Methodenartikel

Methodologien für das Studium B. subtilis Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

DOI:

10.3791/54612

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9. Oktober 2016

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1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, 2Electron Microscopy Unit, Weizmann Institute of Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie präsentiert die Entwicklung reproduzierbarer Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bacillus subtilis-Vielzelligkeit.

Zusammenfassung

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Diese Arbeit bewertet verschiedene Methoden, um den Einfluss von niedermolekularen Biofilm-Inhibitoren, wie z.B. D-Aminosäuren, auf die Entwicklung und Resilienz von Bacillus subtilis-Biofilmen zu untersuchen. Zunächst werden Methoden vorgestellt, die nach niedermolekularen Inhibitoren mit biofilmspezifischen Zielen selektieren, um die Wirkung der niedermolekularen Inhibitoren auf das Planktonwachstum von ihrer Wirkung auf die Biofilmbildung zu trennen. Als nächstes konzentrieren wir uns darauf, wie sich die Impfbedingungen auf die Empfindlichkeit von mehrzelligen, schwimmenden B. subtilis-Kulturen gegenüber niedermolekularen Inhibitoren auswirken. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Diskrepanzen in den berichteten Wirkungen solcher Inhibitoren wie D-Aminosäuren auf inkonsistente Vorkulturbedingungen zurückzuführen sind. Darüber hinaus wird ein kürzlich entwickeltes Protokoll zur Bewertung des Beitrags von niedermolekularen Behandlungen zur Biofilmresistenz gegenüber antibakteriellen Substanzen beschrieben. Schließlich werden Techniken der Rasterelektronenmikroskopie (REM) vorgestellt, um die dreidimensionale räumliche Anordnung von Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix in einem B. subtilis-Biofilm zu analysieren. REM ermöglicht einen Einblick in die dreidimensionale Biofilmarchitektur und die Textur der Matrix. Eine Kombination der hier beschriebenen Verfahren kann die Untersuchung der Biofilmentwicklung in Gegenwart und Abwesenheit von Biofilminhibitoren erheblich unterstützen und den Wirkmechanismus dieser Inhibitoren beleuchten.

Einleitung

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Mehrzelligen Bakteriengemeinschaften spielen eine bedeutende Rolle in natürlichen und anthropogenen Umgebungen und kann vorteilhaft oder sehr schädlich sein. Diese mehrzelligen Kolonien werden als Biofilm bekannt ist, wobei die einzelnen Zellen in einer selbst hergestellten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Matrix eingebettet sind. Die EPS haften stark die Zellen an der Oberfläche sie besiedeln. Sie dienen als Schutzschild gegen mechanische und chemische Kräfte und schaffen einen engen Kontakt zwischen benachbarten Zellen, die Erleichterung zellulären Kommunikation 1. Ein Biofilm kann als differenzierte Gemeinschaft betrachtet werden, in denen Zel....

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Protokoll

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1. Die Beurteilung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf Pellicle und Biofilm Koloniebildung

  1. Bereiten Sie eine 2x Lösung definierter Biofilm-induzierenden MSgg Medium 25 ohne Calciumchlorid und Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat. Nach Filtersterilisation, das Calciumchlorid hinzu. Das Medium bereit ist, direkt zu verwenden, oder es kann in der Dunkelheit bei 4 ° C gelagert werden.
  2. Bereiten Sie die 1x MSgg Verdünnungs am Tag des Experiments.
    1. Verdünne die 2x MSgg Medium mit sterilem destilliertem Wasser (Häutchen) oder sterile 3% heißem (80 ° C) Agar (Biofilme) und fügen Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat auf eine Endkon....

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Ergebnisse

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Das Häutchen - Test ist eine Methode , die stark reguliert und dynamische Prozesse von B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit. Außerdem wird der Pellicle-Assay eine Reihe von entweder pre-starter Bedingungen oder kleine Molekülkonzentrationen in einer einzigen Zellkultur Multidish Platte in einem Experiment zum Testen geeignet. Jedoch B. subtilis Pellikelbildung ist empfindlich für die Vorkultur Bedingungen (zB Wachstumsmedium der Vorkultur und der Wachstumsphase), der Inokulation Ve.......

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Diskussion

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Bacillus subtilis Formen robust und stark strukturierte Biofilmen sowohl in flüssiger (Häutchen) und auf festem Medium (Kolonien). Daher dient sie als ideale Modellorganismus der Wirkungsweise von spezifischen Inhibitoren Biofilm zu charakterisieren. Auf festen Medien bilden Zellen mehrzelliger Strukturen mit charakteristischen Eigenschaften, die nicht offensichtlich in Häutchen sind, wie Falten von der Mitte zum Rand hin ausstrahlen. So sind Häutchen und Kolonien ergänzende Systeme zu studieren B. subtilis.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die elektronenmikroskopische Bildgebung wurde an der Abteilung für Elektronenmikroskopie des Weizmann Institute of Science durchgeführt, teilweise unterstützt vom Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Diese Forschung wurde auch durch das ISF I-CORE Stipendium 152/1, Herrn und Frau Dan Kane, Frau Lois Rosen, durch ein Yeda-Sela-Forschungsstipendium, durch die Larson Charitable Foundation, durch das Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, durch das Stipendium des Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research, durch das Stipendium des Gesundheitsministeriums für alternative Forschungsmethoden, ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Luria Brühe, LennoxDifco240230
Bacto AgarDifco214010
Kaliumphosphat einbasisch Sigma, 136,09 g/molP0662-500G
Kaliumphosphat zweibasisch Fisher Scientific, 174,18 g/molBP363-1
3-(N-morpholino)propansulfonsäureFisher Scientific, 209,27 g/molBP308-500
Magnesiumchlorid-Hexahydrat Merck, 203,30 g/mol1.05833.0250
Calciumchlorid wasserfreiJ.T. Baker, 110,98 g/mol1311-01
Mangan(II)-chlorid-TetrahydratSigma, 197,91 g/mol31422-250G-R
Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat Sigma, 270,30 g/Monat)F2877-500G
Zinkchlorid wasserfreiAcros Organics, 136,29 g/mol424592500
ThiaminhydrochloridSigma, 337,27 g/molT1270-100G
L-TryptophanFisher Scientific, 204,1 g/molBP395-100
L-PhenylalaninSigma, 165,19 g/molP5482-100G
L-ThreoninSigma, 119,12 g/molT8625-100G
Glycerin wasserfreiBio-Lab Itd712022300
L-Glutaminsäure-Mononatriumsalze hydratisieren Sigma, 169,11 g/molG1626-1KG
D-LeucinSigma, 169,11 g/mol855448-10G
Ethanol wasserfreiGadot830000054
RasierklingeEddisonNA
zirkuläre Zellulose-FilterpapiereWhatman, 90 mm1001-090
GlutaraldehydEMS (Electron Micoscopy Science), 25% in Wasser16220
Paraformaldehyd EMS, 16 % in Wasser15710
NatriumcacodylatMerck, 214,05 g/mol 8.2067
Calciumchlorid-2-hydratMerck, 147,02 g/mol 
Stumm-Alu-HalterungEMS, Schlitzkopf75230
Carbon-KlebebandEMS77825-12
Schüttler 37 > CNew Brunswick Scientific Innowa42NA
ZentrifugeEppendorf Tischzentrifuge 5424NA
Digitaler Sonifikator, Modell 250, verwendet mit Double StepMicrotip BransonNA
Inkubator 30 > CBinderNA
Inkubator 23 ° CBinderNA
Filtersystem, 500 ml, PolystyrolCornig IncorporatedNA
Rotationsschüttler - Orbitron Rotatory IIBoekelNA
S150 Sputter Coater EdwardsNA
CPD 030 KritischpunkttrocknerBAL-TECNA
Rasterelektronenmikroskop für den UmweltschutzXL30 ESEM FEG Philips (FEI)NA
1172113

Referenzen

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  1. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  2. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
  3. Miller, M. B., Bassler, B. L....

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Schlagwörter

Bacillus subtilis Biofilmeniedermolekulare InhibitorenBiofilmbildungRasterelektronenmikroskopiePellikelbildungKBE AssayEthanolresistenzMSgg Mediumextrazellul re Matrix

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