Verfahren zum Messen von RNA N 6 -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

Zusammenfassung

Modifiziertes Northern - Blotting - Verfahren für N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ A) Änderungen in RNA Messung beschrieben. Die aktuelle Methode können Änderungen in diversen RNAs und Kontrollen unter verschiedenen experimentellen Designs erkennen.

Zusammenfassung

N 6-Methyladenosin (m⁶A) Modifikationen der RNA sind vielfältig und bei Eukaryoten allgegenwärtig. Sie kommen in mRNA, rRNA, tRNA und microRNA vor. Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese reversiblen RNA-Modifikationen das Spleißen, die Translation, den Abbau und die Lokalisierung der RNA beeinflussen. Mehrere physiologische Prozesse wie zirkadiane Rhythmen, Pluripotenz von Stammzellen, Fibrose, Triglyceridstoffwechsel und Fettleibigkeit werden ebenfalls durch m⁶A-Modifikationen gesteuert. Immunpräzipitation/Sequenzierung, Massenspektrometrie und modifiziertes Northern Blot sind einige der Methoden, die üblicherweise zur Messung von m⁶A-Modifikationen eingesetzt werden. Im Folgenden stellen wir eine nordöstliche Blotting-Technik zur Messung von m⁶A-Modifikationen vor. Das derzeitige Protokoll bietet eine gute Größentrennung der RNA, eine bessere Anpassung und Standardisierung für verschiedene experimentelle Designs und eine klare Abgrenzung von m⁶A-Modifikationen in verschiedenen RNA-Quellen. Während bekannt ist, dass m⁶A-Modifikationen einen entscheidenden Einfluss auf die menschliche Physiologie in Bezug auf zirkadiane Rhythmen und Fettleibigkeit haben, sind ihre Rollen in anderen (patho)physiologischen Zuständen unklar. Untersuchungen zu m⁶A-Modifikationen haben daher ein immenses Potenzial, wichtige Einblicke in die molekulare Physiologie zu liefern.

Einleitung

Dynamische und reversible RNA-Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der RNA-Homöostase. Vor vier Jahrzehnten wurde festgestellt, dass N 6-Methyladenosin (m⁶A)-Modifikationen in eukaryotischen Transkriptomen reichlich vorhanden sind¹. Sie haben vielfältige Funktionen in der Boten-RNA (mRNA), der ribosomalen RNA (rRNA), der kleinen nukleolären RNA, der Transfer-RNA und der microRNA². Die m⁶A-Modifikationen der mRNA beeinflussen ihr Spleißen³, die Translation⁴, den Abbau⁵ und die Lokalisation². Darüber hinaus beeinflussen sie die Biogenese der Ribosomen und die microRNA-Funktion⁶. Die evolutionäre Konservierung von m⁶A-Modifikationen der RNA wird bei einzelligen Bakterien bis hin zu mehrzelligen Menschen beobachtet⁷. Die Abgrenzung der Rollen von m⁶A Modifikationen wird derzeit umfassend untersucht. Es wird erwartet, dass die Bemühungen neue Erkenntnisse zur Transkriptionskontrolle liefern. Neuere Studien zeigen, dass auch andere chemische Modifikationen von mRNA⁸ eine entscheidende Rolle im RNA-Metabolismus spielen.

Zirkadiane Rhythmen⁹, Stammzell-Pluripotenz¹⁰, Triglyceridstoffwechsel⁴, Fibrose¹¹, Fettleibigkeit¹² und schwere Depression¹³ sind einige Beispiele für Prozesse, bei denen m⁶A-Modifikationen bekannt sind, um die Ergebnisse zu kontrollieren. Viele Gentranskripte der zirkadianen Uhr haben m⁶A-Stellen¹⁴. Die Modulation von m⁶Eine Methylase oder Demethylase führt zu Veränderungen der zirkadianen Periode¹⁵. Mettl3, eine m⁶A Transferase, ist ein Regulator für die Pluripotenz von Stammzellen. Ein Mangel an Mettl3 führt zu einer frühen embryonalen Letalität und einem aberranten Lineage-Priming im Postimplantationsstadium¹⁰. Ein Mangel an Fettmasse- und Adipositas-assoziierter (FTO), einer m⁶A-Demethylase, in Adipozyten beeinflusst die Fettsäuremobilisierung und das Körpergewicht durch posttranskriptionelle Regulation von Angptl4⁴. Diese Studien zeigen, dass m⁶A nicht nur die mRNA-Prozessierung steuert, sondern auch eine entscheidende Rolle in der embryologischen Entwicklung und Pathophysiologie spielt. Die Funktion der m⁶A-Modifikationen hat Auswirkungen auf therapeutische Überlegungen in der Zukunft.

Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um m⁶A-Modifikationen von RNA^16-18 zu messen. Traditionell werden die Dünnschichtchromatographie (DC) und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt, um die Verteilung von m⁶A in mehreren RNAs zu untersuchen^19,20. Die Massenspektrometrie ist ein empfindliches Werkzeug für den Nachweis von m⁶A-Modifikationen in RNA. Die RNA muss jedoch vor der Analyse mittels Massenspektrometrie durch RNase in kurze Fragmente herausgeschnitten^{werden 21}. Die Methyl-RNA-Immunpräzipitation und -Sequenzierung (m⁶A-Seq)²² immunpräzipitiert fragmentierte RNAs mit m⁶A-spezifischen Antikörpern und führt eine parallele RNA-Sequenzierung durch. Diese Methode erzeugt transkriptomweite m⁶A-Landschaften. Die hochauflösende Kartierung der Vernetzung und Immunpräzipitation von m⁶A mit individueller Nukleotidauflösung (miCLIP) bildet ferner m⁶A-Modifikationen mit einer Einzelnukleotidauflösung^{ab 23}. Beide Methoden liefern Details zur m⁶A-Modifikation über das gesamte Transkriptom mit Informationen über spezifische Gene. Quantifizierungen und Standardisierungen in beiden Methoden sind jedoch schwierig, wenn Experimente den Vergleich mehrerer Bedingungen erfordern. Darüber hinaus verändern Fragmentierungen der RNA für m⁶A-Seq die ursprüngliche RNA-Struktur, was sich auf die nativen m⁶A-Spiegel auswirken kann. Um globale m⁶A-Modifikationen von RNA und deren Veränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu detektieren, berichten wir über eine Methode, die ein modifiziertes Northern-Blotting-Protokoll verwendet. Bei dieser Methode wird RNA anhand des Molekulargewichts unter Verwendung der Gelelektrophorese¹⁸ aufgelöst. Dieses Verfahren bietet eine bessere Standardisierung und Quantifizierung für Experimente, die mehrere Bedingungen oder Stichproben umfassen. Es liefert auch spezifische m⁶A-Modifikationsinformationen für verschiedene RNAs, ob rRNA, mRNA oder microRNA.

Protokoll

HINWEIS: Die Gesamt - RNA m ⁶ A Ebene umfasst rRNA, mRNA, und andere kleine RNAs. Da ribosomale RNA hat reichlich m ⁶ A Änderungen, müssen die Messung von m ⁶ A - Levels , diese Tatsache zu berücksichtigen.

1. RNA-Isolierung

1. Mit Hilfe der Ribonuklease Dekontaminationslösung (gesprüht auf Papiertücher), reinigen Sie die Pipetten und Labortisch Oberflächen. Nasse Papiertücher mit Nuklease-freies Wasser und wischen Sie Pipetten und Labortisch taucht wieder auf.
2. RNA-Extraktion
   1. Gesamt-RNA-Isolation
      1. Mit einem Overhead - Rührer, homogenisieren 50-100 mg Gewebe oder 5-10 x 10 ⁶ Zellen in 1 ml RNA Isolationslösung bei 4 ° C gehalten.
         HINWEIS: Weitere Gewebe (100-150 mg) für Fettgewebe Proben von Mäusen erforderlich wegen der niedrigeren RNA-Konzentrationen darin. Proben aus Mäuse Herz, Leber, Skelettmuskel, Lunge, Gehirn stammen und Makrophagen zuvor ⁴ eingesetzt wurden.
      2. Imcubate die Probe Homogenate für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Füge 100 & mgr; l 1-Brom-3-chlorpropan (BCP) pro 1 ml Probe Homogenat. Schütteln der Röhrchen kräftig für 15 s und verfahren Gesamt - RNA zu isolieren , gemäß den Anweisungen des Herstellers ^24.
   2. Die polyadenylierte mRNA Purification von isolierten Gesamt-RNA
      1. Reinige polyadenylierte mRNA unter Verwendung von erhältlichen Kits oder Protokolle.
         1. Schütteln gründlich resuspendieren jeder der folgenden Lösungen: 2x Bindungslösung, Oligo (dT) Polystyrol-Kügelchen und Waschlösung. Sicherzustellen, dass das Oligo (dT) -Kügelchen erwärme auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch.
         2. Übertragung von 120 & mgr; l Elutionslösung pro Zubereitung in ein Rohr und Wärme auf 70 ° C in einem Heizblock.
         3. Pipette bis zu 500 ug Gesamt-RNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mit nukleasefreiem Wasser, stellen Sie die Lautstärke auf 250 & mgr; l.
         4. In 250 ul 2x Bindungslösung auf die Gesamt-RNA solution und Wirbel kurz den Inhalt zu mischen.
         5. In 15 ul Oligo (dT) Perlen und Wirbel gründlich zu mischen.
         6. Inkubieren der Mischung bei 70 ° C für 3 min.
         7. Entfernen Sie die Probe aus dem Heizblock und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.
         8. Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min.
         9. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, hinter etwa 50 & mgr; l zu verlassen.
         10. In 500 ul Waschlösung zum Resuspendieren des Pellets durch Pipettieren.
         11. Pipette, um die Suspension in einen Spinfilter / Sammelrohr-Set.
         12. Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min. Entfernen Sie die Säule aus Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Durchfluss. Bringen Sie die Spalte an die Sammelröhrchen.
         13. Pipette 500 ul Waschlösung auf den Spinfilter.
         14. Zentrifuge bei 15.000 x g für 2 min.
         15. Übertragen Sie die Spinfilter in ein frisches Sammelröhrchen.
         16. Pipettieren von 50 & mgr; l Elutionslösung erhitztbis 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters.
         17. Inkubieren für 2-5 min bei 70 ° C. Zentrifuge bei 15.000 × g für 1 min.
         18. Pipettieren zusätzlich 50 & mgr; l Elutionslösung auf 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters.
         19. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2.1.18.
      2. Je 100 & mgr; g / mL Glykogen, 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumina absolutem Ethanol. Man fällt über Nacht bei -80 ° C.
      3. Zentrifuge bei 15.000 xg für 25 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
      4. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Sie vorsichtig das Ethanol zu entfernen.
      5. Trockene Luft für 3-5 min.
      6. Fügen Sie 10 ul Nuklease-freies Wasser, um das Pellet aufzulösen.
      7. Lagern Sie bei -70 ° C.
3. RNA Qualifizierung und Quantifizierung
   1. Verwendung eines Spektrophotometers, bestimmen die RNA-Konzentration durch NotIng der Absorption bei 260 nm und 280 nm. Die A ₂₆₀ / A ₂₈₀ Verhältnis sollte 1,8-2,2 sein.
   2. Schauen Sie sich die RNA - Probe Qualität unter Verwendung von 0,8% Agarose - Gelelektrophorese ^25.
      HINWEIS: Die intakte eukaryotischen Gesamt-RNA intensiv 28S und 18S rRNA-Banden zeigen. Das Verhältnis von 28S rRNA 18S gegen Bandenintensität für eine gute RNA-Präparation ist ~ 2.

2. Gel-Elektrophorese und Übertragung

HINWEIS: Die Puffervorbereitungsprotokollen sind in Tabelle 1.

1. Formaldehyd-Gel-Vorbereitung (1%)
   1. Spülen Sie alle Elektrophoreseapparaturen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser.
   2. Schmelze 2,5 g Agarose in 215 ml DEPC Wasser vollständig in einem Mikrowellenofen.
   3. Hinzufügen 12,5 ml 10x 3- (N- Morpholino) propansulfonsäure (MOPS) -Puffer und 22,5 ml 37% Formaldehyd.
   4. Gießen Sie es in die Elektrophorese-Gerät mit einer 1,5 mm dicken Kamm.
   5. Beseitigen Sie Blasen oder Push them zu den Kanten des Gels mit einem sauberen comb.
   6. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen.
2. Probenvorbereitung
   1. Mischen 1-10 ug Gesamt-RNA und 11,3 & mgr; l Probenpuffer.
   2. Mix 2 ug der RNA-Marker (1 & mgr; g / & mgr; l) mit 11,3 & mgr; l des Probenpuffers.
   3. In nukleasefreiem Wasser zu den Proben von 2.2.1 und 2.2.2 bis zu einem Gesamtvolumen von 16 & mgr; l.
   4. Hitze bei 60 ° C für 5 min, und dann auf Eis kühlen.
   5. Mischungs 16 & mgr; l der Probe aus 2.2.3 mit 4 ul Tracking-Farbstoff, welche 0,1 & mgr; g enthält / & mgr; l Ethidiumbromid auf Eis.
      ACHTUNG: Ethidiumbromid ist möglicherweise teratogen und giftig beim Einatmen. Lesen Sie Ethidiumbromid Sicherheitsdatenblatt.
3. Elektrophorese
   1. In 200 ml 10x MOPS bis 1.800 ml ddH ₂ O - Puffer mit einem 1x MOPS Laufpuffer zu machen.
   2. Verwenden Sie die 1x MOPS Laufpuffer die Vertiefungen des Gels zu spülen.
   3. Pre-run ter Gel bei 20 V für 5 min.
   4. Laden die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels.
   5. Mit Folie abdecken Lichtexposition zu vermeiden. Führen Sie bei 35 V für etwa 17 Stunden (über Nacht)
   6. Untersuchen und fotografieren Sie das Gel unter UV-Licht.
4. Übertragung
   1. Schneiden Sie das Gel den ungenutzten Teil zu entfernen.
   2. Bereiten 500 ml 10x SSC-Puffer (250 ml 20x SSC-Puffer und 250 ml DEPC-Wasser).
   3. Waschen Sie das Gel zweimal mit 10x SSC-Puffer für 20 min mit 50 Umdrehungen pro Minute schütteln.
   4. Cut 1 Filterpapierblatt groß genug , um als Docht Papier zu dienen, die Transferpuffer aus der Übertragungsschale (Abbildung 1) aufnimmt.
   5. Schneiden 4 Stück Filterpapier der gleichen Größe wie das Gel.
   6. Geschnitten 1 Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel.
   7. Markieren eine Kerbe auf dem Gel und die Membran als eine Markierung, um die richtige Ausrichtung zu gewährleisten.
   8. Einweichen der Membran in 2 × SSC-Puffer für 15 min.
   9. Gießen Sie 500 ml of 10x SSC-Puffer in die Transferschale.
   10. Legen Sie das große Filterpapierbogen über der Glasplatte und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer.
   11. Ausrollen alle Blasen mit einer Pipette.
   12. Soak 2 Stück vorgeschnittene Filterpapier in Transferpuffer und legen sie auf die Mitte des Filterpapiers aus Schritt 2.4.5. Entfernen Sie alle Blasen.
   13. Legen Sie das Gel von oben nach unten auf dem Filterpapier.
   14. Legen Sie die Membran auf der Oberseite des Gels. Ausrichten der Kerben des Gels und der Membran.
   15. Platz 2 Stücke von vorgeschnittenen Filterpapier auf der Oberseite der Membran und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer.
   16. Entfernen Sie alle Blasen zwischen den Schichten.
   17. Tragen Sie Plastikfolie um das Gel, um sicherzustellen, dass die Handtücher genießen nur Puffer durch das Gel vorbei und die Membran.
   18. Stapeln Sie die Papiertücher auf dem Filterpapier.
   19. Legen Sie eine überdimensionale Glasplatte auf der Oberseite der Handtücher.
   20. Legen Sie ein Gewicht auf der Oberseite des Stapels.
   21. Halten über Nacht die RNA zu ermöglichen, aus dem Gel auf die Membran zu übertragen.

3. Nachweis von N ⁶ -methyladenosine

1. Membran-Crosslinking
   1. Halten Sie die Membran feucht in 2x SSC-Puffer.
   2. Platz 2 Blätter Filterpapier eingetaucht mit 10x SSC-Puffer in den UV-Vernetzer.
   3. Platzieren Sie die Membran auf der Oberseite des Filterpapiers, mit dem RNA-adsorbierten Seite nach oben.
   4. Wählen Sie "autocrosslink Modus" (120.000 & mgr; J) und drücken Sie die Schaltfläche "Start" die Bestrahlung zu initiieren.
   5. Untersuche die Membran und das Gel mit einem UV Gelbild Fängers die RNA-Transfer von dem Gel auf die Membran zu bestätigen.
2. Immunoblotting
   1. Blockieren die Membran in 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) Puffer bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
   2. Waschen dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
   3. Inkubieren Sie die Membran über Nacht in m ⁶ A ( N ⁶ -methyladenosine) Antikörperlösung (1: 1000 in 5% fettfreier Milch TBST - Puffer) bei 4 ° C.
   4. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
   5. Inkubieren der Membran in dem HRP-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung (1: 2000 in 5% fettfreier Milch TBST-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur.
   6. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
   7. Wenden Sie den verstärkten chemolumineszenten Substrat (0,125 ml pro cm ² Membran).
   8. Erfassen die Chemilumineszenz mit den optimalen Einstellungen des Digital Imager nach den Anweisungen des Herstellers ^26.
3. m ⁶ A Quantifizierung
   1. Messen Sie die relative m ⁶ A Chemilumineszenzintensität mit der ImageJ Software.
      1. Unter dem ImageJ Software Wählen Sie im Menü "Datei" Option, um die zugehörigen Datei zu öffnen.
      2. Wählen Sie das "Rechteck" Werkzeug aus ImageJ und einen Rahmen ziehen umdie Signale.
      3. Wenn ribosomale RNA nicht im Mittelpunkt der Experimente ist, vermeiden Sie die 18S und 28S ribosomale RNA m ⁶ A Bänder für die Berechnung.
      4. Klicken Sie auf "Befehl" und "1" die gewählte Spur zu bestätigen.
      5. Drücken Sie die "Command" und "3" das ausgewählte Grundstück zu zeigen.
      6. Klicken Sie auf den "Straight" Werkzeug und Linien zeichnen den segmentierten Bereich zu trennen.
      7. Klicken Sie auf die "Wand" Werkzeug, um die Messungen aufzuzeichnen.
      8. Exportieren Sie die Daten.
      9. Normalisieren die Niveaus von m ⁶ A mit der 18S ribosomale RNA - Bande aus dem Ethidiumbromidfärbung.

Ergebnisse

Nach 14 Tagen im normalen Licht-Dunkel-zirkadianen Phase, die Wildtyp-Mäuse wurden in konstanter Dunkelheit platziert. Die RNAs aus der Leber wurden bei 4 Stunden Intervallen abgetastet und mit modifiziertem Northern-Blotting untersucht. Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleine RNAs wurden eindeutig nachgewiesen (Figur 2). Der Vergleich zwischen den verschiedenen Tageszeiten (CT) kann genau mit der 18S rRNA-Standard berechnet werden. Es gab robuste zirkadiane Oszillation von m ⁶ A - Spiegel in rRNA, mRNA und kleinen RNAs.

Um die Störungen zu vermeiden, indem rRNA dargebotene kann polyadenylierte RNA gereinigt werden, wie es in Schritt 1.2.2. Nach der Reinigung kann die rRNA weitgehend eliminiert zur besseren Visualisierung der anderen RNAs (Figur 3) zu ermöglichen.

g> Abbildung 1: Die Blot-Transfereinheit zusammenbauen. Die kapillare Übertragungseinheit für die RNA an die Membran-Blotting gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Circadian Rhythmus der m ⁶ A - Spiegel in C57BL / 6J - Mäusen. Diese Abbildung zeigt die m ⁶ A - Blot von Gesamt - RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen am ersten Tag des Dunkeldunkelphase nach 14 Tagen einer normalen Hell-Dunkel - Phase bei 4 h Intervallen geopfert. Die Quantifizierung wurde mit der m getan ⁶ A Bilddichteunterschied zwischen 18S und 28S rRNA. Die m ⁶ A Fluss wurde am Boden mit dem 18S - rRNA - Band aus dem Formaldehyd - Gel normalisiert.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Die m ⁶ A Blots mit oder ohne rRNA. Representative m ⁶ A - Blots von Gesamt - RNA und polyadenylierte RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.

1	10x MOPS-Puffer (pH 7,0, vor Licht schützen)
	MOPS			41,85	G	0,2 M
	Natriumacetat			4.1	G	0,05 M
	EDTA, Dinatriumsalz			3.7	G	0,01 M
	DEPC Wasser
	Gesamt			1	L
	Rühre bei Raumtemperatur
2	20x SSC-Puffer (pH 7,0)
	Kochsalz			175,3	G	3 M
	Trinatriumcitrat			88.3	G	0,3 M
	DEPC Wasser
	Gesamt			1	L
	Rühre bei Raumtemperatur, dann autoklaviert
3	Tracking-Dye
	10x MOPS-Puffer			500	ul	1x
	Ficoll 400			0,75	G	15%
	Bromphenolblau			0,01	G	0,2%
	Xylencyanol			0,01	G	0,2%
	DEPC Wasser
	Gesamt			5	ml
	Lagerung bei -20 ° C
4	DEPC Wasser
	Verdünnen Verhältnis bei 1: 1000 von DEPC in ddH 2 O
	Rühre über Nacht bei Raumtemperatur, dann autoklaviert
5	Probenpuffer (vor Licht schützen)
	10x MOPS-Puffer			200	ul
	37% Formaldehyd			270	ul
	Formamid			660	ul
	Lagerung bei -20 ° C

Diskussion

Modifikationen der RNA spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Funktion und Physiologie. Das derzeitige Verständnis der Regulation, Funktion und Homöostase dieser Modifikationen wird noch erforscht und erweitert⁸. Daher ist eine präzise und goldstandardmäßige Methode zur Bewertung der Modifikationen von RNA erforderlich. Die modifizierte Northern-Blotting-Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der RNA-Modifikationen und eine klare Abgrenzung der Modifikationen in verschiedenen RNAs. Obwohl die Methode mindestens 3 Tage benötigt, kann sie standardisiert und in verschiedenen Versuchsdesigns eingesetzt werden. Darüber hinaus kann es mit verschiedenen Antikörpern unterschiedliche RNA-Modifikationen nachweisen²⁷.

Bei der Analyse von RNA-Modifikationen ist es wichtig, verschiedene RNAs zu trennen. Die ribosomale RNA macht einen großen Teil der Gesamtmenge an RNA^{aus 28,29}. Die Ergebnisse der Analyse von RNA-Modifikationen nur in der Gesamt-RNA repräsentieren hauptsächlich die Veränderungen der rRNA. Methylierung und andere derartige Modifikationen von rRNA könnten möglicherweise die Veränderungen in anderen RNAs maskieren. Mit dem Verfahren der Geltrennung können die Modifikationen von mRNA und anderen kleinen RNAs genauer analysiert werden.

Die transkriptomweite Kartierung mit m⁶A, Immunpräzipitation und Sequenzierung bietet einen detaillierten Einblick in die Modifikation jedes RNA-22-Typs. Es liefert Informationen über die spezifischen RNAs und eine Auflösung von etwa 80-120 bp. Obwohl m⁶A-Seq die Modifikationen zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen vergleichen kann, ist die Auswahl geeigneter Standards und Kontrollen für solche Experimente schwierig¹⁸. Die Immunpräzipitation ist schwer zu reproduzieren und führt oft zu erheblichen Schwankungen zwischen den Wiederholungen. Darüber hinaus erfordert m⁶A-Seq die Fragmentierung von RNA-Proben vor der Immunpräzipitation und Sequenzierung³⁰. Der Fragmentierungsprozess könnte möglicherweise zu unangemessenen Einflüssen auf die ursprünglichen RNA-Modifikationen führen. Wenn das Experiment nicht die spezifischen Geninformationen benötigt, sondern andere Vergleichsbedingungen erfordert, bietet die aktuelle Methode eine bessere Visualisierung und Kontrolle für verschiedene Versuchsaufbauten.

Die Modifikation der RNA ist ein wichtiger Schritt bei der Regulierung der transkriptionellen Kontrolle³¹. Die Homöostase und die Regulationsmechanismen verschiedener RNA-Modifikationen in verschiedenen physiologischen Bereichen sind jedoch noch unklar. Mit der vorliegenden modifizierten Northern-Blotting-Methode können verschiedene RNA-Modifikationen quantifiziert und verglichen werden. Darüber hinaus können die Veränderungen und Regulationsmechanismen von RNA-Modifikationen genauer untersucht werden. In Zukunft könnte es auch möglich sein, die experimentellen Daten sowohl aus dem klassischen Northern-Blotting-Protokoll als auch aus den modifizierten Northern-Blotting-Protokollen zu kombinieren und so bessere Einblicke in die RNA-Biologie zu erhalten.

Der wichtigste Faktor, der über den Erfolg des modifizierten Northern-Blotting-Protokolls entscheidet, ist die Integrität der RNA-Probe. RNAs mit einem gewissen Grad an Abbau können gute klassische Northern-Blotting-Ergebnisse liefern, aber dies könnte möglicherweise einen signifikanten Einfluss auf die modifizierten Northern-Blotting-Ergebnisse haben. Auch die Modifikationen der RNA in verschiedenen Geweben oder Zelllinien können sehr unterschiedlich sein. Es ist wichtig, die geeigneten RNA-Probenladungen für verschiedene Gewebe zu testen, bevor die endgültigen Experimente durchgeführt werden.

Da Blotting-Verfahren traditionell nach Dr. Southern und verschiedenen geografischen Richtungen benannt wurden, schlagen wir für die aktuelle Technik den Namen "Northeastern" Blotting vor.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RNaseZap-Lösung	Ambion	AM9782	Protokoll 1.1
TRI-Reagenzlösung	Ambion	AM9738	Protokoll 1.2.1.1
1-Brom-3-chlorpropan (BCP)	Sigma	B9673	Protokoll 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protokoll 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protokoll 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protokoll 1.2.2.1
Glykogen	Ambion	AM9510	Protokoll 1.2.2.2
Natriumacetat	Fluka	71183	Protokoll 1.2.2.2
Nukleasefreies Wasser	Ambion	AM9930	Protokoll 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protokoll 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protokoll 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protokoll 2.1.3
37% Formaldehydlösung	Sigma	F8775	Protokoll 2.1.3
EDTA, Dinatriumsalz	JT Baker	8993	Protokoll 2.1.3 10x MOPS Puffer
Formamid	Sigma	F7503	Protokoll 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protokoll 2.2.2
Ethidiumbromid	Amresco	X328	Protokoll 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff
Bromphenolblau	Sigma	114391	Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff
Xylol Cyanol FF	Sigma	X4126	Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff
Natriumchlorid-Dihydrat	JT Baker	3624	Protokoll 2.4.2 20x SSC-Puffer
Trinatriumcitrat	Sigma	S1804	Protokoll 2.4.2 20x SSC-Puffer
Hybond Löschpapier	GE Healthcare	RPN6101M	Protokoll 2.4.4
GE Hybond-N+ Membran	GE Healthcare	RPN303B	Protokoll 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protokoll 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protokoll 3.1.5
Anti-m6A (N6-Methyladenosin)	Synaptische Systeme	202003	Protokoll 3.2.3
Amersham ECL Anti-Kaninchen IgG, HRP-gebunden gesamt Ab	GE Healthcare	NA934	Protokoll 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protokoll 3.2.8