Methodenartikel

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

DOI:

10.3791/54641

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4. November 2016

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Zusammenfassung

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Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine Technik zur Aufreinigung spezifischer Zellpopulationen basierend auf Phänotypen, die durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die Eigenschaften einer einzelnen Zellpopulation ohne den Einfluss anderer Zellen besser zu verstehen. Im Vergleich zu anderen Methoden der Zellanreicherung, wie z. B. der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MCS), ist FACS aufgrund der Fähigkeit der Phänotyperkennung durch Durchflusszytometrie flexibler und genauer für die Zelltrennung. Darüber hinaus ist FACS in der Regel in der Lage, mehrere Zellpopulationen gleichzeitig zu trennen, was die Effizienz und Vielfalt der Experimente verbessert. Obwohl FACS einige Einschränkungen aufweist, wird es in großem Umfang zur Reinigung von Zellen für funktionelle Studien sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt. Hier berichten wir über ein Protokoll, das fluoreszenzaktivierte Zellsortierung verwendet, um eine sehr seltene Population von Immunzellen, plasmazytoide dendritische Zellen (pDC), mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-anfälligen Mäusen für in vitro funktionelle Studien von pDC zu isolieren.

Einleitung

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Die effiziente Trennung einer Zellpopulation der Wahl von anderen Zellen ermöglicht Studien der Population, die sonst möglicherweise nicht möglich wären. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine Methode, um eine interessante Zellpopulation mit hoher Reinheit anzureichern. 1,2 Verschiedene Zelltypen exprimieren in der Regel einzigartige Moleküle oder eine einzigartige Kombination mehrerer Moleküle auf der Plasmamembran, die eine Zellpopulation von einer anderen unterscheiden können. Nach der Bindung dieser Zelloberflächenmoleküle durch spezifische fluoreszenzkonjugierte Antikörper ist eine Detektionsmaschine namens Durchflusszytometer/-sorter in der Lage, die Lichtsignale verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, die unterschiedliche Molekülmarker auf den Zellen auf Einzelzellebene darstellen, anzuregen und zu detektieren. Die kombinierte Information, die entweder aus dem Vorhandensein eines Lichtsignals (für die positive Expression des entsprechenden Oberflächenmoleküls) oder der Abwesenheit eines Lichtsignals (für die negative Expression eines Moleküls) besteht, definiert den Phänotyp der Zelle. Nach dem Passieren des Detektors werden Zellen mit dem gleichen Phänotyp aufgrund der elektrischen Ladung zu einem bestimmten Sammelrohr umgeleitet.

FACS wird in verschiedenen Studien breit angewendet, solange die zu bereichernde Population mit Fluoreszenz markiert wird. 3-7 Es wurde verwendet, um Immunglobulin (Ig)A-beschichtete Bakterien von nicht-IgA-beschichteten Bakterien in der Darmmikrobiota zu trennen 8 und gentechnisch veränderte Zellpopulationen zu sortieren, die fluoreszierende Proteine exprimieren. 9 Wichtig ist, dass es in der Lage ist, mehr als eine Population gleichzeitig zu trennen, was nicht nur Zeit und Reagenzien spart, sondern auch anspruchsvollere Studiendesigns ermöglicht. 10 FACS hat jedoch auch seine Grenzen. Wenn eine Population von Interesse sehr selten ist (weniger als 1 %), kann die Sortiereffizienz verringert werden, was zu einem erheblichen Zellverlust führt. Darüber hinaus kann eine gewisse Antikörperbindung die intrazelluläre Signaltransduktion aktivieren, die funktionelle Veränderungen der sortierten Zellpopulation induziert. 11 Daher sollte der Phänotyp, der für die Sortierung verwendet wird, sorgfältig ausgewählt werden.

Neben FACS existieren noch andere Methoden, die ebenfalls auf Zelloberflächenmarkern für die Anreicherung spezifischer Zellpopulationen basieren, wie z.B. magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MCS). 12 Ähnlich wie FACS können magnetische Beads-konjugierte Antikörper auf spezifische Zelloberflächenmoleküle abzielen. Bei der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung können mit magnetischen Kügelchen beschichtete Zellen nach dem Passieren eines Magnetfeldes von unbeschichteten Zellen getrennt werden. Allerdings kann bei MCS nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen anvisiert werden, da magnetische Kügelchen im Gegensatz zu verschiedenen fluoreszierenden Farben in FACS nicht unterscheidbar sind. Für MCS ist es daher schwierig, einen Zellphänotyp mit einer komplizierten Kombination von Oberflächenmarkern zu definieren. 13,14 Darüber hinaus ist MCS auch in der Lage, eine unbeabsichtigte Aktivierung von Zielzellen zu verursachen.

In unseren Studien an einem Mausmodell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) 15 beabsichtigten wir, plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) zu reinigen, um ihre funktionellen Veränderungen mit fortschreitender Krankheit zu untersuchen. Wir verwendeten MCS zunächst, um pDC aus dem Knochenmark anzureichern, indem wir auf PDCA-1 abzielten, ein Molekül, das auf murinem pDC im Steady State stark und einzigartig exprimiert wird. 16 Die Zellreinheit war jedoch unerwartet niedrig, was wahrscheinlich auf die Hochregulierung von PDCA-1 auf anderen Zellpopulationen in einem entzündlichen Milieu wie SLE zurückzuführen ist. 16 Letztendlich haben wir FACS mit einer Kombination aus vier Oberflächenmarkern (CD11c, CD11b, B220 und PDCA-1) verwendet, um hochreine pDC als CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+-Population zu trennen. Murine pDC hat einen weiteren spezifischen Oberflächenmarker, Siglec-H. Wir haben uns entschieden, Siglec-H nicht zu verwenden, da die Antikörperbindung dieses Moleküls die Funktion von pDC zur Produktion von IFNα unterdrückt. 11

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Protokoll

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HINWEIS: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) Lupus anfällige Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen freien Anlage entsprechend den Anforderungen des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech (Animal Welfare Assurance Anzahl gezüchtet und gepflegt: A3208-01). Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierversuche wurden unter IACUC Protokoll # 12-062 durchgeführt.

1. Zellkulturmedium und Sortierpuffer

  1. Bereiten komplette Zellkulturmedium (C10) unter Verwendung von RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100 MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
  2. Bereiten Sortierpuffer (HBSS-full) unter Verwendung von 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin,0,05 mM MgCl 2 und 0,2 U / ml DNase I.

2. Maus Dissection

  1. Bereiten Sie zwei 6-cm Durchmesser Schalen mit 4 ml C10. Die Schalen werden auf Eis.
  2. Euthanize die Maus durch CO 2 Inhalation.
  3. Ernten Sie die Milz und halten Sie sie in eine Schüssel mit C10 auf dem Eis.
    1. Pin der Maus mit dem Bauch nach unten nach oben auf der Dissektion Platte. Sterilisieren Sie den Körper 70% Ethanol durch Sprühen.
    2. Schneiden Sie die Haut und trennen Sie die Haut von der Muskelwand unterhalb entlang der ventralen Mittellinie von der Symphyse bis zum Hals.
    3. Schneiden Sie die Haut an der hinteren Gliedmaßen vom ersten Schnitt bis zum Knöchel.
    4. Pin der Haut zurück an den Seiten und schneiden Sie die Muskelwand entlang der Seiten von der ersten Einschnitt statt abblendet.
    5. Pin der Muskelwand auf der rechten Seite des Kopfes zurück.
    6. Lokalisieren der Milz auf der rechten Seite der Maus unter dem Dünndarm und neben dem Magen. Pick-up ein Ende the Milz und es aus dem Magen zu trennen.
  4. Schneiden Sie die beiden hinteren Extremitäten, einschließlich Femur und Tibia, und entfernen Sie alle Muskeln so viel wie möglich.
    1. Schneiden Sie die Muskeln entlang der hinteren Gliedmaßen aus dem Becken / Hüftgelenk bis zum Knöchel mit einer scharfen Schere, versuchen, die Blutgefäße zu vermeiden.
    2. Trennen Sie die hinteren Gliedmaßen, indem du den Becken / Hüftgelenk Schneiden und Knöchel / Fußgelenk ohne die Exposition von Knochenmark Inhalte.
    3. Saubere verbleibenden Muskeln an den Knochen durch wiederholt mit einer Rasierklinge Kratzen und die Muskeln an den Verbindungspunkten schneiden.
  5. Halten Sie die Knochen in einer 6 cm Schale mit 4 ml C10 auf dem Eis. Fahren Sie die nächste Maus zu sezieren.

3. Splenozyten- Isolation

  1. Homogenisieren der Milz vorsichtig mit einem Spritzenkolben gegen eine 70 & mgr; m Zellsieb auf der Oberseite der Schale mit 4 ml C10 bis keine roten Stück sichtbar sind.
  2. Fügen Sie weitere 6 ml C10 in die Schale durch das Sieb einnd dann übertragen die insgesamt 10 ml Zellsuspension auf eine 15 ml konischen Röhrchen.
  3. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
  4. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und Zellpellet in 2 ml 1 x roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. 5 min bei RT inkubiert.
  5. zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 800 xg Nach der Inkubation für 5 min, 4 ° C.
  6. Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 1 ml C10 resuspendieren. Entsorgen Sie alle großen Klumpen (tote Zellen) und halten Sie die Röhrchen auf Eis für später.
    HINWEIS: Wenn es viele kleine Klumpen sind, verwenden Sie eine 70-um-Zelle Sieb einmal die Zellsuspension zu filtern.
  7. Zählen Sie die Zellzahl mit Trypanblau unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler.

4. Knochenmarkzellisolierung

  1. Übertragen Sie die Knochen mit 4 ml C10 in einen Mörser und 6 ml C10 auf ein Volumen von 10 ml C10 insgesamt machen.
  2. Knacken Sie die Knochen sanft in den Mörtel von ap mitestle.
  3. Rühren Sie vorsichtig mit dem Stößel des Knochenmarks in C10 zu lösen.
  4. Übertragen Sie die 10 ml C10 enthält Knochenmark in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis durch einen 70-um-Zelle Sieb. 10 ml frisch C10 in den Mörtel noch die Knochen enthält.
    HINWEIS: Pipettieren Sie die Lösung, die auf Knochenmark und nach unten mehrmals, bevor sie durch das Sieb vorbei, wenn roten Klumpen sichtbar sind.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 zweimal. Nach der letzten Waschung sollten die Knochen weiß erscheinen.
  6. Zentrifugation der 50 ml konischen Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. Inzwischen bereiten 5 ml ready-to-use-Dichtegradienten-Medium in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen bei RT.
  7. Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 10 ml C10 resuspendieren.
  8. die 10 ml Zellsuspension auf dem 5 ml Dichtegradientenmedium, die Aufrechterhaltung klare Schnittstelle zwischen den beiden Phasen langsam die Schicht. zentrifugieren dann den 15 ml konischen Röhrchen bei 1.363 g für 30 min beiRT (20 ° C) mit einer Beschleunigung Satz als 9 und Verzögerung eingestellt als 0 (oder Bremse AUS).
  9. die Top 8 ml Lösung sorgfältig und sammeln Sie die 2 ml Leukozytenmanschette an der Schnittstelle (eine Schicht aus einkernigen Zellen) in eine neue 15 ml konischen Röhrchen Nach der Zentrifugation zu entfernen.
  10. In 12 ml eiskaltem C10 zu den 15 ml konischen Röhrchen mit einkernigen Zellen des Knochenmarks, Kappe und mehrmals umdrehen gut zu mischen, dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 800 g für 10 min, 4 ° C.

5. Zeiloberflächenfärbung für FACS

  1. Probenfärbung
    1. Bereiten anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung (1 bis 100 Verdünnung in HBSS-voll, 5 ug / ml Endkonzentration).
    2. Nach der Zentrifugation in Schritt 4.10, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 100 ul anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung resuspendieren Fc-Rezeptor auf den mononukleären Zellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min.
    3. Bereiten Fluoreszenz-konjugiertes Antikörpermischung (anti-Maus CD11c-PE Verdünnung von 1:40, Anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 und anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40 in HBSS- voll, wie bei 100 & mgr; l Endvolumen pro Probe vom Hersteller empfohlen).
      HINWEIS: Es ist wichtig, Antikörper vor dem Gebrauch zu titrieren.
    4. Nach 10 min Inkubation in Schritt 5.1.2, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundenen Anti-Maus-CD16 / 32 zu entfernen.
    5. Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 100 ul fluoreszenz konjugierten Antikörpermischung. Inkubieren auf Eis für 15 min im Dunkeln.
    6. Nach 15 min Inkubation, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundene Fluoreszenz-konjugierte Antikörper zu entfernen.
    7. Bereiten Sie FACS Ladelösung (500 ng / ml DAPI in HBSS-voll).
    8. Nach der Zentrifugation in Schritt 5.1.6, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μ resuspendieren; L FACS Beladungslösung. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 12 x 75 mm Rundbodenrohr (FACS-Röhrchen) und halten Sie das Rohr auf Eis im Dunkeln innerhalb von 1 Stunde bis zu sortieren.
  2. Das Anfärben zur Kompensation
    1. Label-6 FACS-Röhrchen wie PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI oder ungefärbt. Aliquotieren Splenozyten bei 1 x 10 6 Zellen / Röhrchen in die FACS - Röhrchen und waschen mit 4 ml HBSS-Voll bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
      HINWEIS: Die Verwendung DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, DAPI, lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. DAPI kann die Plasmamembran von toten Zellen durchlaufen (aber nicht von lebenden Zellen) und binden Chromosom DNA.
    2. Den Überstand aspirieren und Zellpellet in 100 ul HBSS-voll.
    3. In jedes Röhrchen FACS entspricht, fügen Sie eine der folgenden Antikörper: anti-Maus-CD19-PE Verdünnung von 1:40, anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus-PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 oder Anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40, wie durch die manufa empfohlencturer. Lassen Sie das 5. (DAPI) und 6. (ungefärbten) FACS - Röhrchen , wie sie sind. Gut mischen durch Schütteln und Inkubation alle FACS-Röhrchen auf Eis im Dunkeln für 15 min.
    4. Nach der Inkubation 4 ml eiskaltem HBSS voll in jedes Rohr und Zentrifuge die FACS-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
    5. Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 500 ul eiskaltem HBSS-full Ausnahme des Pellets in dem Rohr DAPI markiert, die in 500 & mgr; l FACS Beladungslösung resuspendiert. Halten Sie alle 6 Röhrchen auf Eis im Dunkeln bis zu sortieren.

6. Sortierung auf dem Cell Sorter

HINWEIS: Der Betrieb auf dem Zytometer Verfahren Sortieren und Software wird mit einer ausführlichen Belehrung durch die Firma standardisiert. Kurz gesagt, verwenden wir bei 20 psi 100 Mikron Düse, Konzentration eingestellt Zielzelle zwischen 5-10000000 pro ml, und die Effizienz auf 70% einstellen oder höher (dh gehalten Konflikte unter 30%).

  1. Bereiten Sammlung FACS-Röhrchen mit 500 & mgr; l FBS / Röhrchen, die 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
  2. Stellen Sie Kompensationsparameter des Zellsortierer Einzelfleckenkompensations Rohre aus Schritt 5.2 verwendet wird.
    1. Nehmen 10.000 Zellen in ungefärbten Röhre für jede Fluoreszenzintensität negative Gate einzustellen.
    2. Nehmen 10.000 Zellen in anderen Single-Fleckenkompensations Röhrchen für jede Fluoreszenzintensität positive Gate einzustellen.
      HINWEIS: Die Software berechnet automatisch die Kompensationsparameter.
  3. Verwenden Sie eine Probe aus Schritt 5.1 die Tore der sortierten Zellpopulationen zu setzen, indem 3.000 Zellen aufnehmen. Verwendung von Fluoreszenzintensität als Parameter X und Y-Achsen-Diagramm, Gate- Zielzellpopulation manuell als Gruppe von Punkten offenbar von anderen Punkten getrennt werden.
    HINWEIS: Diese Gating-Set ist flexibel und willkürlich basierend auf den Anforderungen der Forscher. Wenn Forscher eine höhere Reinheit erwarten basierend auf einem oder mehreren Markern, bewegen Sie das Torbasierend höher auf der entsprechenden Fluoreszenzintensität.
  4. Laden Sie ein Sammelrohr und starten Sie die Zielzellpopulation zu sortieren.
  5. Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis nach dem Sortieren, bis alle Probenröhrchen fertig sind.
  6. In eiskalter C10 zum Sammelrohr bis zu 4 ml, Kappe und umkehren zu mischen.
  7. Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C, und dann den Überstand aspirieren, so dass etwa 200 & mgr; l mit Zellpellet unberührt.
  8. 1 ml eiskaltem C10, um das Zellpellet zu resuspendieren und übertragen alle Zellsuspension in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
  9. Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C und den Überstand aspirieren, so dass 100 & mgr; l mit dem Zellpellet unberührt.
  10. Speichern Sie die sortierten Zellpopulationen auf Eis bis zum Gebrauch.

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Ergebnisse

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Wir wollten Knochenmark pDC- mit hoher Reinheit und ohne den Einfluss von anderen Zelltypen, von MRL / lpr Lupus anfällige Mäuse von jung und alt Alter zu bereichern die funktionelle Veränderungen der pDC- in Bezug auf ihre Fähigkeit zu untersuchen IFN alpha zu produzieren. Die erste Reinigungsstrategie verwendete MCS, die, wie Figur 1 zeigt, um nach der Anreicherung nur 7,75% Reinheit führte. Im Vergleich zu MCS, angereichert FACS pDC- mit Reinheit so hoch wie 96,4%. Um...

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Diskussion

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Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll dient der hochreinen Anreicherung von lebendem pDC, das die Fähigkeit zur Herstellung von IFNα beibehält. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Reinigung von pDC und/oder anderen mononukleären Zellen aus dem Knochenmark von MRL/lpr und anderen Mausstämmen zur Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen. Mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll bestehen darin, eine hohe Lebensfähigkeit und Reinheit des sortierten pDC sich...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit besteht.

Danksagungen

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Wir danken dem Durchflusszytometrie-Labor am Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine für die Nutzung der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung. Diese Arbeit wurde durch die Startkapital von XML unterstützt. XL ist Stamps Fellow im Graduiertenprogramm Biomedical and Veterinary Sciences.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMI 1640gibco von life technologies11875-093
fötales RinderserumHyCloneSH30396.03
Natriumpyruvatgibco von life technologies11360-070
MEM nicht-essentielle Aminosäurengibco von life technologies11140-050
HEPESgibco von life technologies15630-080
2-MercaptoethanolGibco von Life Technologies21985-023
L-Glutamingibco von life technologies25030-164
Penicillin-Streptomycingibco von life technologies15140-122
1x Hank' s Ausgewogene Salzlösung gibco by life technologies14175-079
MACS BSA StammlösungMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC)eBioscience00-4300-54
Dichtegradient mittelGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
Anti-Maus CD19-PEBD Pharmingen553786
Anti-Maus CD11c-PEeBioscience12-0114-82
Anti-Maus CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
Anti-Maus PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
Anti-Maus B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIInvitrogenD3571
Plasmazytoid Dendritische Zellen Isolation Kit II, MausMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I Durchflusszytometer BD Biosciences643178
BD FACS Diva Version 6BD Biosciences

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959(2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).

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Schlagwörter

Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

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