlässigkeit der Daten mit dendritischen Aufnahmen und anschließender neuronalen Kennzeichnung gesammelt, hängt immer von der Scheibenqualität. Maximale Anstrengung muss daher angewandt werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebes zu erhalten. Dies wird mit schonenden Umgang mit gesunden Tieren, hochwertige Werkzeuge und Reagenzien, ausreichend Sauerstoffversorgung der Gewebe und eiskalten Temperaturen während der gesamten Herstellung von Scheiben erreicht. Stabile Aufzeichnungsbedingungen beruhen auf der Auswahl von gesunden Neuronen. In der whole-cell-Modus sollten Serienwiderstand anfänglich so niedrig wie möglich sein und gewartet werden während des gesamten Experiments konstant. Die Stabilität der Aufnahmen ist weiterhin abhängig von hochwertigen Manipulatoren ohne Drift und Vibrationen. Diese Störungen können durch die Optimierung der Pipette Stabilität reduziert werden: die Verbindung zum Pipettenhalter prüfen und zu heads, Controlling, dass Mikromanipulator Kabel sind schlaff, zu vermeiden plötzliche Änderungen der Temperatur oder Tischbewegung und die Überprüfung der Mechanismus des Manipulators. Für Doppelaufnahmen Methylsulfat- ^13,15,21 wurde in der intrazellulären Lösung enthalten, aber Gluconat ^9,14,25 können alternativ verwendet werden. Jedoch kann die Haupt Anion das Membranpotential ^70,71 und einige spannungsabhängige Ströme ⁷² verändern. Intrazellulärer Lösung kann mit ATP, GTP und Phosphokreatin zur Erhaltung der Physiolo ergänzt werdengische Funktionen von Neuronen. Zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff in der Pipettenlösung Zugabe (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 ⁴¹⁾ , um die Dendriten während einer somatischen Aufzeichnung zu visualisieren kann nützlich sein , zum Beispiel eine Druckanwendung zu platzieren (Abbildung 7 in Ref. ⁴¹⁾ oder eine elektrische Stimulations Pipette. Die Pipettenlösung für Cell-Attached - Aufnahmen enthält einen hohen K ⁺ -Konzentration und keine Na ⁺ große I _h zu erfassen. Bemerkenswert der Na ⁺ / K ⁺ Konzentrationsverhältnis beeinflusst die Stromamplitude ^10, das Umkehrpotential des Stroms ¹¹ und die Gating von I _h ^73. Alternativ kann ich _h auch außerhalb Outs ¹⁰ aufgezeichnet werden. In dieser Aufzeichnungskonfiguration jedoch das intrazelluläre Milieu, in der Nähe der Kanäle gestört werden kann. Folglich Unterschiede in der spannungsabhängige Aktivierung von I _{h beobachtet wird beim Vergleich von Strömen mit Cell-Attached - Patches erhalten und außerhalb Outs ^10. Anschwellen von Neuronen wird gelegentlich bei der Patch-Clamp - Aufzeichnung auftreten, und stellt sich oft aus verschiedenen Ursachen, wie die geringe Qualität des Wassers, starkes Ungleichgewicht in der Osmolarität oder pH - Wert zwischen dem intra- und extrazellulären Lösungen ³⁹ oder Fehler in der Zusammensetzung der Lösungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Ableitungen hat eine direkte Auswirkung auf die Qualität der Morphologie der verwerteten Neuronen. (- 10 MOhm, wie in Refs ^6,11. 6) und für einzelne somatische Aufnahmen nach Cell-Attached - Aufnahmen ¹⁴ der Verdünnung des intrazellulären Milieu zu minimieren Hohe Beständigkeit somatischen Pipetten werden für Dual - Aufnahmen verwendet. Die Ganzzell-somatischen Aufzeichnung nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung wird deshalb kurz gehalten (<10 min). Outside-out-Patches von sowohl der somatischen und dendritischen Pipetten sind für die ordnungsgemäße Schließen der cell Membran und die anschließende Erholung der Zellmorphologie. Zusätzlich zu der Struktur der Zelle kann der neurochemischen Inhalt für die aufgezeichneten Neuronen ^59,74 bestimmt werden. So kann beispielsweise die intrazelluläre Protein - Tyrosin - Hydroxylase immunmarkierten zur eindeutigen Identifizierung von DA - Neuronen ¹³ werden.}

DA - Neuronen werden hauptsächlich in der SN pars compacta eingeengt, mit einer viel niedrigeren Dichte in der SN pars reticulata, wo sie sich mit einer höheren Anzahl von GABA - Neuronen ⁷⁵ miteinander vermischt werden. Während die Zellkörper von DA-Neuronen ist oft größer als der GABA-Neuronen, ist die visuelle Identifizierung dieser Zellen mit IR-Videomikroskopie unsicher und teilweise durch die Opazität der pars compacta behindert. Um diese Einschränkungen, die Vorauswahl von DA - Neuronen umgehen kann durch die Verwendung von transgenen Mäusen , erleichtert werden , um einen Fluoreszenzmarker in einer bestimmten Population von Neuronen (TH ⁶⁵ oder DAT für DA - Neuronen exprimiert, GADfür GABA-Neuronen) und Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzfarbstoff in der Lösung der somatischen Elektrode eingeschlossen werden, um die Visualisierung von Dendriten zu erleichtern. Verbesserte Auflösung der Fluoreszenzzelle wird durch Nipkow Kreiselscheibenapplikators konfokalen ^14,22,30 oder Zwei-Photonen - Mikroskopie ⁷ kombiniert , um IR-DGC ⁶ gebracht. Mehrere Vorteile werden DGC im Vergleich zu DIC bezogen. Zunächst wird , wie DIC Prismen nicht erforderlich sind, kann die IR-DGC Bildes mit einem Fluoreszenzbild ^49,52,53,76 überlagert werden. Zweitens kann DGC mit Photostimulation kombiniert und Optogenetik ^77.

Ein Nachteil der Scheibe Vorbereitung ist die Erhaltung der Integrität von Neuronen. DA - Neuronen erweitern ihre Dendriten in den drei Raumebenen ^78,79 und damit Verkürzung des dendritischen Fach nicht vollständig in den Scheiben ⁸⁰ können vermieden werden. Die Wahl der Orientierung der Scheiben (coronal, horizontal oder parasagittal) ist ein Trade-off. Der Ursprung der Innervation und dem experimentellen Design muss berücksichtigt werden, um die richtige Ausrichtung der Scheiben zu wählen.

Direkt dendritischen Patching ist die Technik verwendet, um die Verteilung der funktionellen Ionenkanäle in den verschiedenen Kompartimenten von Zellen abzubilden. Darüber hinaus bietet diese Technik die Variabilität in funktionellen Eigenschaften der Kanäle ²⁰ zu bestimmen. Als Ergänzung kann die Position und Dichte von Ionenkanälen ermittelt werden mittels Immunhistochemie an den Licht- und Elektronenmikroskopie Ebenen ^17,23. Dieser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, die Kanaldichte in kleinkalibrigen Strukturen zu bestimmen, die Patch-Pipetten unzugänglich sind. Jedoch könnten diese Kanäle in einer bestimmten Funktionszustand ²⁴ oder sogar inaktiv im Vergleich zu denen, Patch-Clamp - Techniken aufgenommen werden. Beide Techniken sind daher notwendig, um ein vollständiges Bild von der Lage zu erhalten und die Eigenschaften vonIonenkanäle in einem bestimmten zellularen Bereich ^17. Mit der Entwicklung von spannungsempfindlichen Farbstoffen, Spannung Abbildungs verwendet wurde an mehreren Stellen ⁸¹ , um die Ausbreitung von APs und EPSPs in Neuronen zu untersuchen. Als Alternative zu Dual-Patch-Clamp-Aufnahmen, kann dieser Ansatz auch für dünne Dendriten implementiert werden, die auf Patch-Pipetten nicht zugänglich sind, aber eine genaue Kalibrierung des Signals und Mitteln erforderlich machen.

Während DA-Neuronen im ventral tegmentalen SN und Bereich über somatische Aufnahmen im physiologischen und pathophysiologischen Kontext umfassend untersucht werden, bleibt die funktionellen Eigenschaften ihrer Dendriten in beiden Bedingungen weitgehend unbekannt. Patchen von Dendriten wurde für nigral Dopamin - Neuronen von mehreren Gruppen mit Erfolg ^13,25,26 und bleibt die Methode der Wahl zu sezieren erregbar Eigenschaften dieser feinen subzellulärer Strukturen ⁸ umgesetzt. Dendritische Aufnahmen bieten eine weitere Mögschaft , die Effizienz und die Plastizität der synaptischen Übertragung und die Plastizität der dendritischen Erregbarkeit ^82,83 zu prüfen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Doppelt destilliertes Wasser	Millipore	Super Q	Widerstand >14 MΩ cm, ideal 18,2 MΩ cm bei 25  ° C, gefiltert (0,22 &Mikro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Mikrofilterkerzen	Robu	Porosity 3, 6 mm oder 13 mm Durchmesser
Tissue-Slicer mit Vibrosonde	Leica	VT1200	Schnittparameter: Geschwindigkeit 0,07, Amplitude 1,40
Tissue-Slicer	Dosaka	DTK-1000	Schneidparameter: Geschwindigkeit 4, Frequenz 7
Rasierklingen	Gilette	Super Silver
Präparierwerkzeuge	Braun, Aesculap
Reservekammer			Sonderanfertigungen
PP	Beckers VWR	213-1725	400 ml
Spritzenfilter	Merk Millipore	Millex - GV 0,22 µ m
Cyanacrylat-Kleber	UHU"	Sekunden Kleber"	flüssiger Kleber
Aufnahmekammer	Luigs & Neumann	Slice Minikammer
Horizontaler Pipettenabzieher	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipetten	Hilgenberg	1807524	2 mm Außendurchmesser/1 mm Innendurchmesser Glaskapilare, Enden feuerpoliert, gewaschen
Dentalwachs	Coltè ne/Whaledent		kieferorthopädische Tablett Wachsstreifen
Platingitter			zur Verankerung von Scheiben in der Aufnahmekammer, speziell angefertigt mit einer Platinscheibe
Microforge	Narishige	MF-830	zum Brennpolieren von Pipettenspitzen
Kaliummethylsulfat	MP Biomedicals	215481
Biocytin	Molekulare Sonden	B1592
Manometer	GREISINGER electronic	GDH 13 AN
Mikroskop	Zeiss	FS
Dodt Gradient Contrast	Luigs & Neumann
Manipulatoren	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Framegrabber	Die Bildquelle	DFG/USB2pro
Kamera	DAGE-MTI	NC-70
Kondensor	Zeiss		Kondensor mit hoher numerischer Apertur Arbeiten mit Öl
Objektiv	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63-fache Vergrößerung, große Entfernung, hohe numerische Apertur 1,0 Wasserimmersion Objektiv
Vierfach-Wechsler	Luigs & Neumann		zwischen Kamera und Mikroskop
Schwarz-Weiß-Videomonitor	Sony	SSM-175CE	16 Zoll, 850 TV-Zeilen, analog
Probenflaschen, Braunglas, mit Kappe	VWR	215-2409	zum Transfer von Scheiben aus dem Setup in den Histologieraum
Der Axon Guide Molecular	Devices		Book
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Analyse der elektrophysiologischen Daten
Paraformaldehyd	Sigma	441244	siehe SICHERHEITSDATENBLATT und Gefahrstoffrichtlinie (EU) vor Gebrauch
Well Zellkulturplatte	Greiner-Bio-One	662160	für die Färbung von fixierten Scheiben
Triton X-100	Merk	108643	siehe SICHERHEITSDATENBLATT und Gefahrstoffrichtlinie (EU) vor der Verwendung
Maus Anti-TH monoklonaler primärer	Immunostar	22941	Arbeitskonzentration: 1/1.000
Ziegen-Anti-Maus Sekundärantikörper - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	Arbeitskonzentration: 1/500
Normales Ziegenserum	Dako	X0907
ProLong Diamond Antifade	Molekulare Sonden - Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluorescein Avidin DCS	Vector Lab	A-2011
Konfokalmikroskop	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		Plugin für ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		Rekonstruktion von Biocytin-gefüllten Neuronen
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Rekonstruktion von Biocytin-gefüllten Neuronen
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Analyse elektrophysiologischer Daten