Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

Zusammenfassung

Hier wird die ribosomale Spacer-PCR (RS-PCR) zusammen mit einem miniaturisierten Elektrophoresesystem als schnelle und hochauflösende Methode zur Genotypisierung von S. aureus zu moderaten Kosten verwendet, die einen hohen Durchsatz ermöglicht.

Zusammenfassung

Der ribosomale Spacer PCR (RS-PCR) ist eine hochaufgelöste und robuste Genotypisierungsmethode für S. aureus, die einen hohen Durchsatz bei moderaten Kosten ermöglicht und daher für den Einsatz in der Routine geeignet ist. Für beste Auflösung, Datenauswertung und Datenmanagement ist ein miniaturisiertes Elektrophoresesystem erforderlich. Zusammen mit einem solchen Elektrophorese-System und der eigens entwickelten Software (hier frei verfügbar) ist die Zuordnung des Musters der Banden zu einem Genotyp standardisiert und einfach. Die DNA-Extraktion ist einfach (Siedevorbereitung), die Einrichtung der Reaktionen ist einfach und sie können auf jeder Standard-PCR-Maschine durchgeführt werden. PCR-Zyklen sind üblich, mit Ausnahme längerer Rampen- und Dehnungszeiten. Im Vergleich zur Spa-Typisierung und Multi Locus Sequence Typing (MLST) ist bei der RS-PCR keine DNA-Sequenzierung erforderlich, was die Analyse erheblich vereinfacht und einen hohen Durchsatz ermöglicht. Darüber hinaus ist die Auflösung für Rinderstämme von S. aureus mindestens so gut wie bei der Spa-Typisierung und besser als bei MLST oder Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE). Die RS-PCR-Datenbank umfasst derzeit insgesamt 141 Genotypen und Varianten. Die Methode ist in hohem Maße mit dem Virulenzgenmuster, der Ansteckungsfähigkeit und der Pathogenität von S. aureus-Stämmen assoziiert, die an der Rindermastitis beteiligt sind. Der S. aureus-Genotyp B (GTB) ist ansteckend und verursacht Herdenprobleme, die in der Schweiz und anderen europäischen Ländern hohe Kosten verursachen. Alle anderen in der Schweiz beobachteten Genotypen infizieren einzelne Kühe und Quartiere. Die Genotypisierung mittels RS-PCR ermöglicht eine zuverlässige Vorhersage des epidemiologischen und pathogenen Potentials von S. aureus, der an der intramammären Infektion (IMI) von Rindern beteiligt ist, zwei Schlüsselfaktoren für die klinische Veterinärmedizin. Aufgrund dieser vorteilhaften Eigenschaften in Verbindung mit moderaten Kosten und einem hohen Probendurchsatz ist es das Ziel dieser Veröffentlichung, ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die einfache Etablierung und Durchführung der RS-PCR zur Genotypisierung von S. aureus in anderen Laboratorien zu erstellen.

Einleitung

Staphylococcus (S. aureus) als wichtigste Erreger weltweit verantwortlich für die intramammäre Infektion (IMI) bei Rindern ¹ bekannt. Die Studie wurde von Fournier et al. ² in Schweizer Kühe unter Beweis gestellt und die Studien von Cosandey et al. ³ und Boss et al. ⁴ bei Kühen von 12 europäischen Ländern , dass S. aureus isoliert aus Rinder IMI ist eine genetisch heterogene Gruppe. Durch PCR - Amplifikation des 16S-23S - rRNA intergenischen Spacer - Region (RS-PCR), insgesamt 17 Genotypen wurden zunächst in 101 epidemiologisch unabhängige Isolate ² detektiert. Genotype B und Genotyp C (AGB) wurden am häufigsten (80%), während die anderen 15 Genotypen (GTs) selten aufgetreten, jeder macht 1 bis 4% aller Isolate. Auf europäischer Ebene ^3, GTB, GTC, GTF, GTI und GTR waren die wichtigsten Genotypen 76% aller untersuchten Stämme, die (n = 456). GTB wurde in Mitteleuropa während die anderen Genotypen wurden weit verbreitet. Die restlichen 24% der Stämme enthalten 41 Genotypen, von denen viele, aber nur einmal beobachtet.

Die Studien von Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ und Graber et al. ⁵ weiter gezeigt , dass die Genotypen stark mit ihrer Virulenz - Gen - Muster verbunden waren, sowie an der Schweizer wie auf europäischer Ebene. Die Untersuchungen ergaben , weitere massive Unterschiede in IMI - Prävalenz unter S. aureus GTB, GTC und die anderen Genotypen ^2,5: Berücksichtigung GTB, bis zu 87% der Kühe in einer Herde wurden von diesem Genotyp infiziert. Im Falle von GTC und der anderen Genotypen, jedoch wurde IMI nur in 1 bis 2 Kühen einer Herde gefunden.

IMI verursacht durch S. aureus, führt normalerweise zu einer Entzündung der entsprechenden Brustdrüsen und einem Anstieg von Entzündungszellen in der Milch. Als Folge co die somatische Zellunts in Milch (SCC), dem Schlüsselindikator für die Milchqualität in den meisten Ländern, erhöht wird, um eine verringerte Milchpreis oder sogar Lieferstopp führt.

Neben dem RS-PCR von Fournier et al. ^2, haben andere Typisierungsmethoden für Subtypisierung Rinder Stämme von S. beschrieben aureus ^11.08. Zwei häufigsten sind Spa - Typisierung ¹² und Multi - Locus - Sequenz Typing (MLST) ^13. Der erstere wird basierend auf DNA - Sequenzierung der variablen Spacer - Bereich des Staphylokokken - Spa Gen , das für Protein A, während die letztere die Sequenzierung von 7 Housekeeping - Genen erfordert. Dies bedeutet , dass eine ¹² bis sieben PCRs ¹³ jeweils durchgeführt werden müssen, gefolgt von Amplicon Reinigung Sequenzierungsreaktion und Analyse unter Verwendung spezifischer Ausrüstung. Im Vergleich zu RS-PCR, erfordern diese Verfahren einen erheblichen Mehraufwand in der resultierenden Labor in einem geringen Probendurchsatz und hohe Kosten. DasDurchsatz besonders niedrig ist die PFGE. Unter Berücksichtigung der Auflösung dieser Methoden für Rinder Stämme von S. aureus, RS-PCR ist mindestens so gut wie spa Eingabe ⁴ und besser als MLST ⁴ oder PFGE ^15.

Alle diese Methoden auch binäre Typisierung ¹³ gezeigt , um ihre Wirksamkeit bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Pathogenese von Rinder-IMI verursacht durch S. aureus, aber wegen der genannten Einschränkungen sind sie weniger geeignet für große klinische Untersuchungen. Zusätzlich Genotypisierung von RS-PCR wie von Fournier et al. ² ermöglicht die zuverlässige Vorhersage der epidemiologischen und das pathogene Potential von S. aureus in Rinder-IMI, zwei Schlüsselwerte in der klinischen Veterinärmedizin beteiligt.

Protokoll

1. Staphylococcus aureus - Isolaten

1. Verbreiten Sie 10 ul S. aureus Stammkultur oder eine Kolonie auf einem selektiven Medium gezüchtet auf Columbia - Agar - Platten , die 5% Schafblut (BA).
2. Inkubieren aerob bei 37 ° C für 18 Stunden bis 24 Stunden.

2. DNA-Extraktion

1. Bereiten TEL - Puffer , enthaltend 10 mM Tris-HCl und 10 mM Na ₂ EDTA, pH 8,5. Bereiten Aliquots und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min.
2. Sammeln Sie 1 Kolonie von BA eine sterile Plastikschleife oder einen sterilen Holz Zahnstochers und resuspendieren in 100 & mgr; l TEL verwenden. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss.
3. für 10 min bei 95 ° C inkubieren. Danach legen Sie die Proben sofort auf nassem Eis.
4. Verdünnen Sie die Proben 1: 100 in H ₂ O geeignet für PCR (= Template - DNA für die PCR). Das unverwässerte und verwässerte Proben können für 1 Monat bei -20 ° C aufbewahrt werden.

3. RS-PCR

1. Für jede Probe Pipette in ein PCR - Röhrchen von 1,5 & mgr; l H ₂ O, 12,5 & mgr; l Taq Master Mix, 2 & mgr; l G1 Primer 10 uM, 2 & mgr; l L1 Primer 10 uM, und 7 & mgr; l Matrizen - DNA, die zu etwa 30 ng reiner entspricht DNA ^2.
2. Führen Sie die folgende PCR-Programm in einem Standard-PCR-Cycler: 15 min 95 ° C, gefolgt von 27 Zyklen bestehend aus 94 ° C für 1 min, gefolgt von einer 2 min Rampe und Tempern bei 55 ° C für 7 min. Nach weiteren 2 min Rampe 2 min bei 72 ° C erstrecken. Beenden PCR von einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min, gefolgt von Abkühlen auf 4 ° C.
   HINWEIS: Die PCR-Produkte können für 5 Tage bei -20 ° C gelagert werden.
3. Für jeden Lauf von RS-PCR umfassen eine positive Kontrolle, dh eine Probe mit einem bekannten Genotyp (normalerweise GTB) und eine negative Kontrolle (H ₂ O).

4. Elektrophorese

1. Verwenden Sie eine kommerzielle miniaturisierten Elektrophorese-Kit für die DNA (MED-Kit) zusammenmit einem Bioanalyzer auf einem PC und der installierten Software verbunden. Studieren Sie die entsprechenden Handbücher des Herstellers sorgfältig durch.
2. Stellen Sie den Chip Priming Station und stellen Sie die Spritze Clip entsprechend der Anleitung des Herstellers.
3. Bereiten Sie die Gel-Farbstoffmischung nach der Anleitung des Herstellers.
4. Laden des Gel-Farbstoff-Mix (gemäß dem Handbuch des Herstellers).
   1. Äquilibrieren Sie das Gel-Farbstoff-Mix auf RT für 30 Minuten vor dem Gebrauch.
   2. Setzen Sie neue DNA-Chip auf dem Chip Priming Station. Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in dem gut markierten G.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Kolben in 1 ml positioniert ist, und dann den Chip Priming Station schließen. Drücken Sie Kolben, bis sie von der Spritze Klammer gehalten. Warten Sie genau 30 Sekunden dann die Spritze Clip lösen.
   4. Warten Sie 5 Sekunden. Ziehen Sie langsam Kolben in 1 ml Position zurück.
   5. Offene Chip Priming Station und Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in beiden Brunnen markiert 'G'.
5. Laden der MArker
   1. Pipette 5 ul Marker in allen 12 Probenvertiefungen und in der Leiter gut. Nicht jeder dieser 13 Brunnen leer lassen.
6. Laden der Leiter und die Proben.
   1. Pipette 1 ul DNA-Leiter mit dem gut markierten mit der Leiter zu unterzeichnen.
   2. Pipette 1 ul Probe (verwendet Vertiefungen) oder 1 & mgr; l VE-Wasser (nicht verwendeten Wells).
   3. Setzen Sie den Chip horizontal in den Adapter und Vortex für 1 min bei 2.400 Umdrehungen pro Minute.
   4. Führen Sie den Chip in der Bioanalyzer innerhalb von 5 min.
7. Durchführung der Analyse
   1. Starten Sie den Bioanalyzer und dem angeschlossenen Computer. Öffnen Sie die Software.
   2. Öffnen Sie den Deckel des Bioanalyzer und platzieren Sie den Chip in den Chiphalter (der Chip passt nur in eine Richtung). Schließen Sie den Deckel vorsichtig.
   3. Im Instrument Kontext der Software wählen Sie "Elektrophorese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Akzeptieren Sie die aktuelle Datei - Präfix der Software oder zu modifizieren.
   4. Klicken Sie auf die Start-Taste in der Software. Geben Sie die Beispielnamen in der Software. Wenn der Chip Lauf (nach ca. 30 min) das Ende der Run Meldung erscheint in der Bioanalyzer Software beendet ist.
   5. Entfernen Sie den Chip und reinigen Sie die Elektroden der Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Herleitung des Genotyps von der Elektrophorese Profil

1. Laden Sie die Mahal Software (Software von den Autoren frei verfügbar ist).
2. Import von Referenzdaten in die Software Mahal: "Datei"> "Import-Referenzdaten"
3. Öffnen Sie die Elektrophorese in der Datenkontext des Bioanalyzer Software. Wählen Sie ein Elektrophorese Profil einer Probe.
4. Überprüfen Sie für die entsprechenden Peaks.
   1. Verwenden Sie die Mahal Software für die jeweiligen Spitzen zu überprüfen: "Extras"> "Mean Fluoreszenz". Legen Sie in die "Fluoreszenz" -Boxdie Fluoreszenzwerte als Fluoreszenzeinheiten (FU) bezeichnet, da sie aus dem Bioanalyzer Software ausgelesen werden kann. Legen Sie die 4 (3) Gipfeln mit dem höchsten Fluoreszenz in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 126.130.132.137.
      HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzen FU durch die Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen.
5. Drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen". Ein Höhepunkt ist dann relevant, wenn die beobachtete Fluoreszenz den Wert im Feld "Minimal Peakhöhe" gegeben überschreitet.
6. Infer den Genotyp.
   1. Legen Sie in die Textbox Mahal "Input Peaks (bp)" die Größen in bp aller relevanten Peaks in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 440.462.519.579.637.
      HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzengrößen von der Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen.
7. Drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen".
8. In der ListeFeld, suchen Sie nach der minimalen squared Mahalanobisdistanz "d2m". Wenn der entsprechende Wert P Recht, es ist ≥0.05 dann ist die Wahrscheinlichkeit ≥5% , dass die Null - Hypothese H ₀ wird abgelehnt (H _0: die beobachtete und das Bezugsprofil identisch sind) , was bedeutet , daß die beobachtete Profil zu sein wird angenommen , identisch mit das Bezugsprofil des angegebenen Genotyp.
9. Wenn d2m minimal ist , aber das Feld des entsprechenden P - Wert ist leer, ablehnen H ₀ mit einer Wahrscheinlichkeit <5%.
   ANMERKUNG: Dies bedeutet, dass die Profilierungen ungleich sind, obwohl d2m minimal ist. Ein solches Ergebnis aus nicht-Durchschnitt Elektrophorese-Bedingungen führen kann.
   1. Um diese Abweichungen zu korrigieren, fügen Sie in das Textfeld "Beobachtet Peak (bp)" den Wert 395 ein und drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen". Überprüfen Sie noch einmal für minimale d2m und eine entsprechende P-Wert ≥0.05. Gelingt dies nicht, versuchen Sie die Werte 405, 415 und 425.
      HINWEIS: Manchmal kleinere Schritte sind auchangegeben. Wenn noch nicht erfolgreich, das beobachtete Profil nicht in der Referenzdaten ist, kann es einen neuen Genotyp oder eine Variante sein.
10. Verschiedene Profile
    1. Wiederholen Sie die Schritte 5,6-5,9 für jede Elektrophorese Profil getrennt.

Ergebnisse

Definition eines Genotyp und seine Varianten

Eine elektrophoretische Profil in mehr als ein Band aus allen identifizierten Genotypen unterschiedlichen wird als neuer Genotyp betrachtet. Neue Genotypen werden nach Fournier et al genannt und erweitert. ⁵ mit den Genotypen GTA GTZ führt, die von den Genotypen GTAA zu GTAZ gefolgt, und GTBA zu GTBZ und GTCA zu AVB derzeit. Variation in nur einem Band a...

Diskussion

Der wichtigste Schritt des gesamten Verfahrens ist , wenn ein Überschuß an DNA in RS-PCR ist (> 30 ng reine DNA / assay) ^2. Im allgemeinen Auflösung eines Profils ist optimal, wenn alle ihre Spitzen an der Grundlinie beginnen und enden. Wenn zwei Spitzen zu nahe beieinander sind, die Auflösung ist unvollständig. Unter diesen Bedingungen kann die Bioanalyzer Software zu unangemessenen Spitzen Identifizierung führen, so dass die manuelle Identifikation erforderlich ist.

Alle sich...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; Substanz entspricht Na2EDTA· 2H2O
Salzsäure 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia Agar+5% Schafblut	bioMé rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalysator	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 Expertensoftware	Agilent Technologies
HotStarTaq Master Mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'