Zuverlässige Methode zur Beurteilung der Samenkeimung Dormanz und Mortalität unter Feldbedingungen

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Beurteilung der Samen überleben, Keimung und Dormanz unter Feldbedingungen mit begraben, markierten Samen Streifen und Tetrazoliumchlorid (TZ) Vitalitätstests.

Abstract

Wir beschreiben Techniken zur Annäherung der Samenbankdynamik im Laufe der Zeit am Beispiel von Helianthus annuus. Streifen aus durchlässigem Polyestergewebe und Klebstoff können gefaltet und geklebt werden, um einen Streifen von Fächern zu bilden, die Saatgut und Identifikationsinformationen aufnehmen und gleichzeitig den Kontakt mit Bodensickerwasser, Wasser, Mikroorganismen und Umgebungstemperatur ermöglichen. Streifen können mit einer Vielzahl von Kompartimentnummern und -größen konstruiert werden und ermöglichen es dem Forscher, eine Vielzahl von Genotypen innerhalb einer einzigen Art, verschiedener Arten oder Samen, die unterschiedliche Behandlungen erfahren haben, unterzubringen. Im Gegensatz zu einzelnen Saatgutpackungen lassen sich die Streifen leichter als Einheit entnehmen. Während Replikatpakete in einen Strip aufgenommen werden können, können verschiedene Strips als Blöcke fungieren oder zu unterschiedlichen Zeiten abgerufen werden, um das Seed-Verhalten im Laufe der Zeit zu beobachten. Wir verwendeten eine Hochtemperatur-Klebepistole, um die Fächer abzugrenzen, und versiegelten die Streifen, sobald das Saatgut und die Etiketten mit den Block- und Entfernungszeiten eingesetzt wurden. Anschließend wurden die Saatstreifen in der gewünschten Tiefe auf dem Feld vergraben und die Stelle für die spätere Entnahme markiert. Grabende tierische Raubtiere wurden durch die Verwendung einer Abdeckung mit Metallgitter auf der Bodenoberfläche effektiv ausgeschlossen. Nach dem gewählten Zeitintervall für die Bestattung wurden Streifen ausgegraben und die Samen auf Keimung, Ruhephase und Mortalität untersucht. Während tote Samen oft eindeutig von nicht erminierten lebenden Samen mit dem Auge unterschieden werden können, wurden ruhende Samen mit einem kolorimetrischen Standardtest von Tetrazoliumchlorid für die Lebensfähigkeit der Samen eindeutig identifiziert.

Introduction

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zuverlässig Samen Überleben im Laufe der Zeit unter Feldbedingungen zu beurteilen.

Bodensamenbanken sind eine Reserve von verteilt, durchführbare noch nicht gekeimten Samen verteilt entweder auf der Bodenoberfläche, innerhalb von Oberflächen Streu oder innerhalb des Bodenprofils, das ^1,2 transient oder für viele Jahre andauern kann. Bei der Saatgut Bestattung Methoden ähnlich denen hier vorgestellten einer Studie von 17 Jahren angewendet wurden mehrere Dutzend Arten verwendet wurden keimfähige Samen getestet ³ in viele der Arten gefunden. Samenruhe ist ein Block Keimung auf Saatgut , bis die entsprechende Kombination von Bedingungen für Sämling Überleben ⁴ entstehen. ruhend Rest können Samen lassen rauen Bedingungen, wie niedrigen Temperaturen im Winter, Nährstoffmangel, oder saisonale Trockenheit überleben, bis ein externer Trigger für Dormanz-Release für die Keimung ermöglicht. Auslöser für Dormanz-Freisetzung kann variieren von der Exposition gegenüber verlängert Kälte, Verbindungen, die durch f linksire oder physischen Angriff auf die Samenschale durch Abrieb oder Kontakt mit tierischen Magensäure ^5. Als Keimung Cues können aus der Vergangenheit natürliche Selektion Gattungen oder Arten spezifisch und oft führen sein, maladaptive Keimung der Samen ist das, was zu einem ungünstigen Zeitpunkt erfolgt, und in Samen oder Sämling Sterblichkeit oder schlechte Sämlingwachstum führen kann. Während dormancy hat sich zu einer Reihe von Arten auf die Mechanismen der Dormanz Freisetzung (zB körperliche dormancy, physiologische Dormanz), ⁶ Samenruhe bleibt eine der am wenigsten verstandenen Themen in der Pflanzenbiologie basiert klassifiziert. So Feldstudien, die zur Beurteilung des Status der einzelnen Samen oder Gruppen von Saatgut unter relevanten ökologischen Bedingungen haben eine höhere Aussagekraft als die erlauben, die einfach auf Standard-Keimtests im Labor verlassen.

Ausnutzung von Saatguteigenschaften können Einblick in die Mechanismen der Ruhe bieten. Kontrolle der Keimruhe ist Complex, einschließlich der genetischen Kontrolle der physiologischen und morphologischen Faktoren. Während ein volles Verständnis der Breite der Dormanz Mechanismen noch aufgeklärt werden, hat ein allgemeines Modell entstanden, eine Rückkopplungsbeziehung zwischen den beiden Pflanzenhormone Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) ⁷ beteiligt sind . In diesem verallgemeinerten Modell für Saatgut mit einer physiologischen Komponente zu ihrem Schlummer, dient GA als Signal für dormancy Release, während ABA in den Ruhezustand zu halten dient. Maternal genetische Effekte sowie die mütterliche Wachstumsumgebung kann durch mütterlich erzeugte Gewebe und Entwicklungssignale ⁸ dormancy und andere Samen Merkmale wie Größe beeinflussen. Maternal erzeugt äußeren Strukturen (oder Samen Beläge) dormancy halten kann, mit physiologischer Signale manchmal in Kombination. Da maternalen Samen Beläge von der Mutterpflanze die Gene gesteuert werden, können sie spiegeln nicht die tatsächliche Kern genetische Make-up Samen. Wir haben unsed die Helianthus annuus achenes aus einer Reihe von Pflanzenwild Hybrid kreuzt diese mütterlichen gegen Embryo genetische Effekte auf Saatgut Eigenschaften ^9,10. So , die verschiedene Spezies, Cross - Typen oder Genotypen gehören Entwürfe Studie herauszukitzeln über die auflesen kann Ökologie und Genetik von Samenruhe, die Keimung und das Überleben.

Ein wichtiges Beispiel dafür, wie die Keimung der Samen und das Überleben Phänotypen Populationsdynamik beeinflussen können im Pflanzen-Wildhybridzonen zu sehen. Auswahl während der Domestikation von Kulturpflanzen beseitigt die meisten dormancy und reduziert die Fähigkeit des Samen außerhalb der Vegetationsperiode zu überleben. Doch Genfluss oder Hybridisierung zwischen den Kultur- und Wildarten in Pflanzenwildhybridzonen können Ernte-Allele (oder genetische Varianten) in eine Wildpopulation, mit möglichen Auswirkungen auf die Samenbank Dynamik wieder einführen. Hybrids zwischen Kultur- und Wild Verwandten möglicherweise in Pflanzenwildhybridzonen gefunden besitzen kanneine Vielzahl von Zwischen Dormanz Phänotypen, mit nur wenigen Phänotypen erwarteten Bedingungen außerhalb der Kultivierung (zB Wintermonate) ¹¹ , um zu überleben.

Das Ziel dieses Manuskript ist zu zeigen, wie die Samen Grabstreifenmethode verwenden, können wir die Keimung, Dormanz, und das Überleben einer Reihe von Samenarten zu unterschiedlichen Zeitperioden zu bewerten, um ihre natürliche Variation unter Feldbedingungen zu untersuchen. In unserem Beispiel verwendeten wir Sonnenblumenkerne aus 15 Pflanzenwildtypen Hybrid-Kreuzung, da wir daran interessiert, von Mutter und Embryo genetische Effekte auf die Samenmerkmale sind.

Protocol

1. Sammeln Samen aus mehreren Arten oder kontrollierte Kreuze einer einzelnen Spezies

Hinweis: Dieses Beispiel verwendet Samen von 15 Kreuztypen innerhalb der Spezies Helianthus annuus (Sonnenblume) mit wilden, Hybrid- und Pflanzenarten wie die mütterliche (Saatgutvermehrungs) Eltern.

1. Am Ende der Vegetationsperiode sammeln reifen Samenkapseln in etikettierte Tüten. Saubere Samen von Spreu und Ort Samen in Umschläge mit elterlicher Kreuztyp im Standardformat beschriftet (dh mütterliche x väterlicherseits).
2. Bulk seed zusammen in großen Umschläge unter Verwendung gleicher Mengen von Saatgut aus einer gleichen Anzahl von identischen Elternquertypen. Zum Beispiel 100 Samen von 10 Cross-Typen mit den gleichen mütterlichen und väterlichen Eltern. Beschriften Sie die Umschläge mit Identifizierung (Kreuztyp). Diese großen Umschläge sind Samen Meister für die Verwendung bei der Besetzung von Grabstreifen in Abschnitt 2.

	Maternal Eltern
Väterliche Eltern	Wild: wXw	F 1: WXC	Crop: CxC
Wild: wXw	0% wXw	25% F 1 x B †	50% CXW †
BC: WxF1 oder F1xW	12,5% WxBC	37,5% F 1 XBC	62,5% CxBC
F 1: WXC	25% WXF 1 †	50% F 1 xF 1	75% CxF 1 †
F 2: F 1 xF 1	25% WXF 2	50% F 1 xF 2	75% CxF 2
Crop: CxC	50% WXC †	75% F 1 xC †	100% CxC

Tabelle 1. Kinderkreuz tfür den Einsatz in der Saatgutgrab Experiment ypes von Hand hergestellt Bestäubung. Sunflower Ernte-Wild Hybrid - Kreuz - Typen wurden mit Handbestäubung hergestellt. Für alle Quertypen aufgelistet die mütterliche Eltern erste und die väterliche Eltern zweiten aufgeführt. Kreuztypen markiert mit † sind Teil der gegenseitigen Kreuztyp-Paare mit den gleichen% Crop-Allele, aber unterschiedliche mütterliche Eltern. Tabelle wurde zuvor veröffentlicht in: Pace, BA et al. (2015) ^15.

2. Erstellen von benutzerdefinierten Seed Beerdigung Strips

HINWEIS: Für dieses Beispiel hatten wir drei Entnahmedatum Behandlungen und 15 Wiederholungen, so benötigt man 45 Streifen insgesamt. In diesem Beispiel werden 15 Fächer pro Streifen so, wir genug feinmaschigen Polyestergewebe oder Moskitonetz zu Haus 15, 7 x 10 cm Fächer erforderlich. Siehe Abbildung 1.

1. Beginnen Sie mit einer 20 x 105 cm Stoffstreifen für jeden Samen Streifen schneiden.
2. Messen und markieren Fächer, dann falten Sie den Stoff in zwei Hälften. Mit einem high Temperaturklebepistole, Siegel einen kurzen (10 cm) Ende. Sobald der Kleber leicht abkühlt, aber nicht vollständig, drücken Sie die Stoffseiten zusammen, um eine Dichtung zu schaffen.
   VORSICHT: Hochtemperatur-Kleber und Klebepistole Tipps können Verbrennungen verursachen, wenn Berührung mit der Haut verlängert.
3. Klebelinien aus dem gefalteten Rand zum offenen kurzen Ende in jedem Fach-Marke. Drücken Sie die beiden Stoffseiten zusammen entlang der Leimfugen, um sicherzustellen, Dichtungen ohne Löcher zwischen den Kammern. Samen der Migration zwischen den Kammern tragen zur experimentellen Fehler.
   HINWEIS: Nun, da die Fächer geschaffen wurden, sollte die ungefalteten Kante offen und bereit bleiben Samen und deren identifizierende Informationen (Cross-Name) zu empfangen.
4. Randomly Samen Quertypen Fächern für jeden Streifen zuordnen.
   1. Füllen seed Kompartimenten mit einer einheitlichen Anzahl von Samen (20 für jedes Fach werden in diesem Beispiel verwendet wird). Für Etiketten, verwenden industrielle Filzstiften auf cut-to-fit Kunststoff-Garten Darts, so dass sie in der Lage sindstandhalten Bestattung.
      HINWEIS: Alternative Markierungsverfahren verwendet werden.
   2. Nach jedem Fach mit Saatgut und dessen Etikett gefüllt ist, verschließen Sie das Fach sofort mit der Klebepistole Hochtemperatur. Gehen Sie, bis das gesamte Saatgut Streifen vollständig abgedichtet ist. Beschriften Gesamtband in der ersten Kammer mit replizieren, Block und / oder Behandlungsinformationen.
      HINWEIS: Für unsere Studie, da wir zeitlich Umzüge hatten, Blöcke und replizieren Streifen innerhalb der Blöcke, enthalten wir alle diese Informationen.
   3. Prüfen Sie, ob Lücken zwischen den Kammern und Spot Kleber nach Bedarf, bevor zum nächsten Streifen übergeht.

Abbildung 1. Burial schematische Samenstreifen. Beispiel Grabstreifen , die Quertyperkennung für einzelne Fächer. Maternal Eltern zuerst genannt mit dem väterlichen Eltern zweiten aufgeführt. Farben zeigen verschiedene mütterliche Abstammung,mit gelb für wild, blau für F ₁ Hybrid und Rot für Ernte. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. von Bury Seed-Streifen auf dem Gebiet

1. Dig Plots auf die angegebene Tiefe zu Haus Streifen. Ordnen Sie Streifen zu einzelnen Blöcken, in denen Streifen zufällig angeordnet sind, zum Entfernen Datum zu ermöglichen, wie der Haupthandlung und Fach Identität (in diesem Beispiel Cross-Typ) als subplot in der Analyse verwendet werden soll.
2. Abdeckleisten mit Erde. Cut Metallgewebe Metallgewebe 10 cm größer als Plots und Ort über begraben Streifen zu sein. Verwenden Sie U-Pins zu sichern Kanten und Abdeckung Tuch Kanten mit Erde.
   HINWEIS: Diese Abdeckung ist für den Ausschluss Wühlen Samenprädatoren. Als weitere Option Mercer et al. ¹³ aufgebaut und Kisten mit Hardware-Tuch vergraben, die die Samenstreifen aufgrund des intensiven Gopher Druck in ihrem Bereich loca umgebention.)
3. Legen Sie farbige Vermessungs Flaggen Streifen Lage und Entfernung zu unterscheiden Daten klare schriftliche Aufzeichnungen zu ergänzen.

4. Excavate Strips und Seed Bewerten

1. Dig Samenstreifen zugeordnet zu einer bestimmten Entfernung Datum. Pflegen Sie die Streifen in einem kühlen feuchten Umgebung, bis sie das Labor, in dem Samen Auswertung stattfinden wird erreichen. Dies kann durch Wickeln der Streifen in nassen Zeitung erreicht werden und sie in einem Kühler für den Transport oder Versand über Nacht platziert.
2. Spülen Sie Schlamm und Boden aus dem Streifen in Wasser, bis Streifen wird nicht dunkel Samen sauber genug, dass äußere Ablagerungen sind.
3. Mit einer Schere öffnen ein Fach zu einer Zeit, zu schneiden. Graf gekeimten Samen und entfernen. Graf klar toten Samen (zB Fäulnis oder verfaulten Samen). Legen Sie nicht gekeimten Samen auf markierten, nasse Petri-Größe Löschpapier weiter ungekeimter, ruhend, und toten Samen unterscheiden.
   1. Legen Sie Petrischalen mit gekeimtenSamen in einer Wachstumskammer für Normalkeimbedingungen: 25 ° C / 10 ° C 12 Stunden Tag / Nacht. Lassen Samen einer Woche keimen. Alle, die zu tun, diese als tragfähige zählen, aber nicht gekeimten, da sie nicht keimen unter Feldbedingungen.
4. Nach der Wachstumskammer Behandlung verbleibenden Test nicht gekeimten Samen für die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Tetrazolium Chlorid (TZ) ^13. Um dies zu erreichen, eine prozentuale Lösung von TZ geeignet für die Studie Spezies mit dem AOSA Tetrazolium Testing Handbuch ¹⁴ bilden. Für dieses Beispiel wird eine 1% ige Lösung verwendet.
   1. Schneiden Sie die gekeimten Samen in der Mitte und legen Sie eine Hälfte waren der Embryo und Endosperm sichtbar sind in einer Petrischale mit genug TZ Lösung, um die Samen zu decken (Samen können schwimmen, das ist in Ordnung).
   2. Legen Sie TZ Petrischalen in einem Inkubator bei 30 ° C eingestellt und 3 Stunden warten. Hinweis: Höhere Temperaturen in einer schnelleren Reaktion führt, wenn gewünscht, aber overstaining ist ein Risiko.
5. Entfernen Petrischalen aus dem Inkubator und zu bewerten. Samen, die in ihre Embryonen rot gefärbt haben, sind keimfähig, während ungefärbte Samen tot sind. Wenden Sie sich an AOSA Tetrazolium Testing Handbuch für weitere Einzelheiten über Scheidungsgrenzfällen und bestimmten Arten.

Results

Kreuz - Typen mit unterschiedlichen mütterlichen Abstammungs und Ernte - Allels Prozentsatz (Tabelle 1) unterschied sich über die Entfernung Daten in Prozent gekeimt, gekeimten und toten Samen (Abb. 2 und 3). Mit TZ Prüfung von gekeimten Samen, fanden wir einige wirklich ruhenden Samen in der zweiten Entfernung (Frühjahr) (Tabelle 2), während alle durch die dritte Entfernung nicht gekeimten Samen (Feder) gefunden wurden ...

Discussion

Hier präsentieren wir Methoden für die Verwendung von Saatgut Grabstreifen Keimung der Samen, Dormanz und Sterblichkeit von verschiedenen Saatgutvorräte zu vorgewählten Zeitperioden auf dem Gebiet zu beobachten. Die Vorteile der Verwendung von Streifen eher als einzelne Pakete liegen in (1) die Geschwindigkeit des Bandes und Fach Konstruktion über die Schöpfung der einzelnen Pakete; und (2) die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Entfernens von mehreren Fächern in einer Bewegung ohne die Gefahr eines Pakets Weglassen o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kleine Münzumschläge	Alle Große
Münzumschläge	Alle
feinmaschigen Moskitonetze aus Polyester	Alle
Hochtemperatur-Klebepistolen	Alle
Hochtemperatur-Klebestift-Nachfüllungen	Alle
Industrie-Dauermarkierer	Alle
Gartenetiketten aus Kunststoff	Jede
Schere	Jede
Metallgeflecht Hartes
Landvermessungsflaggen, mehrere Farben	Alle
Nasse Zeitung	Alle
Kühler	Alle
Löschpapier	Alle
Petrischalen	Alle
Temperaturgesteuerten Wachstumskammern	Alle
Rasierklingen	Alle
Petrischalen	Alle
Wasser	Jegliche
Hitze Inkubator	Beliebig