Summary
procedimentos de corte do cérebro organizados são necessários para correlacionar fenômenos neuropsiquiátricos específicos com diagnósticos neuropatológicos definitivas. estacas cerebrais são realizados de forma diferente com base em diversas contingências clínico-acadêmico. Este protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para investigar diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e maximizar as técnicas biomolecular / neuroimagem atuais e futuras.
Abstract
Neuropathologists, às vezes, se sentem intimidados pela quantidade de conhecimento necessário para gerar diagnósticos definitivos para os fenômenos neuropsiquiátricos complexas descritas nesses pacientes para os quais foi pedida uma autópsia cerebral. Embora os avanços das ciências biomédicas e de neuroimagem revolucionaram o campo neuropsiquiátrica, também têm gerado a idéia enganosa de que autópsias cerebrais têm apenas um valor de confirmação. Esta falsa idéia criada uma redução drástica das taxas de autópsia e, consequentemente, uma possibilidade reduzida de realizar investigações neuropatológicos mais detalhadas e extensas, que são necessários para compreender vários aspectos normais e patológicos ainda desconhecidas do cérebro humano. O método inferencial tradicional de correlação entre fenômenos neuropsiquiátricos observados e correspondente localização / caracterização de suas possíveis correlações neuro-histológicos continua a ter um valor inegável. No contexto da neuropsychidoenças atric, o método clínico-patológico tradicional ainda é a melhor metodologia possível (e muitas vezes o único disponível) para vincular recursos neuropsiquiátricos únicas para os seus substratos neuropatológicos correspondentes, uma vez que se baseia especificamente sobre a avaliação física direta de tecidos cerebrais. A avaliação dos cérebros post-mortem é baseado no cérebro procedimentos que variam entre os diferentes centros de neuropatologia corte. estacas do cérebro são realizadas de forma relativamente extensa e sistemática com base nas diversas contingências clínicos e acadêmicos presentes em cada instituição. A metodologia de corte cerebral bi-hemisférica anatomicamente mais inclusiva e simétrica deve pelo menos ser usada para fins de investigação na neuropatologia humana para investigar de forma coerente, em profundidade, as condições normais e patológicas com as peculiaridades do cérebro humano (ou seja, a especialização hemisférica e lateralização para específica funções). Um tal processo proporcionaria uma Colle mais abrangentecção de cérebros neurologicamente bem caracterizados disponíveis para técnicas biotecnológicas e de neuroimagem atuais e futuras. Nós descrevemos um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica para a investigação das diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e para uso com corrente, bem como técnicas biomolecular / neuroimagem futuras.
Introduction
Neuropathologists ter o privilégio científica, honra intelectual, e a obrigação de diagnóstico para avaliar os cérebros humanos. Por muitas décadas, descrições clínicas detalhadas de doenças cerebrais e grandes esforços para individualizar suas possíveis correlações neuro-histológicos em cérebros post-mortem humanos têm sido realizadas. Historicamente, esses esforços representou a modalidade mais produtiva através da qual as ciências médicas, e neurologia em particular, avançou na era moderna. Graças a neuropathologists anteriores eminentes e sua dedicação, determinação, bolsa de estudos, e espantosa capacidade de discriminar entre tecidos cerebrais normais e anormais (muitas vezes utilizando ferramentas muito rudimentares), agora podemos investigar e doenças-alvo, tais como a doença de Alzheimer-Perusini (injustamente chamados apenas a doença de Alzheimer doença; DPA / AD) 1, doença de Parkinson (DP) de 2, doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) 3, doença de Lou Gehrig-/ Esclerose lateral SCLEROSIs (ALS) 4, e de Guam, doença 5 para mencionar alguns.
Técnicas avançadas de neuroimagem, como a alta definição tomografia computadorizada (ou seja, tomografia computadorizada espiral multisection; angio-TC), ressonância magnética funcional e morfológica (ou seja, fMRI, difusão-MRI, tractography-MRI, etc.), Positron Emission Tomography (PET), imagiologia à base de ultra-som, e outros, certamente modificado a nossa abordagem geral sobre como diagnosticar e curar pacientes neurológicos e psiquiátricos. No entanto, apesar de as técnicas de neuroimagiologia é capaz de visualizar o cérebro de uma pessoa quando vivo, elas não oferecem a oportunidade, no momento em que ocorre, para analisar directamente as estruturas celulares e subcelulares altamente complexas de células, tais como os neurónios; ou para visualizar, marca, e quantificar tipos específicos de lesões intracelulares; ou para indicar com precisão sua localização neuroanatômica ou sub-regional na circuital e sub-níveis anatômicos circuital. Por exemplo, técnicas de neuroimagiologia não pode identificar ou localizar o corpo de Lewy (LB) em neurónios pigmentados da substância negra (SN), uma característica patológica comum associado com PD, ou emaranhados neurofibrilares (NFT) no córtex entorrinal, uma característica clássica da doença de Alzheimer e outras patologias cerebrais. investigações neuropatológicos combinadas com microscopia digital avançada ainda são insubstituíveis para as correlações clinicopatológicas detalhados e, portanto, para diagnóstico definitivo.
Devido às propriedades peculiares anátomo-funcional do cérebro humano, e especialmente a sua localização anatómica (isto é, dentro do crânio, um sistema de protecção natural que não permite o exame directo do seu conteúdo), a introdução in vivo de técnicas de neuroimagiologia os clínicos e investigadores extraordinariamente ajudou a encontrar respostas iniciais a alguns dos mistérios deste tecido complexo. No entanto, não há nenhuma clínica ou neuroimagimetodologia ng que pode substituir a oportunidade única de analisar diretamente o tecido cerebral durante uma autópsia. Somente a coleção organizada, preservação e categorização dos cérebros humanos pode permitir que investigações diretas e sistemáticas de células neuronais e não neuronais, os seus constituintes subcelulares, intracelular e lesões patológicas extracelulares, e qualquer tipo de anormalidade dentro do cérebro para confirmar, modificar ou redefinir diagnósticos clínicos e descobrir novas correlações clínico-patológicas. Uma das limitações aparentes diz respeito à avaliação do cérebro na autópsia tem sido o facto de que este processo é uma metodologia em corte transversal. Haverá sempre um atraso entre um processo contínuo neuropatológico (clinicamente manifesta ou não) e a chance, se houver, para defini-lo no nível neuro-histológicos. Isto é principalmente devido à incapacidade do cérebro humano para se regenerar. No momento não é possível obter tecido cerebral in vivo sem criar pedanos rmanent. Por conseguinte, não é possível avaliar longitudinalmente e neuropatologicamente o mesmo cérebro / pessoa. No entanto, procedimentos bancários cérebro padronizados e uma maior sensibilização para a doação do cérebro entre o público geral poderia contribuir grandemente para a resolução de problemas de tempo de cérebro-autópsia, aumentando de forma consistente o número de casos de recolher e analisar. Desta forma, os números mais adequados de cérebro postmortem poderia ser obtida para definir padrões constantes de origem patológica e progressão para cada tipo específico de lesão cerebral associada com cada doença cérebro humano. Isto exigiria doação e recolha de tantos quanto possível cérebros de pacientes afectados por qualquer desordem neuropsiquiátrica, bem como a partir de indivíduos saudáveis de controlo em todas as idades. Um método possível poderia estar a recolher tantos cérebros post-mortem possível de centros médicos gerais e especializados como uma rotina padrão. A necessidade de doações cerebrais foi expressa recentementepor aqueles que estudam a demência e envelhecimento normal 6. A mesma necessidade deve ser expresso pelo campo neuropsiquiátricos como um todo.
Para o acima referido e por outras razões, uma actualização dos procedimentos de corte do cérebro em curso é necessário. Além disso, o cérebro procedimentos de corte deve ser universalmente padronizado entre os diferentes centros de pesquisa neuropatologia em todo o mundo, tendo também em conta a possibilidade de empregar técnicas biotecnológicas atuais e futuras para melhor investigar e, esperançosamente, para compreender de forma definitiva, as causas e mecanismos das doenças do cérebro em humanos.
Aqui, principalmente para fins de investigação, é descrita uma metodologia para simétrica cerebral postmortem de corte em seres humanos. Este procedimento propõe recolher regiões mais cerebral do que normalmente é feito e de ambos os hemisférios cerebrais e cerebelo. Um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica vai caber muito melhor com nosso conhecimento atual do ser humanoneuroanatomia, neuroquímica e neurofisiologia. Este método também permite a possibilidade de analisar neuropathologically as características únicas do cérebro humano, tais como a especialização hemisférica e lateralização que estão associados com funções cognitivas e não-cognitivas superiores tipicamente ou exclusivamente presente em nossa espécie. Se existem relações patogênicos específicos entre hemisférica especialização / lateralização e tipos específicos de lesões cerebrais, ou se um evento patogênico neuropsiquiátrica peculiar é, inicialmente, predominantemente, ou exclusivamente associada a um hemisfério específico e função não é conhecido atualmente. Ao descrever este procedimento de corte cérebro simétrico, pretendemos propor um método atualizada de dissecção cérebro humano que poderia ajudar a entender melhor as condições normais e patológicos em um tecido altamente especializado, o cérebro. Este método também leva em consideração os aspectos hemisféricos morfo-funcionais que só existem em seres humanos.
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Protocol
Procedimentos envolvendo tecidos humanos pós-morte foram revistos pelo conselho de revisão institucional e isentos ao abrigo do 45 CFR (Code of Federal Regulations).
NOTA: O protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para a avaliação postmortem cérebro finalizado para estudos neuropatológicos em seres humanos. As descrições detalhadas dos aparelhos, instrumentos, materiais e suprimentos necessários para executar o corte cérebro humano serão excluídos. Os materiais e suprimentos para dissecções cérebro são selecionados a critério do único investigador e são baseadas em ferramentas de autópsia permitidos ou autorizados em cada instituição de pesquisa. O conjunto mínimo de ferramentas e materiais necessários para este procedimento está descrito na Tabela de Materiais / Equipamentos. Procedimentos de corte específicos e precauções para suspeitos de doenças cerebrais transmissíveis, tais como CJD humana, estão fora dos objectivos deste manuscrito e estão disponíveis a partir de outras fontes 7.
1. Symmetric BiCorte cerebral hemisférica
Nota: Assegurar que o cérebro recebeu a fixação do tecido necessária (utilizando, por exemplo, neutro tamponado a 10% de formalina) (isto é, pH), e tecido conservação durante um período de duas a três semanas, dependendo do periagonal, metabólico ( isto é, temperatura) condições. No entanto, para os estudos de correlação de imagem de patologia, um período mais longo de fixação (> 5,4 semanas) tem sido sugerido 8.
- Colocar o cérebro sobre uma superfície plana voltada para o investigador, com os postes frontais voltadas no sentido oposto em relação ao investigador.
- Colocar o cérebro de tal modo a permitir uma visualização clara e completa de todos os giros cortical e sulcos do cérebro inteiro (Figura 1a).
- Primeiro olhar para anomalias das meninges, as assimetrias hemisféricas macroscópicos (possíveis indicadores de focal, lobar ou fenômenos hemisféricas generalizadas de atrofia), lesões macroscópicas tissutal (ie, tumors ou hérnia), malformações congênitas, anomalias dos vasos, e quaisquer outras anormalidades possíveis ou apresentações incomuns da superfície cerebral.
NOTA: Para obter descrições detalhadas sobre como avaliar um cérebro humano, referem-se comercialmente disponíveis livros neuropatologia e manuais de autópsia 9,10.
2. Protocolo Sequence
- Enfrentar pólos frontais longe do investigador, com os aspectos superficiais do hemisférios (telencéfalo) voltado para o investigador. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Ter um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical (Figura 1a - c).
- Mark pré e giros corticais pós-central usando tinta ou agulhas coloridas antes de cortar o cérebro (Figura 1b NOTA: Este procedimento facilita um reconhecimento mais imediato do motor e córtex somatossensorial primário após o corte.
- Rodar o cérebro por 180 graus, mantendo-o virado para a mesma direcção (ou seja, os postes frontais voltadas para fora a partir do investigador). Verifique cuidadosamente a base do cérebro. Preste atenção especial às condições dos sistemas vasculares cerebrais (ou seja, artérias basilar e vertebrais e do polígono de Willis) e os nervos cranianos em seus níveis saída / entrada do tronco cerebral. Gerir os bulbos olfatórios e tratados com cuidado especial para evitar laceração tissutal, devido à sua extrema fragilidade.
- Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para capturar a totalidade das superfícies corticais e do tronco cerebral.
- Voltado para a base do cérebro e, usando um bisturi, cortar o tronco cerebral transversalmente ao nível da parte superior da ponte (o mais perto possível para a base do cérebro). Verifique cuidadosamente a SN (ou seja, por palidez) 11 e outras estruturas vizinhas 12. Tome nota, possivelmente usando um dispositivo gravador de áudio, de qualquer aparência incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal 13.
- Novamente rodar o cérebro por 180 graus e, usando uma faca afiada, separar os dois hemisférios, cortando o corpo caloso centralmente através da fenda longitudinal medial e seguindo uma direcção fronto-occipital. Inspecione cada lado de cada hemisfério para possíveis anomalias (por exemplo, ampliações ventriculares, malformações, amaciadores de tecidos, tumores, etc.) 13. Veja a Figura 2-A.
- Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias epara contabilizar possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tome nota de qualquer característica incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal.
- Colocar os dois hemisférios plana, encontrando-se os seus aspectos medial, com os lobos frontais de costas para o investigador, como mostrado na Figura 2b. Coloque-os de tal forma que os seus centros de tocar (também em caso de assimetria hemisférica marcada).
- Usando uma faca afiada, corte manualmente através de ambos os hemisférios cerebrais, começando nos pólos frontais e movendo-se em direcção aos pólos occipitais através de todo o comprimento dos hemisférios. Obter duas séries de 1 cm de espessura blocos de tecido cerebral (cerca de 18 placas para cada hemisfério).
- Colocar as placas cerebrais numa sequência organizada anatomicamente (direcção fronto-occipital) sobre uma superfície plana separada. Use um surfa brancoCE com uma régua impressa sobre ele para melhor contraste ao fotografar. Mostrar a duas séries de placas cerebrais de uma forma anatomicamente simétrica (direção fronto-occipital), certificando-se de que as suas superfícies coronais são visíveis para inspeção visual direto e fotografia digital (Figura 3a). Use superfícies de corte com grades milimétricos impressas em ambos os lados para localizar estruturas cerebrais, tamanhos e possíveis alterações de forma mais precisa.
- Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tomar notas (possivelmente através de um dispositivo gravador de áudio), de qualquer aspecto anormal do cérebro, em comparação com um cérebro normal.
- Usando um bisturi afiado, dissecar manualmente blocos retangulares menores detecido cerebral para cada região cerebral estabelecido. Siga o programa de recolha região cerebral proposta descrita na Tabela 1.
- Coloque cada bloco de tecido em histocassettes marcadas separadamente.
NOTA: Cada bloco de tecido cerebral tem de ser cortado para se ajustar, tanto quanto possível, o volume máximo histocassette padrão (30 x 20 x 4 mm3). - Rotular os histocassettes usando um código de identificação de para cada caso e usando identificadores neuroanatómicos específicos (não use letras aleatórias ou números para diferentes cérebros, mas sim, usar sempre o mesmo regionais nomes anatômicos ou números correspondentes, como mostra a Tabela 1). Crie códigos de-identificação, por exemplo, através da geração de números aleatórios ou semi-aleatórios para cada caso (ou seja, BRC 130, onde B fica para o Cérebro, R permanece por Resource, C permanece por Center e 130 é uma adesão progressiva ou AD160001, onde AD significa "estudo da doença de Alzheimer", 16 é oano, quando a autópsia foi realizada (2016) e 0001 um número espécime adesão progressiva).
NOTA: Este passo é muito útil para futuros pesquisadores; manter uma lenda, e especificar o hemisfério (L = hemisfério esquerdo, R = hemisfério direito). Use duas cores diferentes de histocassettes, estabelecendo uma cor específica para cada hemisfério. - Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macroanomalies e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tome nota de qualquer característica incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal.
- Coloque cada bloco de tecido em histocassettes marcadas separadamente.
- Tire fotos digitais (como muitos como necessário ou desejado) de todo o cérebro de corte e as histocassettes associados.
- Punch (por exemplo, por Accu-punch) pequenos pedaços de tecido para a extração de DNA e análises genéticas. Usarum perfurador de 2 - 5 mm de diâmetro.
NOTA: Para o seu elevado teor de material genómico, o cerebelo, é a escolha preferida; no entanto, qualquer outra região está bem. - Reimergir todos histocassettes contendo blocos de tecido cerebral no mesmo tipo de solução fixadora (por exemplo, 10% de formalina neutra tamponada) tal como anteriormente usado até que o próximo passo de processamento de tecidos.
- Siga os procedimentos padrão para fixado em formol processamento de tecidos humanos 14.
3. Uma abordagem especial: alternada Congelados e fixa corte Symmetric Bihemispheric
NOTA: O protocolo de corte cérebro bihemispheric simétrica descrito na seção 2 oferece a possibilidade de cortar lajes de tecidos de não fixadas, cérebros frescos (quando disponível) da mesma maneira sistemática e simétrica.
- Coloque todo o cérebro fresco de cabeça para baixo (de preferência sobre uma superfície de plástico tigela-como semi-esférica) para 8-10 min de -80 ° C freezer para endurecer o tecido cerebral without provocando danos bioquímicos e facilitar o corte manual.
- Usando uma faca afiada, corte ambos os hemisférios em um suplente e forma consecutiva, seguindo o protocolo de corte cérebro descrito na Seção 2, mas congelar e corrigir todas as outras placas (de ambos os hemisférios e ao longo de uma direção anatômica fronto-occipital).
- Neste ponto, não tentar cortar cada região cerebral, tal como descrito na Tabela 1. Corte regiões específicas do cérebro frescos somente se necessário para RNA imediato ou extração de proteínas (ou seja, para estudos genômicos ou proteômica) 15.
- Após o corte, congelar imediatamente, etiqueta e número cada tecido fresco. Tire fotos digitais de toda a série de placas; embalar cada placa em um único saco de plástico; recolher as lajes num recipiente separado, uma cérebro-only; e armazenar o recipiente num congelador a -80 ° C dedicado.
NOTA: O congelador deve ser dedicado apenas a tecido cerebral humano. Só mais tarde vai cantarle regiões do cérebro congelado ser cortado, conforme necessário para cada experiência específica. - Mergulhe cada outra laje de tecido escolhido para a fixação (formol neutro tamponado a 10% ou outro fixador) em sacos separados contendo um volume suficiente de fixador (3/1 volume de proporção / tecido bloco fixador). Rotular cada saco por consecutivamente numerando-os a seguir uma sequência fronto-occipital. Selar cada saco, tirar fotos digitais e armazená-los em um recipiente de plástico.
- Abrir os sacos contendo o agente de fixao depois de 2 semanas de fixação do tecido e cortar cada região cerebral, tal como descrito na Tabela 1.
4. Histostain e imuno-histoquímica
NOTA: O conjunto de regiões cerebrais corte com base no esquema proposto (Tabela 1) são suficientes para satisfazer os critérios patológicos a maioria, se não todos, baseados em consenso, actualmente fixado para 16 AD, PD 17, Demência de Corpos de Lewy (DCL) 18, A demência frontotemporal (DFT / DNM)
- Para cada região do cérebro e para ambos os hemisférios, execute o seguinte conjunto mínimo de histostains: Hematoxilina e Eosina (H & E), violeta cresil (CV; se os estudos morfométricas quantitativas estão previstas, por exemplo), e coloração de prata (se análises "exploratórias" são necessário).
- Para cada região do cérebro e para ambos os hemisférios, execute o seguinte conjunto mínimo de protocolos de imunohistoquímica: p amilóide (β A), fosforilada-Tau (pTau), fosforilada α-sinucleína (pα-sin), e fosforilada-TDP43 (pTDP43) , tal como descrito 14.
NOTA: O número total de cortes de tecidos, a fim de avaliar cada cérebro após este protocolo é de 46 (se todas as regiões cerebrais de ambos os hemisférios estão disponíveis).
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Representative Results
Protocolo Comprimento
O tempo gasto para um único procedimento de corte simétrica bihemispheric fixo cérebro é estimado em 1 h (excluindo o tempo gasto a criação de mesa de dissecação, ferramentas e cortar superfícies; rotulagem;. Etc). O tempo requerido para um único bi-alternada simétrica hemisférica cerebral congelado e fixado procedimento de corte é estimada em 2 h. Pode demorar pelo menos entre 4-6 semanas para obter diagnósticos histológicos definitivos por um único cérebro / sujeito humano. Após remoção do cérebro postmortem do crânio, um período adequado de fixação do tecido (2 - 3 semanas pelo menos) deve ocorrer. Em seguida, uma série de protocolos, incluindo o corte simétrica bihemispheric cérebro, o processamento do tecido, a incorporação do tecido, o bloco de corte, e a coloração imuno-histoquímica e deve ser levada a cabo. Finalmente, a avaliação microscópica de cada região por hemisfério, a utilização de consensus-estabelecidos critérios de patologia e classificações, a revisão dos registros clínicos e, possivelmente, a correlação de clinicopathology, deve ocorrer antes conclusões neuropatológicas. todo o momento para uma avaliação completa neuropatológico cérebro humano deve ser cuidadosamente considerado quando do planejamento para estudos de investigação específicos. Além disso, os colegas médicos e investigadores de pesquisa, as famílias dos doadores, e autoridades legais devem ser informados do total requisito de tempo, complexidade e tempo da equipe / esforço para obter uma avaliação neuropatológico moderna.
Embora o protocolo de corte cerebral proposto representa um processo demorado e difícil, que na realidade representa uma metodologia cientificamente compensadora para avaliar extensivamente cérebros humanos em ambas as condições saudáveis e patológicas. É importante ressaltar que, muitas vezes durante a autópsia, cérebros recebidos como indivíduos controle / normal (ie, Indivíduos avaliados como clinicamente ou neurologicamente normal antes da morte) pode realmente ser encontrado para ser positivo para várias patologias cerebrais após uma avaliação neuropatológico preciso. Estes casos representam os chamados indivíduos assintomáticos e pré-clínicos para várias doenças cerebrais, especialmente aqueles que caracteriza doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade. Isto sublinha a importância de avaliar os cérebros recebidos como "controle" de uma forma muito extensa e meticulosa, especialmente para fins de investigação. É cada vez mais evidente que os cérebros humanos / sujeitos, sintomáticos ou não para doenças neurológicas / psiquiátricas, pode acumular várias patologias cerebrais (os chamados patologias concomitantes) durante o envelhecimento 23,24. Curiosamente, estas lesões cerebrais co-ocorrência são bioquimicamente idênticos aos encontrados em pacientes com doenças clinicamente manifesta e estão localizadas nas mesmas regiões anatômicas, bem como (PARS, ARTAG, CARROS) 25-27. estes more descobertas recentes (possível apenas através de investigações de autópsia) têm uma importância extraordinária para o estudo dos efeitos do envelhecimento sobre o cérebro humano.
A Tabela 2 e a Figura 4 descrevem alguns dados semi-quantitativos preliminares obtidos usando um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica executada em uma série de cérebros humanos recolhidos no nosso banco de cérebro. Estes dados preliminares mostram que a maioria dos cérebros recebido como "normais" ou "controlo" de sujeitos mais velhos eram, na verdade, não só positivo para formação de placas neuríticas A-beta e emaranhados neurofibrilares (tau-tau-NFT), como já conhecido 28-32, mas também que as cargas de placas neuríticas a-beta insolúveis foram mais elevados no córtex entorrinal e hipocampo esquerdo em comparação com o córtex entorrinal e hipocampo direito do mesmo cérebro. Cérebros foram avaliados utilizando CERAD 33 e Braak 34 systems, que avaliam respectivamente beta placas A-neuritic e tau-NFT. A predileção do hemisfério esquerdo observada para insolúvel β A patologia também esteve presente, embora apenas como uma tendência, na maioria das demais regiões do hemisfério esquerdo em comparação com o hemisfério direito. A relevância destes preliminar constatação bi-hemisférica é que os cérebros analisados foram todos de uma coorte de autópsia-população em geral. Todos os indivíduos foram hospitalizados, de fato, por causas não-neurológicos / psiquiátricos e morreu em diferentes hospitais gerais da comunidade por razões não neurológicas. O fato de que os cérebros analisados foram a partir de uma população geral autópsia coorte vieses de seleção minimizado possivelmente presentes quando se analisa apenas os cérebros dos centros neurológicos / demência especializados. Ver também a recomendação da NINDS 6. Nossas descobertas são preliminares (4 dos 46 disponíveis "controle" cérebros) e precisam de confirmação em uma escala muito maior. No entanto, estes novo achados, se confirmados, sugerem um possível fenômeno de uma predileção hemisférica para a acumulação e progressão da patologia, ou p Uma patologia, pelo menos. tipos semelhantes de predileções hemisféricas patológicas muito possivelmente poderia ser associada a cada tipo específico de transtorno neuropsiquiátrico ou neurodegenerativa. Além disso, através da combinação de procedimentos de corte cerebrais bi-hemisférica simétricos com os métodos de quantificação celulares e lesão precisas (isto é, estereologia imparcial), que poderia ser possível medir o rácio do normal para condições patológicas, bem como a razão da perda neuronal para restaurador / fenômenos de neuroplasticidade que podem estar presentes nos seres humanos em relação a um hemisfério e função específica. Curiosamente, embora a predileção hemisférica para cada grande tipo de patologia cerebral (β amilóide, tau, LB, TDP43, FUS, etc.) Continua a ser estabelecida, neuroimagem funcional 34, neuropsicológica 36 p>, e anatômica microestrutural analisa 37,38 parecem estar em linha com os nossos resultados preliminares. Isso reforça a hipótese de uma possível predileção hemisférica para cada tipo diferente de patologia cerebral e doenças relacionadas.
Figura 1. Avaliação Preliminar cérebro antes Bihemispheric Cérebro corte. Esta figura mostra os vários aspectos superficiais de um cérebro humano, após 2 semanas de fixação em 10% de formalina neutra tamponada. Numa sequência dos ponteiros do relógio, os aspectos superiores dos cérebros (a, b) são seguidos pelas observações na base do cérebro, os quais incluem as inspecções do cerebelo (c), do tronco cerebral e os nervos cranianos (d), e os bulbos olfativos e tractos (e).02 / 54602fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Bihemispheric Cérebro humano Corte. Fixado em formol cérebro humano colocado sobre uma superfície plana para a inspeção ocular (a). A linha vermelha indica a fissura longitudinal medial. Colocação dos dois hemisférios cerebrais após um corte central através da fissura longitudinal medial (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Bihemispheric cérebro procedimentos de corte. Esta figura mostra alguns dos passos de o protocolo de corte bihemispheric cérebro humano. Após a eliminação de todas as placas cerebrais (para ambos os hemisférios) e seguindo uma direção fronto-occipital (a), cada região do cérebro estabelecido para recolher (Tabela 1) vai ser cortado em blocos de tecido dimensões histocassette padrão de montagem (B - E). Blocos de tecido do cerebelo terá histocassettes maiores (ver o verde [hemisfério cerebelar direito] e azul [hemisfério cerebelar esquerdo]; E e F). Cassetes branco são para estruturas medianos, tais como a medula oblongata, medula espinal, etc. (E - g). Os histocassettes finais obtidos após o protocolo de corte cérebro humano bihemispheric e contendo blocos de tecido do cérebro a partir de cada região neuroanatômico listados na Tabela 1 são re-imersa no mesmo tipo inicial de solução fixadora (10% de formalina neutra tamponada) (f - g).tp_upload / 54602 / 54602fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. secções de tecido de cada Cerebral Hemisfério manchado por diferentes antígenos por imuno-histoquímica. (A) A figura mostra uma série de secções de tecido a partir de ambos os hemisférios do mesmo cérebro humano. Cada série de secções bi-hemisféricos histoquímica para amilóide β, fosforilada-tau, e fosforilada α-sinucleína (α-syn), cuja positividade está associada a doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade comuns, tais como Alzheimer e Parkinson. A imagem mostra um exemplo representativo do valor total possível de secções para analisar utilizando o protocolo de corte cérebro simétrica bi-hemisférica proposto. LH = hemisfério esquerdo, RH = hemisfério direito. ( B) Estas imagens mostram amostras de lesões comuns do cérebro relacionadas com a idade, como observado sob o microscópio depois de usar protocolos de imunohistoquímica específicas para placas beta -amil�des neuríticas, emaranhados da tau-neurofibrilares, e α-sinucleína (α-syn) -positivo corpos de Lewy. No canto inferior direito de cada imagem é o tipo de objectiva utilizada (5X, 20X e 40X) para ampliar e identificar com precisão cada tipo de lesão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Bihemispheric corte Scheme. Esta tabela mostra a única região anatômica para dissecar em ambos os hemisférios direito e esquerdo de cada cérebro. O corte simétrica bihemispheric pode ser feito em cérebros frescos e fixas.rce.jove.com/files/ftp_upload/54602/54602table1.xlsx">Please~~MD~~aux clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 2. Apreciação preliminares obtidos através de Bihemispheric Cérebro humano corte. Esta tabela mostra os resultados preliminares obtidos através de um procedimento de corte cérebro humano simétrica bihemispheric realizada em quatro cérebros humanos de indivíduos clinicamente normais, mais velhos. Os dados mostram que duas regiões cerebrais (córtex entorrinal e hipocampo) estão constantemente e cedo envolvido na acumulação de placas neuríticas -amil�des p e tau-NFT. Este tipo de lesão é considerado o processo patogénico mais provável causando AD. f = feminino; m = macho. Os números entre parênteses representam a idade no momento da morte (em anos) de cada sujeito autopsiados. Um código colorimétrico semi-quantitativo para a rápida visualização de possíveis Hemisdiferenças atmosférico em todo tipos de lesões, níveis de gravidade, e localizações anatômicas entre diferentes indivíduos mais velhos tem sido utilizado. Neg = negativo (verde); Esparsas = 1 - 2 lesões (amarelo); Moderado = 3 - 6 lesões (laranja); Frequent => 6 lesões (vermelho). Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
Este método de corte cerebral pode ser adaptada às necessidades específicas de cada laboratório neuropatologia (por exemplo, por redução do número de regiões cerebrais para avaliar, para cada hemisfério), mantendo o procedimento de corte simétricas bihemispheric como uma das suas características principais. Este protocolo proposto pode ser utilizado para procedimentos de rotina (centros neuropatológicos orientados para a pesquisa) ou apenas quando necessárias (estudos orientados clinicamente específicos). Ele pode ser usado seletivamente apenas para tipos específicos de investigações (ou seja, imuno-histoquímica) ou análises moleculares (isto é, genômica ou proteômica analisa). De um ponto de vista técnico, é útil mencionar que algumas diferenças patológicas (especialmente em imuno-histoquímica) pode ser devido a possíveis variações de artefatos nas intensidades immunohistostaining. Estes podem ser minimizados através da utilização de máquinas automáticas de coloração, o que reduz drasticamente a possibilidade de efeitos fluorescência artificial umvariações nd. Atualmente é possível, de fato, tecnologicamente minimizar a maioria dos fatores de confusão devido a artefatos técnicos, utilizando máquinas de coloração robóticos confiáveis. Assim, os resultados comparáveis podem ser obtidos na avaliação, por exemplo, dois hemisférios cerebrais do mesmo assunto, ou vários conjuntos de ambos os hemisférios de vários assuntos.
Além disso, durante os últimos anos, o número de lesões cerebrais reconhecidos em cérebros humanos foi enormemente aumentado 39. Estes novos tipos de lesões cerebrais criado um aumento do risco de que os cérebros anteriores classificados como normais ou controle não são, na verdade. A melhoria das técnicas de imunohistoquímica e novas descobertas neuropatológicos gostaria de sugerir uma reavaliação sábio e periódica de todos os cérebros anteriormente bancados como "controle", uma vez que casos de "pseudo-controle" ou "controle false" cérebros são sempre possíveis 40.
A principal limitação doEste método consiste na quantidade de tempo e conhecimento (conhecimento anatômico e patológica) necessário para realizá-lo. Além disso, estudos com o objetivo de analisar os aspectos de genômica e proteômica do cérebro humano necessita de uma equipe de banco de cérebros pronto para gerenciar, de forma rápida, todos os procedimentos de doação do cérebro, arranjos legais de consentimento, remoções cérebro, e corte imediato para procedimentos de congelamento ou de fixação. Normalmente, estas instalações e pessoal estão disponíveis apenas em centros acadêmicos ou de pesquisa especializados. Além disso, enquanto os procedimentos de corte detalhadas pode certamente ajudar a entender melhor as possíveis origens anatômicas e espalhando caminhos de cada doença do cérebro, eles vão também contar sempre com a quantidade de informação clínica detalhada disponível para cada caso, a fim de realizar estudos de correlação clínico-patológicas precisos. Um dos melhores usos para este protocolo, então, vai ser no contexto de estudos longitudinais clínico-patológicas, que são muitas vezes o melhor tipo de investigation para recolher mais detalhada clínicos, de imagem, genéticos, ambientais e outros tipos de dados de correlacionar, microscópica e achados imuno-histoquímica da autópsia com os dados clínicos recolhidos anteriormente.
Surpreendentemente, as investigações neuropatológicos analisar, classificar ou quantificar o amplo espectro de lesões neuropatológicas em relação à função hemisférica ou localização são extremamente raras 41-44. No entanto, parece que os tempos e as tecnologias estão prontos para desafios sem precedentes em estudos de neuropatologia humanos. A principal razão para propor um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica foi respeitar as assimetrias funcionais peculiares (anatômicas ou patológicas) dos cérebros humanos. Muitas vezes, mais por tradição cegamente aceito do que provado razão científica, apenas um hemisfério (muitas vezes estocasticamente selecionado) foi corrigido para a avaliação neuropatológico ou imuno-histoquímica, enquanto o outro foi congelada para possível molecularou análises bioquímicas. Especialmente quando estudando cérebros humanos, a seleção casual do hemisfério e consequente corte cérebro conter os riscos potenciais em termos anatómicos e pode causar possíveis vieses de seleção fisiopatológicos. Embora por razões práticas, que fixa um hemisfério e congelando o oposto é razoável em um ambiente não-pesquisa, não é sustentável por mais tempo no contexto da investigação neuropatológico para os transtornos neuropsiquiátricos. Especialmente no momento presente, quando quantidades consistentes de "in vivo" neuroimagem e informação genética estão potencialmente disponíveis na autópsia, um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica com uma extensa avaliação neuropatológico correspondente deve ser realizada rotineiramente. A especialização hemisférica do cérebro humano foi demonstrada em muitas funções cognitivas, como a linguagem, destreza e emoções (ie, ativação diferencial na amígdala esquerda e direita), para citar afai credo. Esta especialização hemisférica e lateralização das funções cognitivas e não-cognitivas superiores, que normalmente diferenciar e caracterizar os seres humanos de outras espécies de mamíferos e não mamíferos, deve ser cuidadosamente considerada em termos de neuropatologia. Que há, em humanos, uma predileção hemisférico de processos patológicos específicos em termos de neurodegeneração, a resposta neuroinflamatória e capacidades neuroreparative ainda não é conhecido, e tem sido muito raramente investigadas 40-43. Apesar de imagem suporta bem conhecido fisiologicamente e recursos específicos do hemisféricas clinicamente, é surpreendente quanto menos se conhece em termos de possíveis diferenças neuropatológicas. Ao propor um cérebro bi-hemisférica simétrica procedimento de corte, ou a alternância mais sofisticado congelado e fixado protocolo de corte cerebral bi-hemisférica simétrica, o objetivo foi descrever um método que poderia ajudar a descobrir aspectos peculiares do cérebro humano durante saudável e pathologicondições de cal, com base em suas características únicas e de especialização e lateralização hemisférica.
Um dos passos mais críticos da presente protocolo consiste na necessidade de ter o cérebro configuração, materiais e ferramentas imediatamente disponível de corte, em qualquer momento, uma vez que é muito raro para ser capaz de prever quando um cérebro, em particular, uma amostra fresca, é chegando. Outro passo importante deste protocolo consiste na destreza manual necessária para o corte cérebro fresco e fixa. Embora lidando com um tecido idênticos, as duas condições físico-químicas (frescos e de tecido fixo) fazer a aquisição de conhecimentos para o cérebro cortando um componente essencial e crítico do protocolo. Além disso, o conhecimento neuroanatômica (especialmente para procedimentos cerebrais frescos) supõe estágios acadêmicos específicos. Para procedimentos de cérebro fresco, por outro lado, é imperativo e crítica para mover tão rapidamente quanto possível e para manter a precisão e a integridade do tissue. Isto vai preservar toda a informação biológica contido no tecido, bem como a possibilidade de realizar investigações futuras exige que os materiais fresco congelado (ARN, proteínas, etc.).
O método simétrico congelado e fixa dupla cérebro corte representa o melhor compromisso possível para a obtenção tanto fresco congelado (útil para genética, molecular, e analisa microdissection) e fixo (útil para neuroanatomia, imuno-histoquímica e PCR in situ análises) secções de tecido cerebral de áreas contíguas de regiões específicas do cérebro e a partir de ambos os hemisférios. Esta metodologia representa uma fonte de análises comparativas obtidos através de diferentes técnicas moleculares e de imagem usando exatamente a região mesmo cérebro / área (região sub-anatômico, cinza núcleos de matéria, grupos de células, / dendríticas espinhos, etc.). Um procedimento de corte simétricas cérebro congelado e fixado dupla permitiria a obtenção de cortes de tecido cerebral contíguas do mesmo neárea uroanatomical. Isto permitiria a sua análise usando brilhante luz, fluorescência e microscopia eletrônica (empregando procedimentos diferentes para cada tipo de microscopia). Técnicas de extração de RNA / DNA / proteína também poderia ser aplicado, por meio microdissecações captura a laser, por exemplo, para exatamente a mesma região ou grupo de neurônios, células, vasos, etc. Esta alternância congelados e técnica de corte cérebro bihemispheric simétrica fixo, em conjunto com sistemas informatizados para acompanhamento de amostra e refrigeração, parece oferecer um enorme potencial para a aplicação de futuros estudos biomoleculares em curso e potenciais.
Uma abordagem alternativa para o processo de corte do cérebro descrito poderia ser o corte transversal da totalidade de cada superfície hemisférica. No entanto, este método requer ferramentas mais especializadas e caras (ou seja, um micrótomo maior, lâminas maiores, etc.) Do que os normalmente usados na maioria dos laboratórios de neuropatologia. Em vez disso, o nosso método propõe uma mais extensa coleção de regiões do cérebro de ambos os hemisférios, cortando as regiões cerebrais individuais usando ferramentas normalmente disponíveis (e acessíveis) na maioria dos laboratórios de neuropatologia pesquisa.
O cérebro de corte proposto pode ser combinado com métodos precisos de quantificação histológica, celular e subcelular (isto é, para estereologia imparcial) 45-47. estudos neuropatológicos quantitativos são de primordial importância e necessidade, já que dados quantitativos sobre circuitos, núcleos, neurônios, células não-neuronais, anormalidades do sistema vascular e perda neuronal relacionadas com lesões patológicas específicas faltam principalmente em seres humanos. Recentemente, quantificações precisas de lesões neuropatológicas específicas obtidas através do emprego de protocolos estereologia imparciais começou a lançar luz sobre possíveis relações novas entre a acumulação de uma lesão intraneuronal específica (isto é, corpos de Lewy), perda neuronal (isto é, perda de nigral),e as manifestações clínicas (isto é, sintomas parkinsonianos) ao analisar os cérebros humanos 48. Determinar as quantidades relativas de neurônios funcionais residuais ou reagindo células neurológicas necessário, por exemplo, para contrastar, delay, ou compensar os processos neuropatológicos específicas, poderia ajudar a entender melhor as capacidades de resposta e de adaptação do cérebro humano adulto, especificamente durante o envelhecimento. alterações volumétricas neuronais, neurites, cargas de lesão, comprimentos de fibras, espessura cortical, os rácios de espessura da camada cortical, e outros aspectos morfométricas possíveis são de especial interesse, uma vez que a sua provável relevância fisiopatológica em nível celular e subcelular no contexto de doenças neuropsiquiátricas ou processos neurodegenerativos ainda não foi completamente esclarecida 49. Número, tamanho, comprimento de fibras ou neurites, volume de substância cinzenta e branca e rácios, analisa camada cortical, etc, são todos os parâmetros mensuráveis precisamente graçaspara a combinação de fórmulas específicas e algoritmos estatísticos geométricas 50. equações geométricas e fórmulas estatísticas foram elegantemente integrado com sistemas altamente sensíveis, informatizados micrométricas de coordenação tridimensional motorizados (sistemas estereologia motorizados) para a quantificação histológica de quase qualquer tipo de medição bio-tissutal.
O conjunto de neuroanalyses disponíveis agora para estudar tecidos cerebrais humanos não era imaginável há alguns anos atrás, e é altamente provável que haverá mais avanços no futuro próximo. A caracterização detalhada dos cérebros de hoje de pacientes, indivíduos clinicamente assintomáticos, e indivíduos normais vai incrivelmente acelerar descobertas de amanhã e individuação de terapias para a maioria das doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas. No contexto das doenças complexas, tais como as doenças neuropsiquiátricas, mesmo as técnicas de neuroimagiologia sofisticados corrente não podeoferecer os níveis mais elevados de definição celular e informação biológica que as técnicas neuropatológicas modernos podem. Além disso, apenas as imagens dos tecidos cerebrais estáticos oferecem a oportunidade de realizar estudos quantitativos imparciais em um único grupo de células neuronais ou lesões ou a possibilidade de cortar neurónios individuais (isto é, microdissecação a laser) para extrair materiais genéticos ou de proteínas para análise de espectroscopia de massa, para exemplo 51 .O bihemispheric metodologia simétrica corte cérebro pode ser aplicado, entre outros, para estudos especiais, tais como os que investigam cérebros individuais idênticas. Neste única situação experimentum naturae, o potencial para entender melhor as possíveis relações existentes entre hemisférica especialização / lateralização e cognição / patologia é impressionante. Os diferentes níveis de hemisférica relacionadas com patológica simetria / assimetria poderia ser mais facilmente explicado em termos de um dilema natureza / cultura. Por exemplo, um simétricaprocedimento de corte cerebral bi-hemisférica poderia ser realizada nos cérebros de gêmeos idênticos contra gêmeos fraternos 52-56.
A técnica de corte cérebro bihemispheric simétrica também deve ser aplicado aos estudos de desenvolvimento neurológico humanos 57. Altamente dados informativos poderiam ser recolhidos para aspectos específicos da neuronal relacionada-hemisférica e tempo de maturação da glia, fenômenos de neuroplasticidade de desenvolvimento e capacidades neuroreparative do sistema nervoso central durante a infância. Um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica poderia contribuir grandemente para definir melhor a natureza / dilema criação para a formação traço da personalidade e as mudanças de comportamento durante o desenvolvimento normal, o envelhecimento normal, e como parte das manifestações clínicas iniciais de "esporádica" neurodegenerativa processa 58.
A abordagem clínico-patológico clássico realizado através de procedimentos estruturados de corte do cérebro não é umtécnica de histórico, mas ainda é um instrumento válido e útil de diagnóstico e pesquisa. Especialmente no momento actual, em quantidades impressionantes de informações clínicas e biológicas são potencialmente disponíveis na autópsia, a combinação de casos clinicamente bem caracterizados, dados de neuroimagem e informação genética / molecular com modernas neuropatológicos / análises quantitativas detalhadas poderia representar um inédito "direito -match "na história of neuroscience. antemortem combinados e investigações post-mortem pode enormemente esclarecer as bases funcionais e neuronais / tissutal de doenças neuropsiquiátricas e lançar luz sobre os mecanismos etiopathogenetic exatas destes distúrbios, tendo também em conta possíveis fatores hemisféricas que não foram especificamente considerado antes. Os autores estão cientes de que a técnica de corte cérebro bihemispheric simétrica proposto é tempo e consome recursos, mas os esforços semelhantes aos realizados para o avanço da neuroimagem deveser feito no campo da pesquisa neuropatologia também. Mais harmonizada e atividades bancárias cérebro estruturados não vai ser mais caro do que construir ou comprar aparelhos de ressonância magnética, com resultados científicos potenciais que não seria menos gratificante do que os obtidos por estudos de neuroimagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copy of signed informed consent allowing autopsy and brain donation for research use. | |||
| Detailed clinical history of the subject which should include a detailed description of any neurologic and psychiatric symptoms and signs. | |||
| Medical or nonmedical video-recordings when available (especially useful in movement disorders field). Next-of-kin’s consent required. | |||
| Neuroimaging, neurophysiology, neuropsychiatric and assessment or clinicometric scales. | |||
| Genetic and family history data. Genetic reports review, if neurogenetic diseases were diagnosed. | |||
| Histology Container | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64233-24 | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-142 (orange) | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-132 (navy) | |
| Knife Handles and Disposable Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62560-04 | |
| Long Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62561-20 | |
| Disposable Blade Knife Handles | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72040-08 | |
| Scalpel Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72049-22 | |
| Accu-Punch 2 mm | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 69038-02 | |
| Polystyrene Containers – Sterile | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64240-12 | |
| Dissecting Board | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63307-30 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 SIGMA | |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 2 | Sigma-Aldrich | GHS280 SIGMA | |
| Eosin Y solution, aqueous | Sigma-Aldrich | HT1102128 SIGMA | |
| anti-beta-amyloid | Covance, Princeton, NJ | SIG-39220 | 1:500 |
| anti-tau | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | 1:500 |
| anti-alpha-synuclein | Abcam | ab27766 | 1:500 |
| anti-phospho-TDP43 | Cosmo Bio Co. | TIP-PTD-P02 | 1:2000 |
| Digital Camera | Any | ||
| Head Impulse Sealing machine | Grainger | 5ZZ35 |
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