Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Zusammenfassung

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Zusammenfassung

Transduktions-Transplantation ist eine schnelle und effiziente Methode, um menschliche hämatologische Malignome bei Mäusen zu modellieren. Diese Technik führt zur Expression des interessierenden Gens in hämatopoetischen Zellen und kann verwendet werden, um die Rolle des Gens bei der normalen und/oder malignen Hämatopoese zu untersuchen. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Durchführung einer Transduktionstransplantation anhand von Calreticulin (CALR)-Mutationen, die kürzlich bei myeloproliferativen Neoplasien (MPN) identifiziert wurden. In diesem Protokoll werden ganze Knochenmarkzellen von mit 5-Flururacil (5-FU) behandelten Spendermäusen mit einem Retrovirus transduziert, das für mutiertes CALR kodiert, und in letal bestrahlte syngene Wirte transplantiert. Spenderzellen, die mutiertes CALR exprimieren, sind mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert. Transplantierte Mäuse entwickeln einen MPN-Phänotyp, der erhöhte Blutplättchen im peripheren Blut, eine Ausdehnung der Megakaryozyten im Knochenmark und eine Knochenmarkfibrose umfasst. Wir geben eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie man Retroviren erzeugt, den Virustiter berechnet, ganze Knochenmarkzellen transduziert und in bestrahlte Empfängermäuse transplantiert.

Einleitung

Transduktion-Transplantation ist eine nützliche Methode hämatologischen Malignomen in Mäusen zu modellieren. Diese Technik ist besonders wertvoll myeloischen malignen Erkrankungen , für das Studium an der ersten Demonstration aus dem Jahr die ektopische Expression von BCR-ABL1 getreulich chronischer myeloischer Leukämie in Mäusen ¹ rekapitulieren könnte. Diese Technik hat in der Folge der umfangreichen Studie von JAK2 ^V617F und MPL ^{W515K / L} mutierten myeloproliferativen Neoplasien (MPN) erleichtert.

MPN sind eine Gruppe von hämatologischen durch die Überproduktion von reifen myeloischen Zellen und Knochen....

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of California, Irvine genehmigt und durchgeführt. Alle Verfahren wurden unter Isofluran-Narkose durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren.

1. Erzeugung von ekotropischen Retrovirus

1. Bereiten hochwertige Plasmide mit einer Konzentration von mindestens 1 & mgr; g / & mgr; l entweder eine kommerzielle maxi-prep Kits oder Cäsiumchlorid-Reinigung verwendet wird.
   HINWEIS: Dazu gehören ein MSCV Rückgrat Vektor codiert , das Gen von Interesse (in diesem Fall CALR ^7,8)....

Ergebnisse

Die Transduktion-Transplantationstechnik führt in hämatopoetische Rekonstitution der Empfängermäuse mit Zellen, die das Gen von Interesse exprimieren. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die transduktionsfertige Transplantation Mausmodell der Calretikulin mutiert MPN. Kurz gesagt, wird Retro CALRwt oder CALRdel52 exprimieren, verwendet BM-Zellen aus einem C57B / 6 Spendermaus zu infizieren. Transduzierten Zellen transplantiert in bestrahlten C57B / 6 Empfängermaus und.......

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Beschreibung, wie Knochenmark-Transplantationen bei Mäusen führen ein wesentlicher thrombocythemia ähnliche Erkrankung mit Progression zu Myelofibrose mit CALRdel52 Mutation als Treiber der Krankheit zu rekapitulieren. Erfolgreiche Transplantation von Zellen CALRdel52 führt zu einer erhöhten Thrombozyten Expansion von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose exprimieren. Als Knochenmarktransplantation ein mehrstufiger Prozess ist, ist es wichtig, Maßnahmen zu erkennen, wo technisch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cell Lines
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T Zellen	ATCC	CRL-11268
3T3 Zellen	ATCC	CRL-1658
Plasmide
EcoPak, auch bekannt als pCL-Eco	Addgene	12371	Retrovirale Verpackungszelllinien wie EcoPack 2-293 können anstelle des EcoPak-Plasmids und der Standard-293T-Zellen verwendet werden. Zusätzliche γ-Retrovirus-Hüll- und Verpackungsplasmide sind unter anderem von Addgene erhältlich.
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene		20672	Zusätzliche γ-retrovirale Transferplasmide sind unter anderem von Addgene erhältlich.
Verbrauchsmaterialien
27 G x 1/2" Nadeln	BD	305620
Fötales Rinderserum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0,05%)	Corning	MT-25-052-CI	Kann hausgemacht sein
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10 cm Schalen	Fisher	172931
15 ml konische Röhrchen	Fisher	12565268
60 mm Schalen	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100 µ m Zellsiebe	Fisher	22363549
50 ml konische Röhrchen	Fisher	12565270
6-Well-Platte	Fisher	130184
FACS-Röhrchen	Fisher	14-959-5
0,45 μ m Spritzenvorsatzfilter	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK Puffer	Lonza	10-548E	Kann selbst gemacht werden
Rekombinante Maus IL-3	Peprotech	213-13
Rekombinante Maus IL-6	Peprotech	216-16
Rekombinante Maus SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfektionsreagenz
1,5 ml Zentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5500
Equipment
BD Accuri C6
Röntgenbestrahlungsgerät