Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des Dynamin-ähnlichen GTPase MxA-Proteins aus Lysaten menschlicher Zellen unter Verwendung einer Kombination aus nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse.

Abstract

Die Bildung oligomerer Komplexe ist eine entscheidende Voraussetzung für die korrekte Struktur und Funktion vieler Proteine. Das Interferon-induzierte antivirale Effektorprotein MxA übt eine breite antivirale Aktivität gegen viele Viren aus. MxA ist eine Dynamin-ähnliche GTPase und hat die Fähigkeit, oligomere Strukturen höherer Ordnung zu bilden. Ob jedoch eine Oligomerisierung von MxA für seine antivirale Aktivität erforderlich ist, ist umstritten. Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von endogen oder ektopisch exprimiertem MxA in der zytoplasmatischen Fraktion humaner Zelllinien mittels nicht-denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Kombination mit Western-Blot-Analyse. Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Auswahl der Detergenzien, um die Aggregation und/oder Ausfällung von Proteinen zu verhindern, die insbesondere mit Zellmembranen wie MxA assoziiert sind, ohne deren enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen. Ein weiterer entscheidender Aspekt des Protokolls ist der irreversible Schutz der freien Thiolgruppen von Cysteinresten durch Iodacetamid, um künstliche Wechselwirkungen des Proteins zu verhindern. Dieses Protokoll eignet sich für eine einfache Beurteilung des oligomeren Zustands von MxA und ermöglicht darüber hinaus eine direkte Korrelation der antiviralen Aktivität von MxA-Grenzflächenmutanten mit ihren jeweiligen oligomeren Zuständen.

Introduction

Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen ^1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der zuvor veröffentlichten nicht-denaturierende PAGE - Protokoll ^12. entweder mit Vero-Zellen überexprimieren MxA oder IFN-α-stimulierten A549-Zellen, die endogene MxA In dieser Studie wurde die oligomeren Zustand des MxA Proteins bewertet. Das Protokoll unten beschrieben können die oligomeren Zustand jedes Protein zusätzlich zu MxA zu analysieren. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich.

1. Herstellung der Zellen-Lysate für die nicht-denaturierende PAGE

HINWEIS: Für die Analyse wurden die oligomeren Zustand des menschlichen MxA Proteins entweder Vero od....

Results

Die Verwendung von nicht-denaturierende PAGE, analysierten wir die oligomere Zustand des menschlichen Wildtyp M · A, die dimeren Schnittstelle Mutanten M · A (R640A) und M · A (L617D) sowie die monomeren Schnittstelle Mutant M · A (M527D) aus Zelllysaten ^12. Zellen wurden in einem Puffer, der 1% Octylphenoxypolyethoxyethanol lysiert (NP-40) und Iodacetamid Protein Solubilisierung und zum Schutz der freien Thiolgruppen zu gewährleisten (siehe Abbildung 1). Wie zuvor beschrieben, Salz und klein.......

Discussion

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die in Säugetierzellen durch nicht-denaturierende PAGE, gefolgt von Western-Blot-Analyse ausgedrückt die schnelle Bestimmung des oligomeren Zustand von Proteinen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass die oligomeren Zustand eines bestimmten Proteins können ohne vorherige Proteinreinigung aus ganzen Zelllysaten bestimmt werden. Dies kann für Proteine ​​wichtig sein, die ihre Funktion in Verbindung mit Hilfsfaktoren oligomerisieren oder ausüben. Darüber hinaus si.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	In Dialysepuffer voräquilibrieren (wenn eine Glycerinentfernung gewünscht wird) Kann nach Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-Well,	Bio-Rad	456-1083	Vorlauf im laufenden Puffer zur Anpassung des Puffersystems
cOmplete, Mini, EDTA-frei	Roche	11836170001	verwenden 1 Tablette pro 50 ml
PBS, pH 7,4  Flasche a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S Lösung	Sigma-Aldrich	P7170	GIFTIG Tragen Sie Handschuhe und schützen Sie die
Augen NativeMark Ungefärbtes Protein Standard   50 & Mikro; l	Invitrogen	P/N 57030	Belastung 5 &Mikro; l/well
A549 Zellen	ATCC	ATCC CCL185	Wachsen in Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1)
Vero-Zellen	ATCC	ATCC CCL81	Wachsen in Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1)
Anti-Mx1-Antikörper	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Verwendung in einer Verdünnung von 1:1.000
ECL Anti-Kaninchen-IgG, Meerrettichperoxidase gebundener ganzer Antikörper (ab Esel)	GE-Healthcare	NA934V	Verwendung in einer Verdünnung von 1:10.000
0,5 % Trypsin-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Jodacetamid   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	Lager  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4,5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvat life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Stift  Streptokokken 100 x        100ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Schaft, 100 ml        life	technologies Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fötales Rinderserum, dialysiert, US-Herkunft 500 ml Gibco Los:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Zellulose-Filterpapier	Bio-Rad	1703965
PVDF-Blotting  Membran	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Biosolve	0020092391BS
Natriumfluorid (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
vollständig, Mini, EDTA-frei	von Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10%ige Lösung	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycin	Biosolve	0007132391BS
Natriumorthovanadat (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerin	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospat	Sigma Aldrich	G9422
Milchpulver	Migros/Schweiz
Methanol	Millipore	1.06009
Natriumclorid (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Amresco	288
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045